一种用于体外诊断的目标靶分子快速捕获方法与流程

本发明属于体外快速诊断领域，具体涉及一种用于体外诊断的目标靶分子快速捕获方法。

背景技术：

分析与诊断技术一直是体外诊断(ivd)中快速发展的一部分。生化、免疫与分子，可分为临床实验室诊断和即时诊断(poct)。检测对象也包括激素小分子、抗原和抗体、核酸等。大多数的检测技术都是基于两种或者多种成分之间发生直接或者间接的特异性识别与结合反应，从而形成可检测的多元复合物。最常用到的捕获试剂就是抗体，它可以与各种样本(如全血、血浆、血清、尿液、唾液等)中的目标靶分子(某种特异性的抗原，如乙肝表面抗原)结合，在通过指示系统的显示产生阳性反应信号。随着技术的不断进步和法阵，捕获物质和检测物质的范围都在扩大，比如噬菌体展示肽库筛选得到的特异性结合物可以方便的制备而且其亲和力也大大提高。多年的发展证明，免疫分析技术在临床检测中具有极大的价值。

然而，为了得到精确的结果，免疫学试验常常需要一系列繁复和耗时的步骤，也需要准确和专业的技术知识才可以操作。近年来，虽然有各种poct的检测方法，如胶体金侧向流分析技术的出现，缩短了检测的时间和步骤，但是由于其自身的原因导致其灵敏度较低，也大大限制了胶体金侧向流分析技术的发展和应用。

为了实现这一目的，已经产生了大量的各种形状、构造和设计的用于体外诊断检测装置。本质上，都是将特异性的捕获物质直接或间接的固定在检测载体上，然后检测样本中是否存在靶标物质。如果样本中存在靶标物质，它将于捕获试剂结合，随后就可以用多种指示系统来显示样本中存在的靶标物质。

经典的用于体外诊断检测方法主要分为酶标法和金标法，酶标法采用的反应机构就是普通的孔板，如图4所示，检测载体b修饰于孔板a底部，待测液c中能够产生特异性识别与结合反应的界面仅限于检测载体b的单个表面，因此这种反应机构的缺点是孵育期较长，导致整体检测时间长(通常在3小时左右)，灵敏度可达到50pg/ml左右。金标法采用的反应机构主要基于试纸条，检测载体(通常为nc膜)修饰于试纸条上，检测时将试纸条插入待测液中或者将待检样本滴加于试纸条的样本垫上，借助试纸条另一端吸水纸的虹吸作用，使待检样本单向、单次通过检测载体，因此这种反应机构的缺点是捕获物与目标反应物的接触时间短，结合率低，最终导致其检测灵敏度低(能达到10ng/ml左右)，优点是检测速度快，通常在15-30分钟即可得到结果。

技术实现要素：

针对现有技术中的不足之处，本发明旨在提供一种用于体外诊断的目标靶分子快速捕获方法，以期能够同时兼顾反应效率和检测灵敏度。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种用于体外诊断的目标靶分子快速捕获方法，该目标靶分子存在于液体样本中，将该液体样本滴加于固定化载体上，所述固定化载体上设有特异性捕获目标靶分子的捕获试剂；

其中，所述固定化载体的一侧可拆卸连接一气密环境，该气密环境具有气压可调功能；

通过调节该气密环境的气压，使液体样本往复运动于所述固定化载体但不脱离该固定化载体。

优选的是，所述的用于体外诊断的目标靶分子快速捕获方法，其中，所述固定化载体具有多层立体微孔的空间结构，通过控制该气密环境的气压，使液体样本反复通过所述固定化载体中的多层立体微孔。

优选的是，所述的用于体外诊断的目标靶分子快速捕获方法，其中，所述固定化载体被设置为：当液体样本滴加于固定化载体时，在正常大气压条件下，仅依靠重力不使液体样本发生悬滴。

优选的是，所述的用于体外诊断的目标靶分子快速捕获方法，其中，所述气密环境被设置为不干涉液体样本的往复运动。

优选的是，所述的用于体外诊断的目标靶分子快速捕获方法，其中，所述固定化载体被设置为不干涉目标靶分子与捕获试剂的结合。

优选的是，所述的用于体外诊断的目标靶分子快速捕获方法，其中，所述固定化载体的形态被设置为膜式、柱式或絮状。

本发明的有益效果是：本发明通过使液体样本反复通过固定化载体，增加了目标靶分子和捕获试剂的接触频次，有效提高了目标靶分子的捕获效率，同时该方法又可用于非特异性结合的物质洗涤，以降低背景干扰。

附图说明

图1为本案实现目标靶分子快速捕获所采用的一具体实施例的结构示意图。

图2为液体样本在减压时的状态示意图。

图3为液体样本在增压时的状态示意图。

图4为现有技术中基于酶标法捕获目标靶分子的原理示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

下面列出本案一实施例的用于体外诊断的目标靶分子快速捕获方法，该目标靶分子存在于液体样本中，将该液体样本滴加于固定化载体上，固定化载体上设有特异性捕获目标靶分子的捕获试剂；其中，固定化载体的一侧可拆卸连接一气密环境，该气密环境具有气压可调功能；通过调节该气密环境的气压，使液体样本往复运动于固定化载体但不脱离该固定化载体。

其中，捕获试剂根据目标靶分子的种类来确定。液体样本的溶剂种类也不受限定，包括但不限于水、乙醇等溶剂。气密环境所具有的具体结构也不受限定，包括但不限于盒状、柱状、杯状、球状等形状。气压可调功能可通过包括但不限于采用注射器、蠕动泵、气压计、控压阀等气动元件连通于气密环境内部来实现。

其中，固定化载体可优选具有多层立体微孔的空间结构，通过控制该气密环境的气压，使液体样本反复通过多层立体微孔的空间结构。

其中，固定化载体优选被设置为：当液体样本滴加于固定化载体时，在正常大气压条件下，仅依靠重力不使液体样本发生悬滴。这样设置的目的是控制固定化载体对液体的吸附力，以避免液体在负压时无法悬挂于固定化载体。

其中，气密环境优选被设置为不干涉液体样本的反复游动。这样设置的目的是为当液体悬挂至不脱离固定化载体所能允许的最大距离时，气密环境所具有的结构能够为悬挂的液滴预留足够的空间。

其中，固定化载体优选被设置为不干涉目标靶分子与捕获试剂的结合。固定化载体的材质可包括但不限于硝酸纤维素、聚偏氟乙烯、尼龙材料以及天然材料(如棉花、蚕丝、壳聚糖、海藻酸、淀粉和其他聚多糖……)或者半合成(天然材料与聚甲基丙烯酸羟乙酯(hydroxyethylmethacrylate，phema)、聚乙二醇、聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate，pmma)、聚乙烯醇(polyvinylalcohol，pva)等人工合成材料的组合与搭配)的材料，这些材料均具有多层立体微孔的空间结构。固定化载体的形态包括但不限于膜式、柱式、絮状等形态。固定化载体的孔径大小被设置为允许液体样本中的未结合物质通过。

图1示出一气密环境和固定化载体的具体形式，见图1，固定化载体2为膜式，其具有相对的第一表面2a(下表面)和第二表面2b(上表面)；气密环境1呈杯状，固定化载体2可拆卸连接于气密环境1的开口处，通过引入一根通气管3来外接蠕动泵等气动元件。在使用时，在固定化载体2的上方滴加液体样本，随后通过通气管3向气密环境1反复抽气和鼓气，控制抽气和鼓气的强度，达到调控气密环境1内的压力强度的目的。当抽气时，液滴4a的位置如图2所示，此时液体样本悬滴(悬挂)于固定化载体2的第一表面2a；当鼓气时，液滴4b的位置如图3所示，此时液体样本浮于固定化载体2的第二表面2b；通过反复抽气和鼓气使得目标靶分子可以反复通过固定化载体2与固定化载体2中的捕获试剂产生特异性反应，从而增加二者的结合几率。此外，该设计由于将固定化载体2架空起来，使得易于洗脱杂质，有利于将非特异性结合的物质洗涤得更干净和彻底，从而降低背景干扰。

实施例1：采用气密瓶式双抗体夹心法检测乙肝表面抗原

固定化载体使用硝酸纤维素膜(nc膜)：whatman0.45um

1.将捕获抗体浓度为5mg/ml，取2μl点加在nc膜上，37度烘箱30min充分干燥，完成包被。

2.组装：按照硅胶垫+nc膜+硅胶垫的顺序组装好，硅胶垫的尺寸为12×1.5×4(直径为12mm，厚度为1.5mm，中间开孔的直径为4mm)，硅胶垫带防水性粘合剂；nc膜裁剪成直径为7mm的圆形，夹在2层硅胶垫之间。将组装好的nc膜放入顶空螺旋盖中压紧并与收集瓶旋紧，形成气密性的结构，待用。

3.加样

将2倍系列稀释的阳性血浆样本(含有乙肝表面抗原)，共10个稀释度，以每个稀释度2μl的量分别加入到包被了捕获抗体的nc膜上，室温孵育2min。

4.压力操控

本实施例中使用一次性注射器为压力控制装置，将针头穿过硅胶垫伸入收集瓶中，通过来回抽动注射器5次，使收集瓶内产生正负压交替，从而使nc膜上的样本反复流动通过，大大增加待检样本中乙肝表面抗原与捕获抗体的结合几率。

5.洗涤

拉动注射器使收集瓶内保持负压的状态，将pbst缓慢滴加到nc膜上，在负压的作用下通过nc膜，达到洗涤未结合蛋白和杂质的作用。每次洗涤为100μl，洗涤后将注射器取下，使得收集瓶的内外压力保持平衡。

6.金标二抗的指示作用

将抗乙肝表面抗原的单克隆抗体标记了的胶体金颗粒，滴加到10μlnc膜上，室温孵育2min，然后缓慢抽动注射器使得胶体金缓慢通过nc膜。通过肉眼即可判断结果。乙肝表面抗原阳性的样本胶体金将吸附在nc膜表面，肉眼可见粉紫色的斑点；乙肝表面阴性的样本将是原本的nc的白色背景色。

7.检测结果：本发明的气密瓶式双抗体夹心法的检测乙肝表面抗原的灵敏度可达到2^-8的稀释度。

对比例1a(酶标法)

1.将试剂盒从冷藏环境中取出，置室温平衡30分钟后使用。

2.将浓缩洗液用蒸馏水或去离子水20倍稀释备用。

3.设空白对照1孔，不加样品和酶结合物。2倍系列稀释的阳性血浆样本(含有乙肝表面抗原)，共10个稀释度，以每个稀释度50μl的量分别加入反应孔中。

4.每孔加入酶结合物50μl，在反应板上加盖封板膜，振荡混匀，置37℃温箱或水浴锅中反应60分钟。

5.弃去反应液，每孔加入稀释后的洗液300μl，静置10秒，甩弃洗液，重复5次后拍干。

6.每孔加入底物a、b液各50μl，加盖封板膜，振荡混匀，37℃避光显色15分钟。

7.每孔加入终止液各50μl，振荡混匀终止反应。

8.用空白对照孔调零，并尽快用酶标仪450nm测定各孔od值。也可用双波长450nm/630-690nm测定各孔od值(双波长测定不用设空白)。

9.检测结果：酶标法的检测乙肝表面抗原的灵敏度可达到2^-8的稀释度。

对比例1b(金标法)

1.将密封桶打开，取出所需数量的试纸条后，立即关好密封桶。

2.将试纸条放在水平工作台上平置并做好样本标记。

3.2倍系列稀释的阳性血浆样本(含有乙肝表面抗原)，共10个稀释度，用毛细管吸取40μl标本(血清或血浆则80μl)滴于试纸条的样品垫上，立即在样本垫上滴加1滴(40～50μl)样品稀释液(血清或血浆标本则无须滴加样品稀释液)。

4.30分钟内观察并记录实验结果。

5.检测结果：金标法的检测乙肝表面抗原的灵敏度为2^-4的稀释度。

通过实施例1、对比例1a和1b，从检测耗费的时间来看，本发明方法的检测时间明显少于酶标法，与金标法相近；从检测的灵敏度来看，本发明的方法的灵敏度明显高于金标法，而与酶标法的灵敏度相近。综合来看，利用本发明的方法检测乙肝表面抗原同时具有高灵敏度和很少的检测时间，而且本发明的方法的样品检测量只需2-5μl，明显少于酶标法和金标法。

实施例2：采用24孔板式双抗体夹心法检测梅毒抗体

载体使用硝酸纤维素膜(nc膜)：whatman0.45um

1.将捕获抗原浓度为5mg/ml，取2μl点加在nc膜上，37度烘箱30min充分干燥，完成包被。

2.组装：按照硅胶塞+nc膜+硅胶垫的顺序组装好，硅胶塞的尺寸为17×5×4(直径为17mm，厚度为5mm，中间开孔的直径为4mm)，硅胶垫的尺寸为16*0.5*4(直径为16mm，厚度为0.5mm，中间开孔的直径为4mm)硅胶垫带防水性粘合剂；nc膜裁剪成直径为7mm的圆形，夹在硅胶塞与硅胶垫之间。将组装好的结构塞入24孔板中并形成气密性的结构，待用。

3.加样

将2倍系列稀释的阳性样本(含有梅毒抗体)，共10个稀释度，以每个稀释度2μl的量分别加入到包被了捕获抗体的nc膜上，室温孵育2min。

4.压力操控

本应用例中使用蠕动泵为压力控制装置，针头穿过硅胶垫伸入24孔板中并与蠕动泵相连接，通过蠕动泵的转动方向控制24孔板中的正负压交替，从而使nc膜上的样本反复流动通过，大大增加待检样本与捕获抗原与待检抗体的结合几率。

5.洗涤

启动蠕动泵并维持负压的状态，将pbst缓慢滴加到nc膜上，在负压的作用下通过nc膜，达到洗涤未结合蛋白和杂质的作用。每次洗涤为100μl，洗涤后关闭蠕动泵，使得收集瓶的内外压力保持平衡。

6.hrp标记的梅毒检测抗原的加入

将hrp标记的梅毒抗原以1:8000的浓度，滴加到10μlnc膜上，室温孵育2min，然后开启蠕动泵使得溶液反复通过nc膜。

7.洗涤

启动蠕动泵并维持负压的状态，将pbst缓慢滴加到nc膜上，在负压的作用下通过nc膜，达到洗涤未结合蛋白和杂质的作用。每次洗涤为100μl，洗涤后关闭蠕动泵，使得收集瓶的内外压力保持平衡。

8.沉淀型tmb显色

将沉淀型tmb显色底物滴加到nc膜上，梅毒抗体阳性将在nc膜表面，形成蓝紫色的斑点；梅毒抗体阴性的样本将是原本的nc的白色背景色。

9.仪器拍照并扫描后分析斑点的灰度，从而实现半定量的测定梅毒抗体值。

10.检测结果：24孔板式双抗体夹心法检测梅毒抗体的灵敏度可达到2^-4。

对比例2a(酶标法)

1.平衡：将试剂盒从冷藏环境中取出，置室温平衡30分钟后使用。

2.配液：将浓缩洗液用蒸馏水或去离子水20倍稀释备用。

3.设定：留一孔作空白对照，暂不加任何液体。另设阴性对照3孔、阳性对照做2倍系列稀释，共10个稀释度，以每个稀释度100μl的量分别加入96孔板中。

4.温育：在反应板上加盖封板膜，振荡混匀，置37℃温箱或水浴锅中，反应30分钟。

5.洗板：弃去反应液，每孔加入稀释后的洗液300μl，浸泡15秒，甩弃洗液。连续洗板5次，最后拍干。

6.加酶：每孔加入100μl酶结合物(空白对照孔不加)。

7.温育：在反应板上加盖封板膜，置37℃温箱或水浴锅中，反应30分钟。

8.洗板：洗板5次，同操作步骤6。

9.显色：每孔依次加入底物a、b液各50μl(包括空白对照孔)，加盖封板膜，振荡混匀，37℃避光显色10分钟。

10.终止：每孔加入终止液各50μl(包括空白对照孔)，振荡混匀终止反应。

11.测定：用空白对照孔调零，并于30分钟内用酶标仪单波长450nm测定各孔od值。也可用双波长450nm/630nm测定各孔od值。

12.检测结果：酶标法检测梅毒抗体的灵敏度可达到2^-4。

对比例2b(金标法)

1.将密封桶打开，取出所需数量的试纸条后，立即关好密封桶。

2.将试纸条放在水平工作台上平置并做好样本标记。

3.2倍系列稀释的阳性血浆样本(含有梅毒抗体)，共10个稀释度，用毛细管吸取40μl标本(血清或血浆则80μl)滴于试纸条的样品垫上，立即在样本垫上滴加1滴(40～50μl)样品稀释液(血清或血浆标本则无须滴加样品稀释液)。

4.30分钟内观察并记录实验结果。

5.检测结果：金标法检测梅毒抗体的灵敏度为2^-2。

通过实施例2、对比例2a和2b，从检测耗费的时间来看，本发明的方法的检测时间明显少于酶标法，与金标法相近；从检测的灵敏度来看，本发明的方法的灵敏度明显高于金标法，而与酶标法的灵敏度相近。综合来看，利用本发明的方法检测梅毒抗体同时具有高灵敏度和很少的检测时间，而且本发明的方法的样品检测量只需2-5μl，明显少于酶标法和金标法。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。