一种基于径向偏振光束的手性和频产生显微镜及成像方法与流程

本发明涉及显微镜技术，具体涉及一种基于径向偏振光束的手性和频产生显微镜及其成像方法。

背景技术：

手性光学显微成像技术在生物成像、材料表征等领域有广泛的应用并产生了重大的影响。其中手性和频产生显微镜是一种在点扫描式显微镜的基础上，利用被成像手性物质本身的非线性光学性质进行成像的显微技术，相较于其他类型的手性光学显微技术，其不需要对样品进行标记就同时具有化学、手性特异性，因此其灵敏度足以探测被埋没在表面以下的手性单分子层，可对细胞、药物、人工微结构等材料进行实时的非标记成像，在生物成像、表面科学等领域有重要的应用，并在纳米材料研究以及光存储领域提供了一种新的可行的方法。

手性和频产生显微技术需要角频率不同的两束超快光脉冲进行照明。两束线性偏振光其中一束为第一激发光(其角频率为ω1，电场为)，另一束光为第二激发光(其角频率为ω2，电场为)。两束光经过透镜或显微物镜聚焦后，其焦点重合在手性样品中同一位置进行激发，利用样品本身的非线性光学性质，产生一束角频率等于两束激发光角频率之和的和频信号光(其角频率为ωs＝ω1+ω2，电场为)，随后通过探测信号光的强度、偏振、相位信息来获得具有手性特异性的衬比度，并将焦点在样品中扫描进行成像。

目前手性和频产生显微的装置必须使用两束激发光不共线的光路设置，即两束光交叉聚焦在样品中，因此难以集成到具有唯一的光轴的显微镜里，进而通常只使用数值孔径较小的单透镜进行聚焦，导致分辨率较低，在10～100微米左右。而必须使用非共线激发光路的原因在于，手性和频产生的基础原理要求：即信号光的偏振方向必然垂直于第一、第二激发光偏振所在的平面，且电场大小正比于E1·E2·sinθ(θ为的夹角)。假如两束激发光共线沿显微镜光轴传播且偏振相互平行那么聚焦焦点处不产生信号；假如两束激发光共线沿光轴传播且偏振相互垂直那么焦点处信号光的偏振就必须沿着光轴的方向排布，考虑到光是横波，所以这一纵向偏振的信号光不能沿着光轴传播，而是主要向横向辐射，无法到达探测器中。只有两束激发光交叉聚焦到同一点，才可能在满足三束光偏振两两正交的前提下，让信号光沿光轴传播到探测器。

近年来，为了将手性和频产生引入到显微镜系统中，已有人尝试过令两束激发光平行排布错开一定间距，且光束的直径必须小于显微物镜的入瞳直径，并分别从显微物镜光轴的两侧离轴入射，通过物镜后，两光交叉聚焦在同一点，获得了亚微米的横向分辨率。但其本质还是非共线光路设置，由于没能用满显微物镜的数值孔径，其空间分辨率还是不能达到衍射极限的水平，且由于激发光在物镜孔径中的分布并非旋转对称，所以在相互垂直的两个方向有不同的分辨率，另外将非共线的两束光的焦点调重合比共线情形更加困难。

技术实现要素：

针对以上现有手性和频显微技术中由于使用非共线光路导致分辨率较低的问题，本发明提出了一种利用径向偏振光束被紧聚焦后在焦点处能产生纵向偏振电场的特性，将其中一束激发光变为径向偏振光束，从而在两束激发光共线排布的情形下产生能沿光轴传播的手性和频产生信号光，且两激发光都用满显微物镜的数值孔径从而达到衍射极限的分辨率。

本发明的一个目的在于提出一种基于径向偏振光束的手性和频产生显微镜。

本发明的基于径向偏振光束的手性和频产生显微镜包括：第一激发光光源、第二激发光光源、第一激发光扩束准直系统、第二激发光扩束准直系统、光程延迟系统、径向偏振光束产生系统、合束系统、激发物镜、收集物镜、压电扫描系统和信号光探测系统；其中，样品设置在压电扫描系统上，并且样品位于激发物镜与收集物镜之间；收集物镜连接至信号光探测系统；第一和第二激发光光源分别输出第一激发光和第二激发光，第一和第二激发光分别为波长不同的两束脉冲光；第一激发光经第一激发光扩束准直系统扩大光斑直径使得光束能够充满激发物镜的入瞳；光斑直径扩大后的第一激发光经径向偏振光束产生系统将线偏振光转变为径向偏振光束，入射至合束系统；第二激发光经第二激发光扩束准直系统扩大光斑直径使得光束能够充满激发物镜的入瞳，入射至合束系统；变成径向偏振光束的第一激发光经合束系统透射，与经合束系统反射的第二激发光合束；合束光经激发物镜聚焦后入射至样品上；在第一激发光的光路上或者在第二激发光的光路上设置光程延迟系统，使得第一激发光和第二激发光同时到达样品；通过调整合束系统，使得合束后的两束激发光的焦点在垂直于光轴的方向重合，并通过调整第一激发光扩束准直系统和第二激发光扩束准直系统，使得合束后的两束激发光的焦点在平行于光轴的方向重合，焦点位于样品上，从而两束激发光精确共线合束后充满激发物镜的入瞳，聚焦到样品上；第一激发光为径向偏振光束，在焦点处产生沿光轴方向纵向偏振的电场，配合线性偏振的第二激发光共同激发，从而在两束激发光共线排布的情形下产生了能沿光轴传播的手性和频产生信号光；通过压电扫描系统扫描样品，手性和频产生信号光由收集物镜收集后，传输至信号光探测系统，从而得到样品的图像。

第一激发光光源和第二激发光光源采用同一个激光器分别输出波长不同的两束脉冲光；或者采用两个重复频率互相锁定的超快脉冲激光器，脉冲光的频率为皮秒或飞秒。

光程延迟系统包括精密位移平台和两个安放在其上的反射镜，将输入的激光延平行于入射方向的反方向输出，从而改变光在其中的光程，但不改变激光离开光程延迟系统的方向。

径向偏振光束产生系统采用向列液晶元件或亚波长光栅直接将输入的线性偏振光束转化为径向偏振光束；或者通过相干叠加的方式，将输入的线性偏振光分为两束拓扑荷、圆偏方向都相反的圆偏振光再进行叠加得到，或者将输入的线性偏振光分为两束相互正交的厄米高斯(1,0)模式光束再进行叠加得到。

合束系统包括一个表面无镀膜的分束片，其中径向偏振的第一激发光从分束片上透射，线性偏振的第二激发光从分束片上反射，两束光精确共线合束。

收集物镜与激发物镜构成共轴共焦系统，将焦点处产生的手性和频产生信号光收集并准直。

信号光探测系统包括滤光片、偏振片、耦合透镜、耦合光纤、单色仪、CCD相机和单光子计数器。

样品采用石英晶体或生物蛋白等具有手性的材料，从而激发出手性和频产生信号光。

本发明的另一个目的在于提供一种基于径向偏振光束的手性和频产生显微镜的成像方法。

本发明的基于径向偏振光束的手性和频产生显微镜的成像方法，包括以下步骤：

1)第一和第二激发光光源分别输出第一激发光和第二激发光，第一和第二激发光分别为波长不同的两束脉冲光；

2)第一激发光经第一激发光扩束准直系统扩大光斑直径使得光束能够充满激发物镜的入瞳；

3)光斑直径扩大后的第一激发光经径向偏振光束产生系统将线偏振光转变为径向偏振光束，入射至合束系统；第二激发光经第二激发光扩束准直系统扩大光斑直径使得光束能够充满激发物镜的入瞳，入射至合束系统；

4)变成径向偏振光束的第一激发光经合束系统透射，与经合束系统反射的第二激发光合束；

5)合束光经激发物镜聚焦后入射至样品上；在第一激发光的光路上或者在第二激发光的光路上设置光程延迟系统，使得第一激发光和第二激发光同时到达样品；通过调整合束系统，使得合束后的两束激发光的焦点在垂直于光轴的方向即横向重合，并通过调整第一激发光扩束准直系统和第二激发光扩束准直系统，使得合束后的两束激发光的焦点在平行于光轴的方向即纵向重合，焦点位于样品上，从而两束激发光精确共线合束后充满激发物镜的入瞳，聚焦到样品上；

6)第一激发光为径向偏振光束，在焦点处产生沿光轴方向纵向偏振的电场，配合线性偏振的第二激发光共同激发，从而在两束激发光共线排布的情形下产生了能沿光轴传播的手性和频产生信号光；

7)通过压电扫描系统扫描样品，手性和频产生信号光由收集物镜收集后，传输至信号光探测系统，从而得到样品的图像。

本发明的优点：

本发明采用第一激发光为径向偏振光束，在焦点处产生沿光轴方向纵向偏振的电场，配合线性偏振的第二激发光共同激发，从而在两束激发光共线排布的情形下产生了能沿光轴传播的手性和频产生信号光；第一激发光为径向偏振光束，与第二激发光覆盖激发物镜的入瞳，从而样品的图像达到衍射极线的分辨率，并且第一与第二激发光在激发物镜中的分布是旋转对称的，因此样品的图像具有均一的横向分别率；本发明能够在共线光路设置中实现手性和频产生，明显降低了光路调节难度，而且消除了手性和频产生显微技术与其他显微技术相集成的障碍，可作为多模态显微镜的一部分。

附图说明

图1为本发明的基于径向偏振光束的手性和频产生显微镜的一个实施例的示意图；

图2为本发明的手性和频产生显微镜的成像原理图与现有技术成像原理图的对比示意图，其中，(a)为本发明采用线偏振和径向偏振光束共线激发手性和频产生信号光对激发物镜的入瞳利用程度的原理示意图，(b)为现有技术采用两束线偏振光非共线激发时对激发物镜的入瞳利用程度的原理示意图；

图3(a)～(f)为本发明的基于径向偏振光束的手性和频产生显微镜沿x、y和z方向用刀片法进行的分辨率表征以及与现有技术即非共线设置下的对比图。

具体实施方式

下面结合附图，通过具体实施例，进一步阐述本发明。

如图1所示，本实施例基于径向偏振光束的手性和频产生显微镜包括：第一激发光光源1、第二激发光光源2、第一激发光扩束准直系统3-1、第二激发光扩束准直系统3-2、径向偏振光束产生系统5、光程延迟系统4、合束系统6、激发物镜7、收集物镜9、压电扫描系统8和信号光探测系统10；其中，样品设置在压电扫描系统8上，并且样品位于激发物镜7与收集物镜9之间；收集物镜9连接至信号光探测系统10。

在本实施例中，第二激发光光源2为钛宝石飞秒激光器，输出重复频率80MHz、脉宽90fs、波长820nm的飞秒脉冲光，用于泵浦第一激发光光源1，泵浦剩余的820nm光作为第二激发光；第一激发光光源1为接在第二激发光光源2上的光学参量振荡器，输出80MHz、脉宽90fs、波长520nm的飞秒脉冲光作为第一激发光，因此信号光波长为318.2nm；径向偏振光束产生系统5使用一个偏振片和一个向列液晶元件，给第一激发光的横截面上不同位置施加不同的偏振旋转，从而将输入的线性偏振光转化为径向偏振光。合束系统6中的分束片使用材质为硝化纤维的薄膜，对第一激发光透射率>95％，对第二激发光反射率>10％，薄膜表面没有额外的镀膜，以避免给径向偏振光束中不同偏振分量引入不同的相位突变。激发物镜7为100倍、数值孔径1.4的油浸物镜，收集物镜为40倍、数值孔径0.4的紫外物镜，对信号光透过率>90％。信号光探测系统10包含用于检偏的alpha-BBO格兰激光偏振棱镜、用于滤除820nm、520nm激发光的紫外滤波片、用于光纤耦合的紫外凸透镜、用于将信号光导入单色仪的光纤集束、用于探测信号光光谱的液氮制冷CCD以及用于快速成像的单光子计数器。

第一和第二激发光光源分别输出第一激发光和第二激发光，第一和第二激发光分别为波长不同的两束脉冲光；第一激发光经第一激发光扩束准直系统扩大光斑直径使得光束能够充满激发物镜的入瞳；光斑直径扩大后的第一激发光经径向偏振光束产生系统将线偏振光转变为径向偏振光束，入射至合束系统；第二激发光经第二激发光扩束准直系统扩大光斑直径使得光束能够充满激发物镜的入瞳，入射至合束系统；变成径向偏振光束的第一激发光经合束系统透射，与经合束系统反射的第二激发光合束；合束光经激发物镜聚焦后入射至样品上；在第一激发光的光路上或者在第二激发光的光路上设置光程延迟系统，使得第一激发光和第二激发光同时到达样品；通过调整合束系统，使得合束后的两束激发光的焦点在垂直于光轴的方向重合，并通过调整第一激发光扩束准直系统和第二激发光扩束准直系统，使得合束后的两束激发光的焦点在平行于光轴的方向重合，焦点位于样品上，从而两束激发光精确共线合束后充满激发物镜的入瞳，聚焦到样品上；第一激发光为径向偏振光束，在焦点处产生沿光轴方向纵向偏振的电场，配合线性偏振的第二激发光共同激发，从而在两束激发光共线排布的情形下产生了能沿光轴传播的手性和频产生信号光；通过压电扫描系统扫描样品，手性和频产生信号光由收集物镜收集后，传输至信号光探测系统，从而得到样品的图像。

径向偏振光束产生系统中的向列液晶元件要求入射光的偏振精确对准其工作方向，为了获得最佳质量的径向偏振光束，具体调节方式为：每微调一次向列液晶元件之前偏振片的方向，都用另一偏振片在向列液晶元件之后旋转一周检偏，观察透过的双扇形光斑，直到双扇形光斑亮保持度恒定定且形状对称，然后撤去向列液晶元件之后的偏振片。

第一和第二激发光的经过激发物镜聚焦后的焦点需要精确重合，具体过程是，使用石英晶片等具有手性的样品产生手性和频产生信号光，并调整合束系统6中分束片的俯仰角和偏航角，使信号光强度最大来完成横向的精确重合；随后调整第二激发光扩束准直系统3-2中透镜对的间距使信号光强度最大来完成纵向的精确重合。

激发物镜7和收集物镜9需要满足共轴共焦关系，调整过程为：令第一激发光通过激发物镜7和收集物镜9，调整收集物镜9的与激发物镜7的距离，使第一激发光被准直，并调节收集物镜9的俯仰、偏航角，使被准直的第一激发光沿光轴方向出射且光斑旋转对称。

如图2为本发明的共线激发与现有技术的非共线激发对比图，xyz以及ijk分别为正交的笛卡尔坐标系，其中z轴为光轴。图2(a)为本发明的共线激发示意图，第一激发光01为径向偏振光束，经过激发物镜聚焦后在焦点处产生沿光轴z方向偏振的电场第二激发光02为线性偏振光束，经过激发物镜聚焦后在焦点处产生沿x方向偏振的电场从而激发出手性和频产生信号光，具有沿y方向偏振的电场可沿光轴向前传播并被收集到探测器。此时两束激发光都完全覆盖激发物镜的入瞳，从而样品的图像达到衍射极线的分辨率，并且第一和第二激发光在激发物镜中的分布是旋转对称的，因此样品的图像具有均一的横向分别率。图2(b)为现有技术的非共线的光路设置。第一和第二激发光01和02都是线性偏振光，两者平行错开一定间距，分别从激发物镜孔径的两侧进入激发物镜，经过激发物镜聚焦后，交叉聚焦至同一点，分别产生沿k和j方向偏振的电场和由此激发出手性和频产生信号光，具有沿i方向偏震荡电场可沿光轴向前传播并被收集到探测器。但是此时两束激发光都没有充满激发物镜的入瞳，样品的图像达不到衍射极限分辨率，且第一和第二激发光在激发物镜中的分布不是旋转对称的，因此沿着x和y方向，样品的图像具有不同的分辨率。

如图3所示是通过使用刀片法分别测量x、y和z(z为光轴)方向空间分辨率所得的跃变曲线，以及由此计算得到的分辨率。起刀片作用的为一个制备在熔融石英片表面的立方形液体槽，边长为5微米。将联萘酚溶解在四氢呋喃中作为手性样品，导入槽中。该溶液具有手性，可产生手性和频产生信号光；熔融石英没有手性，不能产生手性和频产生信号光。因此液体槽的底面和侧立面分别形成了沿x、y和z方向的且从能产生信号到不能产生信号的跃变界面。使用这三个界面分别沿垂直于界面的方向扫描过激发光焦点，并同步记录探测器探测到的手性和频产生信号光的光强，即为图中的方形点及误差线。另一方面利用矢量衍射理论，在实验条件参数下可计算出手性和频产生信号光产生区域的三维分布，并进行虚拟的刀片法得到理论上沿x、y和z方向的跃变曲线。随后不断调整模拟计算的参数，直至计算得到的跃变曲线与实验结果拟合，就认为此时模拟计算的手性和频产生信号光产生区域与实验中一致，从而直接读出该区域的半高全宽数值，作为该方向上的分辨率数值。(a)、(c)和(e)分别为本发明使用线性偏振和径向偏振光共线激发情形下，沿x、y和z方向的测量和拟合结果；(b)、(d)和(f)分别为现有技术即两束线性偏振光非共线激发情形下，沿x、y和z方向的测量和拟合结果。可以看出本发明的基于径向偏振光束的手性和频产生显微镜在x、y和z方向都具有比现有技术更高的、衍射极限的分辨率，其中z方向分辨率到达了766nm的亚微米水平，并且x和y方向上的分辨率仅相差24nm，相比于非共线情形的177nm，本发明的横向分辨率明显更加均一。

最后需要注意的是，公布实施例的目的在于帮助进一步理解本发明，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附的权利要求的精神和范围内，各种替换和修改都是可能的。因此，本发明不应局限于实施例所公开的内容，本发明要求保护的范围以权利要求书界定的范围为准。