基于薄层色谱法的黑豆鉴别方法与流程

本发明涉及制药原料检测领域，特别是涉及基于薄层色谱法的黑豆鉴别方法。

背景技术：

黑豆是骨仙片主要成分之一。其性味甘，平，归脾、肾经。有益精明目，养血祛风，利水，解毒之功。可用于治疗阴虚烦渴，头晕目昏，体虚多汗，肾虚腰痛，水肿尿少，痹痛拘挛，手足麻木，药食中毒。

薄层色谱法(tlc)是一种微量、快速、简便的分离分析方法。系将适宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或铝基片上，成一均匀薄层。待点样、展开后，根据比移值(rf)与适宜的对照物按同法所得的色谱图的比移值作对比，用以进行药品的鉴别、杂质检查或含量测定的方法。该方法是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，也用于跟踪反应进程。具有展开时间短、分离能力强、灵敏度高等特点。

薄层色谱法是评价黑豆质量的主要方法，但是传统的黑豆薄层色谱分析中经常出现检视无斑点、斑点不圆整等现象，为此，需要多次点样、多次展开才能获得鉴别结果，从而难以满足实际生产中对鉴别鉴别效率的要求。

技术实现要素：

基于此，有必要提供一种能够通过一次点样、一次展开、一次检视操作就能够检视到斑点且斑点圆整的黑豆鉴别方法。

一种基于薄层色谱法的黑豆鉴别方法，包括如下步骤：

供试品溶液制备：将待检测黑豆粉碎成粉末，加萃取剂进行萃取，萃取后过滤并蒸干所得滤液得残渣，用溶剂溶解该残渣，得供试品溶液；

药材对照溶液制备：将作为对照药材的黑豆粉碎成粉末，加萃取剂进行萃取，萃取后过滤并蒸干所得滤液得残渣，用溶剂溶解该残渣，得药材对照溶液；

薄层层析：分别吸取所述供试品溶液、药材对照溶液点样于同一硅胶g薄层板上，将所述点样后的硅胶g薄层板先置于展开剂的蒸汽中进行预饱和再置于展开剂中展开，展开后取出晾干，再采用不低于100℃的温度对所述晾干的硅胶g薄层板加热后检视,即可；所述展开剂为甲苯、甲醇、甲酸的混合物。

在其中一些实施例中，对所述晾干的硅胶g薄层板加热的温度不低于110℃。

在其中一些实施例中，所述展开剂的蒸汽的温度小于所述展开剂的沸点。

在其中一些实施例中，所述展开剂为体积比为14:6:0.1的甲苯、甲醇、甲酸的混合物，所述展开剂的蒸汽的温度控制在小于63.7℃。

在其中一些实施例中，所述展开剂蒸汽的温度为40～50℃。

在其中一些实施例中，置于展开剂的蒸汽中进行预饱前，还对所述点样后的硅胶g薄层板进行了预饱和前加热，该预饱和前加热的条件为：温度为40～105℃、时间为0.5～1.5min。

在其中一些实施例中，所述预饱和前加热的条件为：温度为80℃、时间为1min。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本申请通过先对所述点样后的硅胶g薄层板置于展开剂蒸汽进行预饱，使点样硅胶g薄层板于固相、气相、液相稳定状态下展开，使得鉴别过程中的避免了展开过程中多溶剂前沿的出现，确保展开过程中的斑点圆整，提高鉴别的准确性，再配合对展开后晾干的硅胶g薄层板进行加热处理(不低于100℃)，确保薄层板上的残留展开剂组分彻底去除，还减少展开剂对黑豆斑点的掩盖。通过以上构思，本申请将黑豆薄层鉴别的展开次数从传统平均3.3次降低至1次，即通过一次点样、一次展开、一次检视就能获得清晰的色谱，显著提高了黑豆薄层鉴别的一次成功率，符合实际生产中对黑豆鉴别效率的要求。

附图说明

图1为实施例1的检视图；

图2为实施例2的检视图；

图3为实施例3的检视图；

图4为实施例4的检视图；

图5为不同温度处理的供试品溶液的检视图；

图6为对比例1的检视图。

图7为对比例3的检视图。

图8为对比例4的检视图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明基于薄层色谱法的黑豆鉴别方法作进一步详细的说明。本发明实施例还设置了纯品对照品溶液，其种类及制备如下：取大豆苷、大豆苷元，分别溶解于有机溶剂，得大豆苷纯品对照溶液、大豆苷元纯品对照溶液。本发明实施例采用的萃取方式为超声，可以理解的是，萃取方式不限于超声，可以为微波等。本发明实施例所涉加热可以采用加热板加热。本例所述的“脱混””，当多组分的展开剂在干燥的吸附剂中上升，上升液体的前沿只含单元组分a，接着是二元组分a+b的区带，然后是a+b+c的区带……吸附剂对组分的亲和力按此顺序增加，即a<b<c，脱混引起了分级洗脱。

实施例1

本发明实施例提供一种基于薄层色谱法的黑豆鉴别方法，包括如下步骤：

供试品溶液制备：取本品粉末2g，加甲醇20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；

药材对照溶液制备：另取黑豆对照药材2g，同法制成对照药材溶液；

纯品对照溶液制备：再取大豆苷对照品、大豆苷元对照品，加甲醇分别制成每1ml各含1mg的溶液，作为对照品溶液；

点样：照薄层色谱法(附录ⅵb)试验，吸取上述四种溶液各5μl，分别点于同一硅胶g薄层板上；

展开：预饱和处理，以甲苯-甲醇-甲酸(14：6：0.1)为展开剂，展开，取出，晾干后110℃加热；其中，为了确定较优的预饱和处理条件，本实施例在展开步骤中于常温下采用了不同的预饱和的时间，分别为15min(处理1)、60min(处理2)、180min(处理3)；本步骤所述的预饱和处理，具体是将点样后的硅胶g薄层板置于展开剂的蒸汽中放置。

检视：置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

三个处理的检视结果见图1，处理1的检视结果见图1a、处理2的检视结果见图1b、处理3的检视结果见图1c，根据图1可知，随着预饱和的时间增长，斑点的圆整程度有了明显的改善，而且当预饱和时间为180min时，“脱混”现象不明显。说明预饱和程度对展开和检视的效果有影响。

实施例2

本发明实施例提供一种基于薄层色谱法的黑豆鉴别方法，包括如下步骤：

供试品溶液制备：取本品粉末2g，加甲醇20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；

药材对照溶液制备：另取黑豆对照药材2g，同法制成对照药材溶液；

纯品对照溶液制备：再取大豆苷对照品、大豆苷元对照品，加甲醇分别制成每1ml各含1mg的溶液，作为对照品溶液；

点样：照薄层色谱法(附录ⅵb)试验，吸取上述四种溶液各5μl，分别点于同一硅胶g薄层板上；

展开：将点样后的硅胶g薄层板置于展开剂蒸汽中进行预饱和处理，然后以甲苯-甲醇-甲酸(14：6：0.1)为展开剂，展开，取出，晾干后120℃加热10min；该步骤中，预饱和处理是分别在40℃(处理1)、50℃(处理2)展开剂蒸汽中进行15min，温度的控制具体是将展开缸分别浸泡于40℃、50℃的水中；

检视：置紫外光灯(254nm)下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

本实施例所得色谱图见图2，图2a是处理1对应的结果，图2b是处理2对应的结果，根据图2可知，相比起50℃，在40℃展开效果更佳，斑点更清晰圆整。

实施例3

本发明实施例提供一种基于薄层色谱法的黑豆鉴别方法，包括如下步骤：

供试品溶液制备：取本品粉末2g，加甲醇20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；

药材对照溶液制备：另取黑豆对照药材2g，同法制成对照药材溶液；

纯品对照溶液制备：再取大豆苷对照品、大豆苷元对照品，加甲醇分别制成每1ml各含1mg的溶液，作为对照品溶液；

点样：照薄层色谱法(中国药典附录ⅵb)试验，吸取上述四种溶液各5μl，分别点于同一硅胶g薄层板上；

展开：预饱和处理，以甲苯-甲醇-甲酸(14：6：0.1)为展开剂，展开，取出，晾干后110℃加热10min。该步骤的预饱和处理包括：具体是薄层板点样后使用电热板分别在40℃(处理1)、60℃(处理2)、80℃(处理3)和105℃(处理4)加热1分钟，趁热放入充满常温展开剂蒸汽的展开缸中预饱和15min；

检视：置紫外光灯(254nm)下检视。供试品溶液色谱中，在与药材对照溶液色谱和纯品对照溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

通过短暂加热薄层板，趁热预饱和，薄层板和展开缸内的温展开剂蒸汽因为产生了温度差而形成了对流传热，加速了展开剂蒸汽在展开缸里面的扩散，实现了充分预饱和；同时，薄层板经预饱和后，恢复到室温(如果不恢复到室温直接进行展开，会造成薄层板上的硅胶脱落，或者使展开剂沸腾，影响展开效果)，不影响展开剂在薄层板上的扩散。

本实施例的色谱图见图3，其中图3a是处理1的色谱图，图3b是处理2的色谱图，图3c是处理3的色谱图，图3d是处理4的色谱图。可见，薄层板经40℃到105℃加热后，均能检视出圆整清晰的斑点。而在80℃和105℃加热时，脱混现象已明显得到改善，未见明显的第二溶剂前沿。可见当加热温度在80℃趁热预饱和15min时，薄层板已充分预饱和，使展开效果符合要求。

实施例4

本例是实施例3的变化例。为了明确最佳的晾干后加热温度和加热时间，本例对晾干后加热板的条件分别设置了100℃、110℃和120℃，加热20min，并在第5min、第10min和第20min取出，立刻检视。

本例设置的各处理及其对应的检视结果见表1。

检视结果见图4，根据检视结果可知，从100℃到120℃，温度越高，挥干的效果越好，检视到的斑点越清晰。而在相同加热温度下，从5min到20min，加热的时间越长，展开剂挥干得越充分，斑点越清晰。其中，当在120℃加热10min时斑点基本清晰，加热到20min时可见清晰的斑点。因此，在检视前薄层板应在120℃加热10min以上以挥干展开剂。

本发明实施例采用的供试品溶液具有热稳定性，在本发明采用的预饱和前加热条件范围内、预饱和采用展开剂蒸汽的温度范围内以及展开晾干后进行加热的温度范围内均不会对供试品溶液中所含黑豆提取物的组分产生影响。供试品溶液在不加热(图5中3)、105℃加热1min(图5中1和4)、105℃加热10min(图5中2和5)的情况下均能按照上述鉴别方法获得斑点数量、颜色和位置一致的色谱图，请参见图5。

对比例1-2

对比例1是实施例3的处理1的对比例，对比之处仅在于，未进行预饱和，具体包括如下步骤：

供试品溶液制备：取本品粉末2g，加甲醇20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；

药材对照溶液制备：另取黑豆对照药材2g，同法制成对照药材溶液；

纯品对照溶液制备：再取大豆苷对照品、大豆苷元对照品，加甲醇分别制成每1ml各含1mg的溶液，作为对照品溶液；

点样：照薄层色谱法(中国药典附录ⅵb)试验，吸取上述四种溶液各5μl，分别点于同一硅胶g薄层板上；

展开：以甲苯-甲醇-甲酸(14：6：0.1)为展开剂，展开，取出，晾干后110℃加热；晾干是常温(25℃)下晾干；

检视：置紫外光灯(254nm)下检视。供试品溶液形成的色谱中，在与药材对照溶液色谱和纯品对照品溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

对比例2是对比例1的变化例，变化之处仅在于展开步骤中既未进行预饱和，也未在过夜晾干后加热。

结果：对比例1和对比例2两张色谱图(图6)进行对比，对比例2检视结果为无斑点，见图6a；而对比例1薄层板经过加热板110℃加热后，则能检视出斑点，见图6b，但是斑点不圆整，不符合薄层色谱鉴别结果检视的要求。

对比例3

本对比例是实施例3的处理1的对比例，对比之处仅在于，展开步骤中，预饱和处理是薄层板点样后使用电热板在120℃加热1分钟。

结果，虽无出现“混脱”、斑点圆整，图7，但是硅胶g薄层板上的硅胶会出现开裂。

对比例4

本对比例是实施例3的处理1的对比例，对比之处仅在于，展开步骤中，晾干后对加热板加热的温度为90℃。

结果，无出现“混脱”、斑点圆整，但部分斑点没有清晰显出，显斑不均匀，见图8。

本申请以上实施例通过先对所述点样后的硅胶g薄层板置于展开剂蒸汽进行预饱，使点样硅胶g薄层板于固相、气相、液相稳定状态下展开，使得鉴别过程中的避免了展开过程中多溶剂前沿的出现，确保展开过程中的斑点圆整，提高鉴别的准确性，再配合对展开后晾干的硅胶g薄层板进行加热处理(不低于100℃)，确保薄层板上的残留展开剂组分彻底去除，还减少展开剂对黑豆斑点的掩盖。本申请上述实施例仅通过一次点样、一次展开、一次检视就能获得清晰的色谱，显著提高了黑豆薄层鉴别的一次成功率，符合实际生产中对黑豆鉴别效率的要求。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。