评估人体外受精胚胎质量及差异代谢物的筛选方法与流程

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种基于气相色谱-质谱联用技术评估人体外受精胚胎质量及差异代谢物的筛选方法。

背景技术：

体外受精-胚胎移植(ivf-et)是使不孕患者成功妊娠的重要途径。如何选择具有发育潜能的胚胎是ivf-et成功的关键。目前通常采用形态学方法来评估胚胎的优劣及其发育潜能，即在胚胎发育过程中，在受精后不同的时间点，通过显微镜人工观察胚胎形态学变化，并作出评分，从而推断胚胎的发育潜能。在卵裂期，往往通过细胞数目，碎片形成情况，原核排列及数目，卵裂球的多少和均一性等来评价胚胎的优劣；在囊胚发育阶段，依据囊腔的扩展程度，内细胞团(icm)和滋养层(te)的形态特征来评估囊胚的优劣及其发育潜能。

传统的形态学评估方法虽然为胚胎学家们选择胚胎提供了一定的依据，但是存在较为明显的弊端。在ivf-et临床实践中发现，即使在子宫内膜厚度及宫腔环境较好，激素也符合移植要求的情况下，移植形态学评分较高的优质胚胎也经常不能使患者获得成功妊娠，这就说明仅仅通过形态学特征评估胚胎的优劣具有显著的缺陷。而且，形态学评估往往需要将胚胎从培养箱中取出后观察，用显微镜观察胚胎时，胚胎处于一种非控制的不良环境中，温度、氧气浓度和ph值都将发生变化，胚胎将对这种突如其来的环境变化产生应激，从而影响到胚胎的正常发育。其次，通过胚胎形态学的指标难以发现胚胎染色体及基因的异常。现已证明，染色体异常及非整倍体的出现是导致胚胎发育停滞，种植失败和流产的主要原因。因此，如何筛选最具发育潜力的、染色体正常的胚胎是摆在每个胚胎学家面前亟待解决的重要课题之一。

代谢组学是近年来发展起来的对某一生物或细胞所有低分子质量代谢产物进行定性和定量分析的新学科。它以组群指标分析为基础，以高通量检测和数据处理为手段，以信息建模与系统整合为目标，定量分析特定时期特定生理条件下细胞体系中所有的代谢物，如氨基酸、脂类、核苷酸等，反映生物体系受外部刺激所做出的变化。基于气相色谱-质谱技术(gc-ms)、液相色谱-质谱技术(lc-ms)和毛细管电泳-质谱技术(ce-ms)，筛选疾病组织或细胞中的差异蛋白或代谢物，为疾病的早期发现、临床诊断和预后跟踪发挥了非常重要的辅助作用。可见，运用高效气相色谱-质谱联用技术检测胚胎培养液中的差异代谢物，进而评估体外受精胚胎的健康质量及发育潜能，对临床转化具有重要的参考价值和应用前景。近些年，虽然利用质谱分析技术检测胚胎培养液的代谢物已有相关报道，但是由于受精卵发育至囊胚期的细胞数量少(只有数百个细胞)，代谢产物少，提取困难，检测难度很大，目前还没有建立完善的分析方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于：针对传统的形态学评估方法在人体外受精-胚胎移植健康评估方面存在的不足，采用气相色谱-质谱联用技术从人体外受精正常发育胚胎和发育阻滞胚胎培养液中筛选可用于量化评估胚胎健康状况的差异代谢物，从而为评估体外受精胚胎质量及发育潜能提供新的检测方法和科学依据。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种基于气相色谱-质谱联用技术的人体外受精-胚胎的质量评估差异代谢物的筛选方法，包括如下步骤：

1、首先采用传统的胚胎评分标准，根据卵裂球的大小、均一性、有无碎片对胚胎的卵裂情况进行评分，将胚胎划分为高质量卵裂胚胎组和低质量卵裂胚胎组，同时收集胚胎代谢液。

2、对收集的胚胎代谢液样品进行预处理，并以囊胚培养液作为空白对照进行气相色谱-质谱检测；

3、步骤(1)的胚胎质量评分标准如下，胚胎期评分标准：d1天(受精后16-18小时)根据原核大小、排列、核仁的对称性对受精卵形态进行评分；d2天(受精后44-46小时)，d3天(受精后72小时左右)根据卵裂球的大小，均一性，有无碎片对胚胎的卵裂情况进行评分；d5和d6天根据形成的囊胚情况进行评分，包括：囊胚腔的扩张情况，内细胞团的紧密度及滋养层细胞的排列和多少。

4、步骤(3)的囊胚质量划分标准如下，即i级或早期囊胚：囊腔小于胚胎体积的一半；ii级：囊腔大于胚胎体积的一半；iii级：囊腔基本充满整个胚胎；iv级：囊腔扩大，透明带变薄，iv级：滋养层细胞开始从透明带孵出；iv级：胚胎已从透明带完全孵出。对于iii级至iv级囊胚，根据内细胞团(icm)和滋养层细胞(te)的细胞数，紧密度和排列情况做进一步的评分。

5、步骤(4)的icm分为三个等级：a级(多个icm细胞紧密结合在一起)，b级(少数icm细胞，结合松散)，c级(极少icm细胞)。te也细分为三个等级：a级(te细胞多层，排列成鱼鳞状)，b级(少数te细胞，排列成松散的一层或几层)，c级(极少te细胞)。

6、步骤(2)的胚胎代谢液样品的处理方法如下：取50μl培养液，加入200μl甲醇提取剂(含有终浓度10μg/mltridecanoicacid标准样品)，涡旋震荡60秒混匀，14000rpm，4℃离心15min，收集200μl上清，转移到1.5ml离心管中，真空浓缩干燥6～10小时。

7、步骤(2)所述的胚胎培养液衍生方法如下：加入50μl含有20mg/ml吡啶的甲氧胺溶液()，置于37℃水浴中肟化反应1.5h，以保护羰基；然后加入40μlmstfa试剂，置于37℃水浴中硅烷化反应1h，以增加代谢物的挥发性。硅烷化反应完成后，离心取上清液用于后续的gc-ms分析。

8、所述胚胎代谢液样品和甲醇提取液体积比为1：4。

9、所述胚胎代谢液样品、甲氧胺盐酸盐溶液、mstfa试剂的体积比为1：1：0.8。

10、步骤(2)所述的气相色谱-质谱检测的条件：qp2010gc-ms系统耦合aoc-20i自动进样器(shimadzu,japan)。db-5ms熔融石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm,agilenttechnologies，usa)用于代谢物的色谱分离。进样量1μl，分流比1：10。进样口温度为300℃。氦气(99.9995％，china)作为载气，流速40cm/s，恒线速模式。程序升温条件为：柱温在70℃保持3min，以5℃/min升至300℃，保持10min。质谱调谐采用全氟三丁胺(pftba)，离子化采用70ev的电子轰击电离源(ei)。检测电压依据调谐结果设置。传输线和离子源温度分别为280℃和230℃。溶剂切割时间5.0min，ms采集范围33-600m/z，采集频率4scans/s。

11、对检测结果进行统计分析：分别采用simca-p11.5、mev4.9和spss18.0软件进行pca、heatmap和数据统计分析，比较高质量卵裂胚胎组和低质量卵裂胚胎组的代谢产物，应用t检验来确定差异代谢物。

12、通过优化质谱检测条件，对正常囊胚和破损囊胚的培养液进行代谢产物图谱分析，结果发现：正常发育胚胎与发育阻滞的胚胎培养液中葡萄糖、氨基酸和脂肪酸含量差异较大，尤其是天冬氨酸、缬氨酸、亮氨酸、谷氨酸和丝氨酸等含量存在显著差异，可用来预测胚胎发育潜能的指标。

13、胚胎在发育过程中合成新的代谢产物，发育不良的囊胚培养液中柠檬酸、乳酸和棕榈酸中的一种或二种以上的增量低于3～5％，而发育良好的囊胚柠檬酸、乳酸和棕榈酸中的一种或二种以上的含量可以超过8％。通过定量检测新物质的含量和相对比值，可以评估胚胎的代谢能力和发育潜能。

该方法用于评估人体外受精胚胎质量，为传统形态学评估方法提供参考依据。

本发明的有益效果如下：

筛选具有发育潜能的高质量胚胎是胚胎体外移植技术成功的关键，对临床应用具有重要意义。针对传统形态学评估方法的不足，本发明建立了一种基于高效气相色谱-质谱联用技术评估人体外受精胚胎健康质量的新方法，通过分析胚胎代谢液的组分变化，预测胚胎健康状况及发育潜能，为临床应用提供科学依据。

附图说明

图1不同发育阶段囊胚代谢液热图分析(heatmap)

图2不同发育阶段胚胎代谢液主成分分析(pca)

图3gc-ms检测胚胎代谢液的总tic色谱图

具体实施方式

实施例不同发育时期胚胎培养液差异代谢物分析

以下实验材料及研究方法，经合作医院的伦理委员会审批，并与患者签署了知情同意书。有关胚胎形态学观测和培养液采集均委托合作医院完成，胚胎培养液的代谢组学分析由本单位独立完成。

1、试验材料

试剂：采用vitrolife公司的g-2囊胚培养液，使用前放入37℃、6％co2条件下平衡，补充添加g-mm溶液，用于囊胚的体外培养。矿物油采用ovoil。

(1)胚胎形态学观测：

经阴道超声下取卵，获得的卵子采用微滴受精，其上覆盖适量的矿物油，所有胚胎均在time-lapse实时监测系统(embryoscope^tm)中培养至受精后d5-d6天(囊胚期)。在37℃、6％co2和5％o2的培养条件下，每间隔5分钟对胚胎发育情况进行拍照观察。每个胚胎的图像均采用embryoview软件处理。

所有胚胎发育的时间节点均以卵子受精时间为参照点。对发育到囊胚期的胚胎(d5-d6)，采用传统的评分标准，参照胚胎发育的实时观测图像，依据囊胚腔的扩张情况，内细胞团的紧密度以及滋养层细胞的排列和多少进行评分。

(2)胚胎代谢液采集。收集发育至囊胚期(d5-d6)的正常胚胎以及发育阻滞的胚胎代谢液，50μl/例，立即放入-80℃保存，待gc-ms检测分析。同时采集50μl的囊胚培养液作为空白对照。

2、实验方法

2.1胚胎代谢液提取方法。

(1)胚胎代谢液提取方法。在50μl培养液中添加200μl的甲醇提取液(体积比1：4)，甲醇提取液中含有终浓度为10μg/ml正十三酸(tridecanoicacid)。涡旋震荡60秒混匀，于14000rpm、4℃离心15min，收集200μl上清液，转移到1.5ml离心管，真空浓缩干燥6～10小时。待上机检测。

(2)胚胎代谢液衍生方法。在步骤(1)的冻干样品中，添加50μl含有20mg/ml吡啶的甲氧胺溶液)，置于37℃水浴中肟化反应1.5h，以保护羰基；然后加入40μlmstfa，置于37℃水浴中硅烷化反应1h，以增加代谢物的挥发性。其中，胚胎培养液、甲氧胺盐酸盐溶液和mstfa试剂的体积比为1∶1：0.8。硅烷化反应完成后，离心取上清液用于后续的gc-ms分析。

2.2gc-ms检测分析。气相色谱-质谱检测的条件：qp2010gc-ms系统耦合aoc-20i自动进样器(shimadzu,japan)。db-5ms熔融石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm,agilenttechnologies,usa)用于代谢物的色谱分离。进样量1μl，分流比1:10。进样口温度为300℃。氦气(99.9995％,china)作为载气，流速40cm/s，恒线速模式。程序升温条件为：柱温在70℃保持3min，以5℃/min升至300℃，保持10min。质谱调谐采用全氟三丁胺(pftba)，离子化采用70ev的电子轰击电离源(ei)。检测电压依据调谐结果设置。传输线和离子源温度分别为280℃和230℃。溶剂切割时间5.0min，ms采集范围33-600m/z，采集频率4scans/s。

3、统计分析方法

分别采用simca-p11.5、mev4.9和spss18.0软件进行pca、heatmap和数据统计分析。以囊胚培养液作为空白对照，比较不同发育阶段高质量囊胚和低质量囊胚的代谢产物差异，应用t检验来确定。

4、实验结果与讨论

4.1基于形态学评估的不同质量胚胎代谢液中差异代谢物的分析

结合胚胎形态学观测结果，收集到16例不同发育阶段(3bb、3bc、4bb和4bc)的囊胚培养液，采用gc-ms技术分析培养液中的代谢物，共检测到31种代谢产物(如图1)。实验结果表明，与滋养层细胞分化较好的囊胚(如3bb或4bb)代谢液相比，在滋养层细胞稀疏的囊胚(3bc或4bc)代谢液中，葡萄糖、丙酮酸和棕榈酸等含量普遍较低，天冬氨酸、缬氨酸、亮氨酸、谷氨酸和丝氨酸等的含量显著减少(p<0.05)，提示滋养层细胞的分化程度对胚胎代谢液的组成影响较大，滋养层发育不良的囊胚生存环境不稳定，需要从培养液中吸收更多养分来维持自身生长。而滋养层细胞分化良好的囊胚细胞(如3bb和4bb)，其培养液中的代谢产物并没有明显差异。根据文献报道，氨基酸在胚胎发育的过程中起着重要作用，它不仅可以为胚胎的生长发育提供营养物质，维持渗透压，还可以拮抗活性氧和清除胚胎新陈代谢生成的氨。通过gc-ms方法，分析胚胎代谢液中葡萄糖、氨基酸和脂肪酸等代谢产物的变化，可以间接反映滋养层细胞的发育状况。

4.2不同发育阶段胚胎培养液中代谢产物主成分分析

使用simca-p软件对不同发育阶段胚胎代谢液中的不同代谢产物进行主成分分析(如图2)。结果发现，滋养层细胞状况与培养液中代谢物组成密切相关。对于相同发育阶段的囊胚，滋养层细胞质量较好的代谢液样本与质量较差的样本可以大体分开(如3bb和3bc，4bb和4bc)；而滋养层细胞质量状况相似的囊胚，尽管胚胎发育阶段略有不同(如3bb和4bb，3bc和4bc)，但囊胚代谢液还是不能很好的分开，说明滋养层细胞的分化状态对胚胎代谢液的组成影响较大。可见，通过检测胚胎代谢液中代谢产物的细微变化，可以反映出滋养层细胞的健康质量，进而预测内细胞层的健康状况及发育潜能。虽然主成分分析，能够大体将各组样品进行分离，但无法达到完全分离，可能与采集到的胚胎代谢液样本数量较少有关，还需要通过后续的判别分析进一步研究其差异。

4.3高效气相色谱-质谱联用技术为人体外受精胚胎质量评估提供新方法

在本研究中发现，发育状态良好的囊胚与质量较差、碎片较多的囊胚相比，细胞合成与代谢能力存在明显差异。培养液中主要含有葡萄糖、丙酮酸钠和各种必需氨基酸等物质，满足细胞生长需要。在胚胎发育过程中还会合成很多新的物质，如柠檬酸、乳酸、棕榈酸等，以及少量代谢废物，如尿素等(如表1)。与碎片较多、发育较差的囊胚相比，发育状况良好的囊胚会合成更多的乳酸、甘油和棕榈酸等来满足自身生长的需要，同时产生更多的尿素。与空白培养液相比，发育不良的囊胚培养液中柠檬酸、乳酸和棕榈酸的增加很少，不到5％，而发育良好的囊胚柠檬酸、乳酸和棕榈酸的含量可以超过8％，尤其是尿素的增加更为明显。通过定量检测新物质的含量和相对比值，可以评估胚胎的代谢能力和发育潜能。

表1基于形态学评估的不同发育阶段囊胚代谢产物差异分析

传统的形态学方法，往往通过显微镜下观察细胞数目、碎片形成情况、囊胚腔扩展程度、内细胞团和滋养层的形态特征来评估囊胚的优劣及其发育潜能，因此存在很大的主观性、风险性和不确定性。针对传统形态学方法在胚胎筛选上的不足，本发明采用高效气相色谱-质谱联用技术，通过优化样本预处理方法，调整仪器参数、摸索检测条件，建立了人胚胎代谢液高分辨分析检测方法。结合胚胎形态学评估，筛选出正常发育囊胚与发育阻滞囊胚微量代谢液中的差异代谢物，从而为评估人体外受精胚胎质量及发育潜能提供新的检测方法和科学依据。与常规代谢组学分析方法相比，本发明方法更为灵敏，适用于微量液体样本检测分析，可以检测仅有数百个细胞的囊胚代谢液，并且发现了葡萄糖、丙酮酸和棕榈酸等差异代谢物。通过检测培养液中柠檬酸、乳酸、棕榈酸以及尿素的含量变化，可以筛选出具有发育潜能的高质量胚胎，对临床应用提供科学依据。