一种基于细胞外泌体纳米簇探针及其在制备细胞靶向荧光和磁性多模态成像制剂中的应用的制作方法

本发明属于生物分析检测技术领域，具体涉及一种基于细胞外泌体纳米簇探针及其在制备细胞靶向荧光和磁性多模态成像制剂中的应用。

背景技术：

目前，癌症仍然是仅次于心血管疾病的主要死亡原因。在各种类型的癌症中，肺癌的死亡率最高，其次是直肠癌和胃癌。在2015年，胃癌被列为第5大癌症，导致81.9万人死亡。研究发现，如果能在癌细胞转移到重要器官前得到诊断，病人的存活率可以得到明显的提高。因此，早期诊断对于癌症的治疗具有重要的意义。到目前为止，多种生物成像技术已被应用于癌症的检测，主要包括计算机断层扫描(ct)、磁共振成像(mri)、超声、荧光共振能量转移、正电子发射计算机断层图像(pet)、光学成像和荧光生物成像等。

近几十年，纳米材料被逐渐应用于生物成像以及靶向载药等领域并展示了良好的前景。尽管如此，纳米材料对于器官的毒性作用仍是一个不可回避的问题。众所周知，细胞与组织之间通过近旁分泌、旁分泌和内分泌进行相互交流，在这个过程中，细胞所分泌的微纳米膜结合体，即胞外膜泡起着重要的作用。在100纳米以下的胞外膜泡被称为外泌体，它是由细胞内体腔的内胚层产生的。胞外膜泡的组成主要取决于细胞的类型和环境。据报道，包括线粒体、信使rna、rna、蛋白质、病毒在内的各种细胞器都有胞外膜泡。胞外膜泡可以通过吞噬、接受药物治疗和直接融合到目标细胞膜中来运输货物。因此，在现代疗法中，它们的作用是不可忽视的。此外，外泌体上的蛋白质和核酸具有特异性和选择性，可以用来负载特定的物质。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供基于细胞外泌体纳米簇探针，该探针生物相容性好，荧光稳定，可以方便和精准快捷地荧光标记和检测出相关外泌体。

本发明还提供基于细胞外泌体纳米簇探针及其在制备细胞靶向荧光和磁性多模态成像制剂中的应用。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述基于细胞外泌体纳米簇探针，包括金属荧光纳米簇探针或磁性纳米簇探针或者两者的组合探针；所述纳米簇探针包括金属荧光纳米簇探针或磁性纳米簇探针或者两者的组合探针；所述金属荧光纳米簇探针以金属离子作为金属离子前驱物，以细胞的外泌体作为运输体载体，形成基于细胞外泌体的金属纳米簇荧光探针；所述磁性纳米簇探针以铁离子作为金属离子前驱物，以细胞的外泌体作为运输体载体，形成基于细胞外泌体的金属磁性纳米簇探针；所述组合探针以铁离子和其他金属离子组合作为金属离子前驱物，以细胞的外泌体作为运输体载体，形成基于细胞外泌体的金属荧光纳米簇和磁性纳米簇探针。

其中，所述其他金属离子为重金属离子。

所述金属离子为金离子、银离子、铂离子、铜离子、钒离子或锌离子中任意一种或两种。

基于细胞外泌体的金属荧光纳米簇和磁性纳米簇探针，一般选用铁离子和其他金属离子如金离子、银离子、铂离子、铜离子、钒离子或锌离子中任意一种组合作为金属前驱物。优选采用金和铁离子。其中金离子的浓度为10-100umol/l，铁离子的浓度为10-100umol/l，优选金离子的浓度为50umol/l，铁离子的浓度为50umol/l。

其中，所述细胞的外泌体为肿瘤细胞的外泌体或者心血管疾病细胞外泌体。该探针生物相容性好，荧光稳定，对肿瘤细胞的的外泌体或者心血管疾病细胞外泌体可以进行荧光标记和检测；尤其对胃癌细胞具有良好的选择性，能够良好地选择性标记胃癌细胞的外泌体。

其中，所述纳米簇探针荧光激发波长为420或480nm，发射波长为580nm或680nm，且不会根据激发波长的变化而改变。

本发明所述的基于细胞外泌体纳米簇探针在制备细胞靶向荧光和磁性多模态成像制剂中的应用。

其中，所述细胞靶向荧光和磁性多模态成像制剂包括基于细胞外泌体金属荧光纳米簇探针和磁性纳米簇探针以及硒离子。其中硒离子的浓度为10-50umol/l，优选硒离子的浓度为30umol/l。

本发明所述的细胞靶向荧光和磁性多模态成像制剂在外泌体荧光成像中的应用。

细胞靶向荧光和磁性多模态成像制剂主要是应用于细胞的外泌体荧光成像，可以有效的检测出外泌体，尤其是肿瘤细胞的外泌体；对于肿瘤细胞外泌体通过细胞靶向荧光成像制剂可以有效地荧光成像，在成像的同时甚至可以诱导胃癌细胞凋亡，同时保护正常细胞。

本发明通过基于细胞外泌体纳米簇探针或者细胞靶向荧光和磁性多模态成像制剂在外泌体荧光成像可以直接在细胞内检测标记的外泌体。

在细胞内直接检测标记的外泌体，具体步骤为包括如下步骤：将细胞和金属离子前驱物或者细胞和金属离子前驱物以及硒离子共同培养24小时后，低速离心分离并收集细胞并用磷酸缓冲溶液洗涤三次，通过荧光共聚焦显微镜或高内涵共聚焦荧光显微镜观察。

本发明探针标记的外泌体，可以通过如下方法分离检测：将细胞和金属离子前驱物以及硒离子共同培养24小时后，低速离心弃去细胞，然后再高速离心收集上清液并滤膜对其进行过滤以除去杂质，最后超高速低温离心内得到外泌体，通过透射电子显微镜下观察。

本发明的基于细胞外泌体的金属纳米簇探针以金铁离子作为前驱物，金等金属离子被还原生成金属荧光纳米簇探针，铁离子与细胞外泌体中的ros自由基作用生成了氧化铁磁性纳米探针，利用肿瘤细胞的外泌体来生成并负载具有荧光特性的纳米簇从而对细胞外泌体进行原位、实时的标记。本发明利用透射电子显微镜、傅立叶变换红外、x光电子能谱对提取出来的外泌体进行表征可以明显观察到金属纳米簇的形成。此外，通过向细胞内引入金属荧光纳米簇探针和磁性纳米簇探针以及硒离子制成的细胞靶向荧光和磁性多模态成像制剂可以有效地标记细胞的外泌体，不仅可以对于心血管疾病细胞或者肿瘤细胞如胃癌细胞标记成像，还可以抑制心血管疾病细胞或者肿瘤细胞的增殖并保护正常细胞。通过对表达基因进行测试发现在引入金属荧光纳米簇探针和磁性纳米簇探针以及硒离子之后细胞内的金属结合基因以及肿瘤消除基因出现了明显的上调。

在本发明试验中采用的是肿瘤细胞，如胃癌细胞的进行外泌体标记和检测，对其他的细胞的外泌体同样可行有效。

有益效果：与现有技术相比本发明具有如下优点：

本发明的基于细胞外泌体纳米簇探针具有良好的具有良好的化学、磁学或光学稳定性以及生物相容性，该外泌体纳米簇探针利用细胞的外泌体作为运输的载体，通过向细胞内引入相关金属离子前驱物，可以选择性地在细胞内部形成具有荧光和磁性的纳米簇探针进而标记细胞外泌体。通过向细胞内引入金属荧光纳米簇和磁性纳米簇探针以及硒离子制成的细胞靶向荧光和磁性多模态成像制剂除了可以有效地标记细胞的外泌体，还可以进一步地诱导细胞凋亡，保护正常细胞。通过检测细胞内的基因表达可以发现引入金属荧光纳米簇和磁性纳米簇探针以及硒离子可以引起金属结合基因以及肿瘤消除基因的上调。

本发明基于细胞外泌体的纳米簇探针制备方法简单方便，原料来源广泛；同时该探针用于细胞外泌体的检测简便易行、快速，直观，毒性低、灵敏度高。

附图说明

图1是本发明标记的细胞外泌体的透射电子显微镜图像；

图2是本发明的金属纳米簇探针用于胃癌细胞原位自成像的荧光共聚焦显微图；

图3是本发明的金属纳米簇探针用于胃癌细胞原位自成像的高内涵共聚焦荧光显微镜图；

图4是本发明的金属纳米簇探针用于活体动物成像的荧光图；

图5是本发明的金属纳米簇探针的荧光图谱和粒径分布关系图；

图6是胃癌细胞在经过金属纳米簇探针处理之后的各项表达基因的变化情况关系图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

将细胞(sgc-7901、hela、hepg2和l02)培养在6孔板中达到90％的覆盖度，然后分别加入50umol/l氯金酸5ul、50umol/l氯化亚铁溶液5ul，将细胞和金属离子前驱物共同培养24小时后和48小时后，分别在2000g下离心20分钟离心弃去细胞，然后在10000g下离心收集上清液并用0.22微米的滤膜对其进行过滤以除去杂质，最后用12万g的离心力在4℃的温度下离心70分钟内得到外泌体，并在jeol2100透射电子显微镜下观察其形貌，结果如图1所示。从图1中可以看到在40纳米的外泌体周围包裹了一层金铁纳米簇，其中金纳米簇的粒径约为3纳米，铁纳米簇的粒径约为5纳米。

实施例2

实施例2与实施例1方法相同不同之处在于，将金离子和铁离子替换成10umol/l铂离子和10umol/l铜离子，制成基于细胞外泌体铂、铜荧光纳米簇探针。

实施例3

实施例2与实施例1方法相同不同之处在于，将金离子和铁离子替换成100umol/l银离子和100umol/l锌离子，制成基于细胞外泌体银、锌荧光纳米簇探针。

实施例4

实施例2与实施例1方法相同不同之处在于，将金离子和铁离子替换成100umol/l铁离子，制成基于细胞外泌体氧化铁磁性纳米探针。

实施例5

将sgc-7901、hela、hepg2和l02细胞株分别置于含有体积分数10％胎牛血清的dmem(链霉素100μg/ml青霉素100iu/ml)培养基中，于37℃、含有5％co2，95％湿度的培养箱中培养。成像前，把细胞放到培养在6孔板中达到90％的覆盖度，分别加入50umol/l氯金酸5ul、50umol/l氯化亚铁溶液5ul，共同培养24小时后，以3000转的速度分离并收集细胞并用磷酸缓冲溶液洗涤三次，进行荧光共聚焦显微镜成像，结果如图2所示。从图2可以看出利实验结果表明，经过金、铁纳米簇探针标记过的sgc-7901细胞，可以看到细胞质内有明显荧光增强，说明本发明的金属荧光纳米簇和磁性纳米簇探针，如金、铁纳米簇探针可以选择性地标记胃癌细胞同时伴随着细胞内自由基水平的变化。

同样采用相同的方法，分别加入50umol/l氯金酸5ul、50umol/l氯化亚铁溶液5ul以及30umol/l亚硒酸钠5ul，共同培养24小时后，以3000转的速度分离并收集细胞并用磷酸缓冲溶液洗涤三次，进行荧光共聚焦显微镜成像，结果如图2所示。从图2可以看出利实验结果表明，通过向细胞内引入金属荧光纳米簇和磁性纳米簇探针以及硒离子制成的细胞靶向荧光和磁性多模态成像制剂可以有效地标记细胞的外泌体，可以选择性地标记胃癌细胞外泌体同时伴随着细胞内自由基水平的变化，并且效果更好。

实施例6

将sgc-7901、hela、hepg2和l02细胞株分别置于含有体积分数10％胎牛血清的dmem(链霉素100μg/ml青霉素100iu/ml)培养基中，于37℃、含有5％co2，95％湿度的培养箱中培养。成像前，把细胞放到培养在6孔板中达到90％的覆盖度，分别加入50umol/l氯金酸5ul、50umol/l氯化亚铁溶液5ul，共同培养24小时，以3000转的速度分离并收集细胞并用磷酸缓冲溶液洗涤三次，并在高内涵成像系统下连续观察培养24小时内的情况，同时记录荧光强度，实验结果如图3所示。从图3可以看出sgc-7901、hela、hepg2和l02细胞在加入荧光探针后24小时之间的荧光强度变化，在整个过程中细胞的荧光强度随着时间不断增强，证明基于细胞外泌体的金属荧光纳米簇和磁性纳米簇探针具有良好的选择性。

实施例7

活体实验在3周大的裸鼠上进行(北京大学健康科学部提供，平均体重为18-20克)。将浓度为5x10⁷ml^-1的scg-7901肿瘤细胞的fbs悬浮液皮下注射在裸鼠的胸外侧。4周后，可以形成了明显的肿瘤。将裸鼠分成实验组和对照组，每组3只老鼠。通过尾静脉注射向裸鼠注射100umol/l氯金酸2ul、100umol/l氯化亚铁溶液2ul以及50umol/l亚硒酸钠1ul，评价0-48h其自成像的能力，并每隔一段时间拍摄活体荧光图像，结果如图4所示。从图中可以看出在注射金属前驱物和硒离子之后，小鼠肿瘤部位的荧光逐渐增强，并在第24小时达到最大值，通过离体器官成像可以发现荧光主要集中于肿瘤上，证明该探针结合硒离子的具有良好的靶向性。

实施例8

将细胞(sgc-7901、hela、hepg2和l02)培养在6孔板中达到90％的覆盖度，然后将分别加入50umol/l氯金酸5ul、50umol/l氯化亚铁溶液5ul以及30umol/l亚硒酸钠5ul，加入到培养基中以诱导细胞原位合成纳米簇。在培养24小时之后，以3000转的速度分离并收集细胞并用磷酸缓冲溶液洗涤三次。然后利用冻融法得到原位生物合成的纳米簇。

取一定量的原位生物合成的金纳米簇用相应的溶剂如超纯水或者磷酸缓冲溶液稀释并加到干净的4ml石英比色皿中，用420nm激发波长测量，结果如图5a所示。从图5a可以看出从细胞内提取的纳米簇在420nm波长的激发下发射580nm的荧光，此外激发波长480nm时，发射波长为680nm，且不会根据激发波长的变化而改变。

用冻融法提取出细胞内原位合成的纳米簇，经过离心分离后将其分散于乙醇中。将悬浮液滴在洁净的铜网上，待干燥后在jeol2100透射电子显微镜下观察纳米簇的形貌以及粒径。结果如图5b所示。从图5b可以看出纳米簇的粒径分布均一，主要集中在2.3纳米左右。

实施例9

将sgc-7901和l02细胞培养在6孔板中达到90％的覆盖度，分别加入50umol/l氯金酸5ul、50umol/l氯化亚铁溶液5ul以及30umol/l亚硒酸钠5ul，共同培养24小时后，以3000转的速度分离并收集细胞并用磷酸缓冲溶液洗涤三次，然后用pbs和试剂进行清洗以分离rna，并存储在零下196℃的环境中以进行进一步实验。使用微阵列测试sgc-7901和l02细胞mrna之间的差别，实验结果如图6所示。由图6结果可知，胃癌细胞在经过荧光探针处理之后的各项表达基因发生变化，其中金属结合基因和细胞消融基因的表达出现了明显的上调，证明基于细胞外泌体的金属荧光纳米簇和磁性纳米簇探针以及硒离子可以在诱导细胞荧光成像的基础上进一步杀灭癌细胞。