本发明涉及中医药检测技术领域，具体是粗毛玉叶金花的多成分含量测定方法。
背景技术：
粗毛玉叶金花mussaendahirsutulamiq.为攀援灌木，小枝密被锈色或灰色柔毛。叶对生，膜质，椭圆形或近卵形，长3～7cm，宽2～3cm，顶端短尖或渐尖，基部楔形，两面被稀疏的柔毛，下面及脉上毛较密。产于海南、广东、湖南、贵州和云南。生于海拔340m处的山谷、溪边和旷野灌丛中，常攀援于林中树冠上。该种根、叶可入药，可清热、解毒、抗疟。全株可清热、疏风。粗毛玉叶金花药材为茜草科玉叶金花属植物粗毛玉叶金花的干燥根、茎。
粗毛玉叶金花中的化学成分种类与玉叶金花相似，但是以有机酸成分为主，环烯醚萜苷类成分含量较低。对于粗毛玉叶金花，现行标准中只有理化鉴别，其他成药中也仅见薄层鉴别，尚未见关于其含量测定的相关报道；从玉叶金花建立的9种成分测定方法来看，同时使用有机酸成分和环烯醚萜苷类成分9种对照品成本过高，耗时较长，因此，需建立一种针对粗毛玉叶金花的含量测定方法。
技术实现要素：
基于此，本发明提供了一种粗毛玉叶金花的多成分含量测定方法，采用一测多评法，建立了一种同时测定粗毛玉叶金花中6种有机酸类成分新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸、3,4-o-二咖啡酰基奎宁酸、4,5-o-二咖啡酰基奎宁酸的方法。
为实现上述技术目的，具体内容如下：
（1）色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相a，以0.1%磷酸为流动相b，按表1进行梯度洗脱；进样量10μl，柱温35℃，流速1.0ml/min，检测波长328nm；
表1粗毛玉叶金花梯度洗脱表
（2）提取样品：取样品粉末（过四号筛）约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇20ml，称定重量，超声处理（功率320w，频率40khz）30min，取出，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取滤液，即得；
（3）制备新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、3,4-o-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸、4,5-o-二咖啡酰基奎宁酸对照品储备液；
（4）用上述6种对照品储备液制备不同线性浓度的4种混合对照品溶液；
（5）线性考察：将上述6种对照品储备液按（1）中色谱条件进样10μl、4种对照品混合溶液分别进样10μl，分别作为线性浓度从高到低的5个点，以对照品的进样量（ng）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；
（6）精密度试验：取同一份供试品溶液，按（1）中色谱条件，连续测定6次；
（7）重现性试验：取同一批供试品粉末约0.5g，精密称定，按（2）中提取方法提取并平行测定6份；
（8）准确度试验：取同一批供试品粉末约0.25g，精密称定，共12份，按精密度结果计算出来的9种成分的含量分别加入三个水平（50%、100%、150%）的对照品量，按（2）中提取方法提取并平行测定；
（9）耐用性试验：分别采用不同品牌的色谱柱测定样品中6种有机酸类成分的含量；
（10）检测限与定量限：当信噪比为3时，测得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、3,4-o-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸、4,5-o-二咖啡酰基奎宁酸的检测限分别为1.165、0.973、1.088、0.945、0.994和1.315ng；当信噪比为10时，测得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、3,4-o-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸、4,5-o-二咖啡酰基奎宁酸的定量限分别为3.882、3.243、3.628、3.149、3.312和4.383ng；
（11）以绿原酸为内标，对其有机酸类成分使用一测多评的方法进行测定，通过考察不同品牌的仪器、柱子、不同流动相比例等，以绿原酸为内参物，建立5种成分的相对校正因子（fk/s），计算各成分的量。
本发明的有益效果是：
本发明建立了一种一测多评法（qmsa法）同时测定粗毛玉叶金花中6种有机酸类成分新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸、3,4-o-二咖啡酰基奎宁酸、4,5-o-二咖啡酰基奎宁酸的方法，该方法选择粗毛玉叶金花的有机酸类成分为指标进行含量测定，精密度高、重现性好、稳定性好、回收率高、测定结果准确，可有效控制粗毛玉叶金花的质量。本发明完善了粗毛玉叶金花的质量检测标准，为粗毛玉叶金花质量标准的建立奠定了基础。
具体实施方式
为了更加详细的介绍本发明，下面结合实施例，对本发明做进一步说明。
实施例，内容如下：
（1）色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相a，以0.1%磷酸为流动相b，按表1进行梯度洗脱；进样量10μl，柱温35℃，流速1.0ml/min，检测波长328nm。
表1粗毛玉叶金花梯度洗脱表
（2）提取样品：取样品粉末（过四号筛）约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇20ml，称定重量，超声处理（功率320w，频率40khz）30min，取出，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取滤液，即得。
（3）6种对照品储备液的制备：
新绿原酸（5-咖啡酰基奎宁酸）——精密称取新绿原酸对照品9.52mg（成都曼思特生物科技有限公司＆中国科学院成都生物研究所研制，批号：must-16021806，含量以99.37%计），置50ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，备用，储备液浓度为0.1892mg/ml；
绿原酸（3-咖啡酰基奎宁酸）——精密称取绿原酸对照品10.07mg（中检院提供，批号110753-201415，含量以96.2%计），置10ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，备用，储备液浓度为0.9687mg/ml；
隐绿原酸（4-咖啡酰基奎宁酸）——精密称取隐绿原酸对照品11.17mg（成都曼思特生物科技有限公司＆中国科学院成都生物研究所研制，批号：must-16022403，含量以99.07%计），置10ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，备用，储备液浓度为1.1066mg/ml；
3,4-o-二咖啡酰基奎宁酸——精密称取3,4-o-二咖啡酰基奎宁酸对照品11.01mg（成都曼思特生物科技有限公司＆中国科学院成都生物研究所研制，批号：must-15081411，含量以99.05%计），置10ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，备用，储备液浓度为1.0905mg/ml；
3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸——精密称取3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸对照品10.71mg（中检院提供，批号111782-201405，含量以92.0%计），置10ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，备用，储备液浓度为0.9853mg/ml；
4,5-o-二咖啡酰基奎宁酸——精密称取4,5-o-二咖啡酰基奎宁酸对照品10.19mg（中检院提供，批号111894-201102，含量以94.1%计），置10ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，备用，储备液浓度为0.9589mg/ml。
（4）4种混合对照品溶液的制备：
混合对照品溶液①——分别吸取上述6种对照品储备液各1.00ml置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得，该混合溶液含新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、3,4-o-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸、4,5-o-二咖啡酰基奎宁酸的浓度分别为18.92μg/ml、96.87μg/ml、110.66μg/ml、109.05μg/ml、98.53μg/ml、95.89μg/ml；
混合对照品溶液②——精密吸取混合对照品溶液①1.00ml置5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得，该混合溶液含新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、3,4-o-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸、4,5-o-二咖啡酰基奎宁酸的浓度分别为3.784μg/ml、19.375μg/ml、22.132μg/ml、21.811μg/ml、19.706μg/ml、19.178μg/ml；
混合对照品溶液③——精密吸取混合对照品溶液②1.00ml置5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得，该混合溶液含新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、3,4-o-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸、4,5-o-二咖啡酰基奎宁酸的浓度分别为0.7568μg/ml、3.8749μg/ml、4.4264μg/ml、4.3622μg/ml、3.9413μg/ml、0.8355μg/ml；
混合对照品溶液④——精密吸取混合对照品溶液③1.00ml置5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得，该混合溶液含新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、3,4-o-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸、4,5-o-二咖啡酰基奎宁酸的浓度分别为0.1514μg/ml、0.7750μg/ml、0.8853μg/ml、0.8724μg/ml、0.7883μg/ml、0.7671μg/ml。
（5）线性考察：将上述6种对照品储备液按（1）中色谱条件进样10μl、4种对照品混合溶液①、②、③、④分别进样10μl，分别作为线性浓度从高到低的5个点，以对照品的进样量（ng）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，结果表明：
新绿原酸对照品进样量在1.514～1892ng范围内时，进样量与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：y=912643x+1446.6，r=1.0000；
绿原酸对照品进样量在7.750～9687ng范围内时，进样量与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：y=1e+06x+12376，r=1.0000；
隐绿原酸对照品进样量在8.853～11066ng范围内时，进样量与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：y=848861x+5659.4，r=0.9995；
3,4-o-二咖啡酰基奎宁酸对照品进样量在8.724～10905ng范围内时，进样量与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：y=1e+06x+8317.8，r=1.0000；
3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸对照品进样量在7.883～9853ng范围内时，进样量与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：y=1e+06x+12123，r=1.0000；
4,5-o-二咖啡酰基奎宁酸对照品进样量在7.671～9589ng范围内时，进样量与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：y=1e+06x+3881，r=1.0000。
（6）精密度试验：取同一份供试品溶液（编号012046-1），按（1）中色谱条件，连续测定6次。6次测定的9种成分含量如表2所示（n＝6），表明仪器的精密度良好。
表2精密度测定结果表
（7）重现性试验：取同一批供试品（编号012046）粉末约0.5g，精密称定，按（2）中提取方法提取并平行测定6份，6份测定的9种成分含量如表3所示（n＝6），结果表明本法的重现性较好。
表3重现性测定结果表
备注：①～⑥代表重复取样第一份到第六份，均值为六份含量测定结果的均值，单位均为mg/g。
（8）准确度试验：取同一批供试品（编号012046）粉末约0.25g，精密称定，共12份，按精密度结果计算出来的9种成分的含量分别加入三个水平（50%、100%、150%）的对照品量，按（2）中提取方法提取并平行测定，12份测定的9种成分加样回收结果如表4所示（n＝4），表明本法的准确度较好。
表4加样回收测定结果表
备注：以上加样结果为4份平行测定的均值（n=4），单位均为%。
（9）耐用性试验：分别采用不同品牌的色谱柱（kromasil、techmatec18st、agilenttcc18，三根色谱柱规格均为：5µm，4.6mm×250mm）测定样品（012046）中6种有机酸类成分的含量，结果见表5，表明本法耐用性良好。
表5不同色谱柱考察结果（含量单位为mg/g）
（10）检测限与定量限：当信噪比为3时，测得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、3,4-o-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸、4,5-o-二咖啡酰基奎宁酸的检测限分别为1.165、0.973、1.088、0.945、0.994和1.315ng；当信噪比为10时，测得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、3,4-o-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸、4,5-o-二咖啡酰基奎宁酸的定量限分别为3.882、3.243、3.628、3.149、3.312和4.383ng。
（11）粗毛玉叶金花一测多评方法的建立：
以绿原酸为内标，对其有机酸类成分使用一测多评的方法进行测定，通过考察不同品牌的仪器、柱子、不同流动相比例等，以绿原酸为内参物，建立5种成分的相对校正因子（fk/s），计算各成分的量，结果见表6～7。
表6玉叶金花6种成分相对保留时间及校正因子
表7一测多评法与对照品法实验数据值对比表
从表7可知，rd值＜3%，一测多评法及对照品法无显著差异，可以采用一测多评法进行含量测定。