本发明涉及非糖固形物检测方法，特别涉及一种14到16度黄酒非糖固形物简便快速测定方法。
背景技术：
：黄酒是我国的特色酒种，其色泽明亮、香气浓郁、甘甜味美、风味醇厚，并含有丰富的氨基酸、小分子糖类、有机酸、维生素和微量元素等。黄酒由于其营养丰富、酒精度低且具有独特的风味口感和功效而深受广大人民群众的喜爱。非糖固形物是酒样中除糖外的非挥发性组分的统称，其在黄酒中的占比很小通常不足3%。虽然含量低，非糖固形物作用却很大，它很大程度上决定了黄酒的色泽、滋味、营养和功效，是黄酒品质等级评定的一项重要指标。按照国标gb/t13662-2008《黄酒》中参数，同一类型的黄酒中非糖固形物含量越高，黄酒的品质越好、口味越佳。现行的黄酒国标中采用的是4h烘干法来测定酒样中的非糖固形物含量，这种方法耗时长，而且存在酒样烘干4h后质量未达到恒重的情况，不利于快速测定、精确测量和批量检测。此外，还有基于近红外光谱建立的酒样非糖固形物快速测定方法，但是这种方法需要借助于贵重的设备，而且需要耗费较高的检测成本。因此目前亟需建立准确可靠、简便快速且经济实用的黄酒非糖固形物测定方法。乙醇含量即酒精度和总糖含量是黄酒的必测指标，单位体积的酒样质量可以很容易称定，此时若能测出酒样中乙醇水体系的总质量，则酒样质量减去乙醇水体系质量再减去总糖就可以得到非糖固形物质量。本发明利用特定双链dna片段在不同水和乙醇质量体积比的乙醇水体系中变性程度不同导致260nm波长下吸光度有所差异，从而建立起一种全新的14到16度黄酒中非糖固形物测定方法，具有准确可靠、简便快速且经济实用的特点，适合于酒厂检测实际需求。技术实现要素：本发明的目的在于提供14到16度黄酒非糖固形物简便快速测定方法。本发明解决其技术问题所采用的技术方案为，14到16度黄酒非糖固形物简便快速测定方法的主要步骤如下：（1）在黄酒品质检测中，按照现行国标先测定其酒精度v这一必测指标，同时称定1l酒样质量mo，测定酒样的温度并据此查询乙醇密度ρ。（2）移取320ul室温待测黄酒酒样到空的酶标板中，加入40ul初始变性剂和40ul特定双链dna片段并充分混匀后静置4min，同时设置对照孔为320ul待测酒样加40ul初始变性剂加40ul蒸馏水，待测酒样和对照均取平行测三次，样本处理好后将酶标板置于酶标仪中。（3）设定好酶标仪程序在260nm波长下测定样品孔和对照孔中的吸光度，则样品的平均吸光度减去对照的平均吸光度即为样品中特定双链dna片段的实际吸光度x。将x代入关系式y=-11.349x+7.836中则可算出酒样中水和乙醇的质量体积比y，则酒样中总固形物含量m=mo-10×ρ×v-10×y×v也即m=mo-10×（ρ+y）×v，进而非糖固形物含量m=m-mt，mt为总糖含量。其中，步骤（1）中所述的黄酒是指国标法测定酒精度v大于等于14.0且小于等于16.0的黄酒；所述酒精度v是黄酒品质检测的必测指标，原本就有可直接采用；所述1l酒样质量mo的测定方法为：在按国标法测定酒样酒精度时，量取100ml酒样后称量装有酒样的容量瓶重，则该重量扣除空容量瓶重即为100ml酒样重量，经换算即可得到1l酒样质量mo，其单位为g/l；所述酒样温度为正常室温即可，优选地，控制在30.0±5.0℃之间。其中，步骤（2）中所述的初始变性剂是8%质量体积分数的尿素和8%体积体积分数的甲酰胺混合水溶液，即每100ml初始变性剂中含有8g的尿素和8ml的甲酰胺；所述的特定双链dna片段，其序列如seqidno：1所示，浓度为20umol。其中，步骤（3）中所述的平均吸光度是指三个平行的吸光度的算术平均值；所述总固形物含量m=mo-10×ρ×v-10×y×v，其中10×ρ×v即乙醇密度乘以酒精度也就是100ml酒样的乙醇体积含量再乘以10，就可以得到1l酒样中的乙醇质量；而10×y×v即乙醇体积乘以水和乙醇的质量体积比再乘以10，就可以得到1l酒样中的水质量，则10×（ρ+y）×v实际上就是1l酒样中乙醇水体系的质量之和；因此总固形物含量m=mo-10×（ρ+y）×v，也即1l酒样总质量减去其中的乙醇水体系质量则为1l酒样中的总固形物含量，其单位为g/l；进而非糖固形物含量等于总固形物含量减去总糖含量也即m=m-mt，而总糖含量mt是黄酒品质检测的必测指标，原本就有可直接采用，其单位为g/l。本发明筛选到特定的双链dna片段其序列如seqidno：1所示，并揭示了其在14-16度黄酒中紫外吸光度同体系中的水和乙醇的质量体积比之间的关系，在此基础上构建了14-16度黄酒非糖固形物的简便快速测定方法。本发明的非糖固形物测定方法适用于14-16度黄酒的测定，具有良好的准确性和可靠性，无需长时间烘干较为安全，操作简便迅速，所需酒样量很少，且检测成本低廉，适合于酒厂中此类黄酒非糖固形物测定实践。附图说明图1是本发明14到16度黄酒非糖固形物测定新方法的标准曲线，涉及特定双链dna片段在260nm下的吸光度x和乙醇水体系中水和乙醇的质量体积比y的关系。图中的y=-11.349x+7.836是spss23.0软件拟合的x和y的关系式，r2=0.9969表示的是拟合曲线的决定系数。具体实施方式以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。本发明在待测酒样和dna体系中还加入经优化的特定浓度的尿素和甲酰胺混合液，主要是为了使dna片段处于一个易于变性的环境中，从而使得基于此的乙醇水体系质量测定方法具有更高的灵敏度。本发明筛选和优化得到的特定双链dna片段如seqidno：1所示，经研究发现在14到16酒精度这一窄的范围内其在260nm下的吸光度和体系中的水和乙醇质量比可以实现线性拟合。在本发明体系和条件下，14度以下的酒精度尚不足以使特定双链dna片段变性，16度以上的酒精度已经足以使特定双链dna片段完全变性，因此本发明提供的标准曲线只适用于14-16度之间的黄酒的非糖固形物测定。由于酒中乙醇和水占主体，固形物含量很低因此其对体系在260nm的吸光度影响很小，而且最大紫外吸收波长在260nm的特定双链dna片段的浓度高达20umol，一方面可以提高检测灵敏度另一方面可以排除背景干扰。此外，设置了只加初始变性剂而不加特定双链dna片段的酒样做为对照，可尽可能消除背景对吸光度的影响。在酒水产品质量检测中，分光光度法是常用的手段，可以测定包括色度、甲醇和特定氨基酸等，因此分光光度计是常规设备。实施例1实施例1是本发明14到16度黄酒非糖固形物简便快速测定方法中水和乙醇质量体积比测定标准曲线的制作。（1）人工乙醇水体系配制用移液器分别量取14.00ml、14.40ml、14.80ml、15.20ml、15.60ml和16.00ml无水乙醇于6个100ml容量瓶中，容量瓶置于分析天平上对应分别加入86.00g、85.60g、85.20g、84.80g、84.40g和84.00g蒸馏水，盖紧容量瓶盖反复颠倒充分混匀，室温静置10min，最终得到了不同水和乙醇质量体积比即水的质量/乙醇体积（对应分别为6.143、5.944、5.757、5.579、5.410和5.250）的人工乙醇水体系。（2）人工乙醇水体系前处理用移液枪分别移取320ul室温待测人工乙醇水体系到空的普通酶标板中，先加入8%质量体积分数的尿素和8%体积体积分数的甲酰胺混合水溶液40ul作为初始变性剂，再加入如seqidno：1所示的特定双链dna片段（20umol）40ul，则总体系为400ul，充分混匀后静置4min。需要说明的是8%质量体积分数的尿素和8%体积体积分数的甲酰胺是指100ml蒸馏水中溶解有8g的尿素和8ml的甲酰胺，特定双链dna片段是由上海生工生物工程有限公司合成的互补单链等量混合而成。同时设置对照孔为320ul人工乙醇水体系加40ul上述初始变性剂加40ul蒸馏水，即对照为用蒸馏水取代特定双链dna片段，各人工乙醇水体系和相应的对照均取平行三次，样本制备好后将酶标板置于酶标仪（美国thermo公司的multiskango）中。（3）人工乙醇水体系中水和乙醇质量体积比测定方法标准曲线设定好酶标仪程序在260nm波长下测定样品孔和对照孔中的吸光度，则样品的平均吸光度（三个平行取平均）减去对照的平均吸光度（三个平行取平均）即为样品中特定双链dna片段的实际吸光度x，如表1所示。对吸光度x和对应的乙醇水体系中水和乙醇质量体积比y的散点进行观察，发现呈现线性趋势（图1），进行拟合得到关系式为y=-11.349x+7.836，而r2=0.9969表明线性关系良好，则此即乙醇水体系中水和乙醇质量体积比测定方法标准曲线。表1乙醇水体系中水和乙醇质量体积比标准曲线数据平均吸光度x水和乙醇质量体积比y0.1496.1430.1685.9440.1815.7570.2015.5790.2125.4100.2285.250实施例2实施例2是利用本发明新方法对标注酒精度为14的黄酒酒样的非糖固形物进行的实际测定。（1）选择市售绍兴五年陈糯米花雕酒（绍兴市抱龙山酒业有限公司产），瓶身标注酒精度为14度。准确起见需要再次测定酒精度，因此基于现行黄酒国标采用酒精度计法测定此黄酒的酒精度为14.1。经称量和换算，1l此黄酒的质量为1099.757g。酒样温度为30℃，经查乙醇在此温度下的密度为0.781g/ml。（2）待测黄酒酒样前处理用移液枪移取320ul待测黄酒酒样到空的普通酶标板中，先加入8%质量体积分数的尿素和8%体积体积分数的甲酰胺混合水溶液40ul作为初始变性剂，再加入如seqidno：1所示的特定双链dna片段（20umol）40ul，则总体系为400ul，充分混匀后静置4min。同时设置对照孔为320ul待测黄酒酒样加40ul初始变性剂加40ul蒸馏水体系（总体积也为400ul），各待测黄酒酒样和相应的对照均取平行三次，样本制备好后将酶标板置于酶标仪（美国thermo公司的multiskango）中。（3）待测黄酒酒样非糖固形物测定设定好酶标仪程序在260nm波长下测定样品孔和对照孔中的吸光度，则样品的平均吸光度（三个平行取平均）减去对照的平均吸光度（三个平行取平均）即为样品中特定双链dna片段的实际吸光度x=0.153±0.002，将其代入水和乙醇质量体积比y和吸光度x之间的关系式即y=-11.349x+7.836（9.000≤y≤11.500），算出水和乙醇质量体积比y=6.700，如表2所示。则酒样中总固形物含量m=mo-10×ρ×v+10×y×v即m=1099.757-10×0.781×14.1-10×6.700×14.1，经计算为44.936g/l。表2本发明方法实验数值黄酒酒精度乙醇密度/g×ml-11l酒样质量/g水和乙醇的质量体积比本发明方法测定的总固形物/g×l-1国标法测定的总固形物/g×l-1偏差%绍兴五年陈糯米花雕酒14.10.7811099.7576.70044.93644.6250.70此外，按照国标的4h烘干法测定总固形物含量为44.625g/l。若以国标法测得的总固形物含量为基准，则本发明方法测得的数值与其偏差为0.70%（本发明方法测得的总固形物与国标测定值的差值占国标测定值的百分比），满足总固形物的测定精度。最终再将总固形物含量减去总糖含量即得到非糖固形物的含量。由于是拿市售成品酒来测，其总糖含量只标注范围，如半干则总糖为15.1-40g/l。在工厂实际中，有总糖的具体测定数值，可直接拿来用。实施例3实施例3是利用本发明新方法对标注酒精度为16的黄酒酒样的非糖固形物进行的实际测定。选择市售女儿红八年冬酿黄酒（绍兴女儿红酿酒有限公司产），瓶身标注酒精度为16度。准确起见需要再次测定酒精度，因此基于现行黄酒国标采用酒精度计法测定此黄酒的酒精度为15.8。经称量和换算，1l此黄酒的质量为1038.176g。酒样温度为30℃，经查乙醇在此温度下的密度为0.781g/ml。参照实施例2进行测定，实际吸光度x=0.216±0.003，相关数值详见表3。若以国标法测得的总固形物含量为基准，则本发明方法测得的数值与其偏差为0.69%，满足总固形物的测定精度。表3本发明方法实验数值黄酒酒精度乙醇密度/g×ml-11l酒样质量/g水和乙醇的质量体积比本发明方法测定的总固形物/g×l-1国标法测定的总固形物/g×l-1偏差%女儿红冬酿黄酒15.80.7811038.1765.38563.94863.5100.69综上可知，本发明的非糖固形物测定方法适用于14-16度黄酒的测定，具有良好的准确性和可靠性；与国标4h烘干法相比，无需长时间烘干较为安全，操作10min且简便迅速；另外所需酒样量很少，且检测成本不足1元/样十分低廉，适合于酒厂中此类黄酒非糖固形物测定实践。序列表<110>陈荷冰<120>14到16度黄酒非糖固形物简便快速测定方法<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>11<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ctgctaacgcg11当前第1页12