一种植物样品前处理方法与流程

本发明属于分析化学领域，具体地涉及一种植物样品的前处理方法，该方法适用于分析植物样品中油菜素甾醇类化合物时的样品前处理。

背景技术：

植物激素是植物体内合成的对植物生长发育起重要调控作用的小分子代谢物，几乎参与了植物生长发育的每一过程。检测植物体内激素的种类、含量、及其空间分布情况，对于研究植物激素的生理调控和信号传导机理具有重要意义。其中，油菜素甾醇的检测尤为困难。因为相比于其它植物激素，如赤霉素、细胞分裂素、茉莉酸等，油菜素甾醇在植物体内的含量更低，一般叶芽和叶片中含量仅约0.01～0.1ng/g鲜重，而大部分赤霉素的含量为1～100ng/g鲜重。其次，油菜素甾醇的基本结构为5-胆甾烷，取代基主要为羟基或酮，这种结构的化合物缺乏可检测的功能基团，难于采用光谱检测手段，质谱信号较弱。目前，主要采用色谱-质谱联用方法检测植物样品中的油菜素甾醇，在进入色谱分析前，油菜素甾醇需进行衍生，以增强其质谱响应。由此可见，对于油菜素甾醇的检测，样品前处理方法尤为重要。尤其对于毫克级的植物样品来说，如何排除复杂样品基质的干扰，高效提取、富集痕量油菜素甾醇，是有待解决的一个难题，也是制约油菜素甾醇检测灵敏度的一个关键因素。

现有技术常采用液相萃取、固相萃取(solidphaseextraction，spe)、基质固相分散(matrixsolidphasedispersion，mspd)等方法的组合来处理植物样品。大部分方法需要的植物样品量在几个毫克至几克鲜重量级，对于1mg鲜重以下的样品难于获得较高的萃取效率和分析性能。多步样品前处理操作伴随的多次样品转移，导致植物激素在样品前处理过程中损失较大，是影响萃取效率的主要原因。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种植物样品的前处理方法，能够对亚毫克级至亚克级植物样品中的油菜素甾醇进行提取、纯化、富集，提高后续色谱-质谱分析的选择性和灵敏度，解决少量样品中痕量油菜素甾醇的检测难题。

为了解决上述技术难题，本发明采用的技术方案如下：

一种植物样品前处理方法，包括如下步骤：

1)将植物样品与固体吸附剂1一同装入离心管内混合，在液氮下研磨；

2)离心管内加入提取溶剂，在0℃～4℃下离心，对植物样品中的油菜素甾醇进行提取，获得上清液a；

3)将步骤2)中获得的上清液a与固体吸附剂2混合，在0℃～4℃下再次离心，去除上清液a中基质杂质，获得上清液b；

4)将上清液b全部转移至反应容器内，加入衍生试剂，对油菜素甾醇进行衍生，反应温度为50～90℃；

5)衍生反应结束后，对产物溶液进行吹干并复溶于有机溶剂中，用于油菜素甾醇的色谱分析检测；或直接将反应后的溶液用于色谱分析检测。用于复溶的有机溶剂根据色谱分离条件进行选择。

所述固体吸附剂1为c18键合硅胶颗粒或c8键合硅胶颗粒；所述固体吸附剂2为阳离子交换吸附剂与阴离子交换吸附剂的组合，固体吸附剂1和固体吸附剂2的粒径为40微米～60微米。

所述提取溶剂为乙腈或乙腈-水混合溶液，其中乙腈的体积分数为60％～100％。所述提取溶剂与固体吸附剂1的体积质量比(ml/g)为12:1～50:1。

获得上清液a后，可以直接在步骤2)所述的离心管内加入固体吸附剂2，使其与上清液a混合接触、离心后，获得上清液b，以降低样品转移带来的组分损失。

所述阳离子交换吸附剂为市售强阳离子交换吸附剂、弱阳离子交换吸附剂、混合型阳离子交换吸附剂中的任一种；所述阴离子交换吸附剂为市售强阴离子交换吸附剂、弱阴离子交换吸附剂、混合型阴离子交换吸附剂中的任一种；组合使用时，即强阳离子交换吸附剂与强阴离子交换吸附剂组合，弱阳离子交换吸附剂与弱阴离子交换吸附剂组合，混合型阳离子交换吸附剂与混合型阴离子交换吸附剂组合。

所述衍生试剂为氨基苯硼酸及其衍生物、吡啶硼酸及其衍生物中的一种，衍生试剂在反应溶液中的最终浓度为0.1～10mg/ml，其中氨基苯硼酸溶液的溶剂中含有1％～10％(v/v)吡啶。

所述步骤2)和步骤3)中的离心时间为2min～10min。

所述植物样品与固体吸附1或2的质量比为1:1～1:6，优选1:4。

所述阳离子交换吸附剂与阴离子交换吸附剂组合时，其质量比为1:10～1:1。

本发明的技术方案与现有技术的区别主要在于：

(1)现有技术采用传统基质固相分散的方法对植物样品进行处理，即植物样品与固体吸附剂在研钵中进行混合研磨，然后将混合物填装至固相萃取柱管内，添加溶剂进行洗脱。这种方法中样品从研钵转移至萃取柱管内是不可避免的，而这种转移带来的样品损失是必然的。尤其对于少量样品，如毫克甚至亚毫克样品来说，这一步转移带来的损失是非常可观的。而本发明的技术方案，将样品与固体吸附剂1在离心管内进行研磨，然后直接在管内加入提取溶剂进行提取。这一步操作非常简单，对亚毫克至亚克级样品都适用，完全避免了样品转移带来的损失。

(2)现有针对油菜素甾醇的样品前处理方法中，通常会采用两步及以上固相萃取对样品进行纯化除杂。如在基质固相分散萃取之后，仍采用混合阴离子交换吸附剂和混合阳离子交换吸附剂先后进行固相萃取。本发明提出了将两种离子交换吸附剂混合使用，并采取分散固相萃取的方式，直接与前一步的上清液混合离心，无需填装固相萃取柱，避免了传统固相萃取所必需的活化、上样、淋洗、洗脱等多步操作，耗时更短，溶剂消耗更少，对于少量样品来说，萃取效率更高。

本发明的样品前处理方法可以处理不足1mg鲜重的植物样品，与传统mspd方法相比，在离心管内进行少量样品的研磨，在不转移样品的条件下直接加入溶剂离心萃取，解决了多部样品转移带来样品损失严重的问题，同时，解决了少量样品在研钵中研磨因吸附导致的样品损失问题。本技术方案将阴离子、阳离子交换吸附剂合并在一起作为固体吸附剂2进行分散固相萃取，与分步进行分散固相萃取的技术方案相比，避免了样品转移带来的损失。理论上，这种组合使用会降低除杂效果，尤其当固体吸附剂2与固体吸附剂1混合使用时，萃取效率很差。但实验证明，阴离子、阳离子交换吸附剂的组合并未对植物样品中油菜素甾醇的提取造成不利影响，反而因为消除样品损失而提高了萃取效率。

本发明具有操作简单、低耗高效的优点，能将植物样品的前处理时间从传统的数小时降低至30min以内。对亚毫克至亚克鲜重植物样品中的油菜素甾醇的绝对回收率达到80％以上。

附图说明

图1为实施例1所述前处理方法对样品处理后获得的色谱-质谱检测谱图。其中，组分1-5分别为：24-epibrassinolide、24-epicastasterone、teasterone、typhasterol、6-deoxo-24-epicastasterone。

具体实施方式

本发明的具体实施方式包括以下几个步骤：

(1)将植物样品与c18键合硅胶颗粒或c8键合硅胶颗粒装入离心管内混合，在液氮下研磨；植物样品与硅胶颗粒的质量比为1:1～1:6；

(2)离心管内加入提取溶剂乙腈或乙腈-水混合溶液，在0℃～4℃下离心2min～10min，对植物样品中的油菜素甾醇进行提取，获得上清液a；其中提取溶剂与硅胶颗粒的体积质量比(ml/g)为12:1～50:1；

(3)将获得的上清液a转移盛有固体吸附剂2的离心管内，在0℃～4℃下再次离心，去除上清液a中基质杂质，获得上清液b；也可直接将固体吸附剂2添加至上一步骤的离心管内进行离心，以降低样品转移带来的组分损失；固体吸附剂2为阳离子交换吸附剂与阴离子交换吸附剂的组合，且植物样品与固体吸附2的质量比为1:1～1:6，优选1:4；

(4)将上清液b转移至反应容器内，加入衍生试剂，衍生试剂在反应溶液中的浓度为0.1～10mg/ml，对油菜素甾醇分子进行衍生，反应温度为50℃～100℃；其中，衍生试剂为氨基苯硼酸及其衍生物、吡啶硼酸及其衍生物中的一种；采用氨基苯硼酸时，其溶剂中含有1％～10％(v/v)吡啶。

(5)衍生反应结束后，对产物溶液进行吹干并复溶于有机溶剂中，用于油菜素甾醇的色谱分析检测；或直接将反应后的溶液用于色谱分析检测。用于复溶的有机溶剂根据色谱分离条件进行选择。

下面结合具体实施例来说明本发明，在此本发明的示意性实施例以及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。

实施例1拟南芥叶片的前处理

(1)将2mg拟南芥叶片与8mgc8键合硅胶颗粒在离心管内混合，加入液氮用石英玻璃棒进行研磨；

(2)在离心管内加入200微升80％(v/v)乙腈水溶液，在4℃下离心5min，获得上清液a；

(3)将上清液a转移至盛有固体吸附剂2的离心管内，在4℃下离心3min，获得上清液b；其中固体吸附剂2为4mg市售混合阴离子交换吸附剂和4mg混合阳离子交换吸附剂的组合；

(4)将上清液b转移至反应容器内，加入50微升2mg/ml氨基苯硼酸溶液进行衍生，其中氨基苯硼酸溶液的溶剂为含有6.8％(v/v)吡啶的乙腈；

(5)衍生反应结束后，对产物溶液进行吹干并复溶于乙腈中，用于液相色谱-质谱分析检测油菜素甾醇，仪器条件同文献(journalofchromatographya,2016,1456,105-112)。

图1为获得的色谱-质谱分析谱图，可以看出，五种油菜素甾醇能够完全分离。

实施例2水稻叶片的前处理

(1)将0.1mg水稻叶片与0.4mgc18键合硅胶颗粒在离心管内混合，加入液氮用石英玻璃棒进行研磨；

(2)在离心管内加入20微升乙腈，在4℃下离心5min，获得上清液a；

(3)在上述离心管内继续添加固体吸附剂2，在4℃下再次离心5min，获得上清液b；其中固体吸附剂2为0.1mg市售强阴离子交换吸附剂和0.1mg强阳离子交换吸附剂的组合；

(4)将上清液b转移至反应容器内，加入20微升2mg/ml氨基苯硼酸在80℃下衍生反应10min，其中氨基苯硼酸溶液的溶剂为含有2％(v/v)吡啶的乙腈；

(5)衍生反应结束后，将产物溶液直接进样到液相色谱-质谱联用仪分析检测油菜素甾醇，仪器条件同文献(journalofchromatographya,2016,1456,105-112)。