一种分离测定植物油中饱和烃矿物油和芳香烃矿物油的方法与流程

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种专用于分离测定植物油中饱和烃矿物油和芳香烃矿物油的方法。

背景技术：

矿物油（MOH）是石油原油经分馏形成的烃类混合物，其碳原子数一般在10到50之间，主要包括饱和烃矿物油（MOSH）和芳香烃矿物油（MOAH）两类。不同性质的矿物油其化学组成差别较大，一般工业级矿物油中MOAH含量较高，占比在0~35%之间，而食品级白油则基本全为MOSH。研究表明，MOH经膳食摄入后易在人体内长期蓄积，是人体内蓄积量最大的污染物；MOSH的毒性主要体现在生物蓄积性，可形成肉芽肿并对器官造成危害；而MOAH则可致突变，特别是带有三个或以上苯环的MOAH具有致癌性。因此，相对于MOSH，MOAH在食品中的残留情况更加受到关注。2014年，德国联邦食品及农业部建议，碳链长度介于C₂₀~C₃₅之间的MOSH在食品中迁移量不应超过2mg/kg，C₂₀~C₃₅之间的MOAH迁移量不应超过0.5mg/kg。

食用植物油中含有的大量脂质、蜡酯、烯烃、天然烷烃等物质会干扰MOH的测定，是分析MOH最复杂的基质。国外研究者多使用在线HPLC-GC-FID方法对植物油中的MOSH和MOAH进行分离和测定，效果较好，但由于仪器昂贵，操作复杂，较难普及，所以离线固相萃取方法得以发展。离线固相萃取方法的关键在于筛选分离效果好的柱填料。目前，硝酸银硅胶、硫酸硅胶、氧化铝等SPE柱被成功用于食用植物油中MOSH的分离。对于低脂含量的样品，有研究者利用离线固相萃取方法实现了对MOSH和MOAH的分离，但是同时分离植物油中MOSH和MOAH的离线固相萃取方法目前尚未见报道，原因是洗脱MOAH时，角鲨烯、天然烷烃等干扰物会共流出而干扰测定。因此，开发操作简单、净化效果好、试剂消耗少、灵敏度高、对仪器要求低的植物油中MOSH和MOAH的离线固相萃取分离测定方法非常迫切。

技术实现要素：

针对目前植物油中MOSH和MOAH的离线固相萃取分离测定方法未见文献报道的现状，以及现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种分离测定植物油中MOSH和MOAH的离线SPE方法，该方法可行，净化效果好，检出限低，准确可靠，对仪器要求低，具有推广应用价值。

为了实现上述目的，本方法采用的技术方案如下：

一种分离测定植物油中MOSH和MOAH的方法，包括以下步骤：

步骤（1）环氧化反应：称取植物油样品，溶解于正己烷中，加入环氧化试剂mCPBA溶液，涡旋震荡10~20min，转速为300~600 rpm，然后加入乙醇和硫代硫酸钠溶液，室温下涡旋10~30s，移取500~900μL上层有机相，转移至装有适量无水硫酸钠的进样小瓶，制得上样液；

步骤（2）固相萃取：移取300~500μL上样液至活化后的分子筛固相萃取柱，关闭阀门，静置20~30min后，使用转接头将该柱连接至硝酸银硅胶固相萃取柱顶部，组成串联柱；用第一洗脱溶剂冲洗双层固相萃取柱，得到含MOSH的洗脱液，移除分子筛固相萃取柱，用第二洗脱溶剂冲洗硝酸银硅胶固相萃取柱，得到含MOAH的洗脱液；

其中，硝酸银固相萃取柱为0.3%硝酸银硅胶柱、1%硝酸银硅胶柱或者10%硝酸银硅胶柱；

步骤（3）测定：将步骤（2）收集的两部分洗脱液分别在30~40℃水浴中氮吹浓缩至所需体积，采用程序升温大体积进样-气相色谱-氢火焰离子检测器（PTV-GC-FID）测定，外标法定量；

气相色谱条件如下：

色谱柱为长度×内径×膜厚为15 m×0.25 mm×0.1 µm ，DB-1石英毛细管柱；PTV参数：初始温度50℃保持 1 min（分流比 200:1），以290℃/min升温至340℃并保持18 min（分流阀关闭 1 min，随后打开分流阀，以50:1分流比洗脱衬管中残留的高沸点物质），进样量5μL；柱温箱升温程序：初始温度50℃，保持4 min，以40℃/min的速率升至330℃，保持10 min，总运行时间为21 min；载气为高纯氮气，流速2.0 mL/min；FID温度为345℃。

进一步，优选的是步骤（1）中植物油样品为100~300mg，萃取所用正己烷的量为植物油样品质量的2~4倍。

进一步，优选的是步骤（1）中所述的环氧化试剂用量为植物油样品质量的1~3倍，溶于乙醇或者二氯甲烷，浓度为100~300mg/L；乙醇用量与环氧化试剂用量一致，硫代硫酸钠试剂用量为环氧化试剂用量的3~6倍，浓度为50~200 mg/L。

进一步，优选的是步骤（2）中所述的双层固相萃取填料为3~6g，两种填料质量比为1~3，使用前采用第一洗脱液活化。

进一步，优选的是步骤（2）中所述的第一洗脱液为正己烷、正庚烷或者异辛烷，体积为10~20mL。

进一步，优选的是步骤（2）中所述的第二洗脱液中含芳香烃、氯代甲烷和惰性烃，其体积比为1: 3~6: 20~27，其中，芳香烃为苯或甲苯，氯代甲烷为二氯甲烷或三氯甲烷，惰性烃为正己烷、正庚烷或异辛烷。

进一步，优选的是步骤（2）中的使用洗脱液洗脱固相萃取柱时，控制流速不大于2mL/min。

进一步，优选的是步骤（2）中收集到的洗脱液在30~40℃水浴中氮吹浓缩至0.2~0.5mL。

进一步，优选的是步骤（3）中标准曲线绘制方法如下：配置矿物油系列标准溶液，浓度为为2.0、10.0、50.0、100.0、200.0、500.0 mg/L，对系列标准曲线溶液进行气相色谱仪分析，以被测物峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标建立标准工作曲线。

本发明与现有技术相比，其有益下效果为：本发明利用环氧化反应，采用双层固相萃取交替净化法，将植物油中的MOH有效分离为MOSH和MOAH，方法可行，操作简便，净化效果好，检出限低，准确可靠，对仪器要求低，具有推广应用价值。

以上说明为本发明技术方案概述，为了更清楚的了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其他目的、特征和有点能够更明显易懂，现特举较佳实施例，并配合附图，详细说明如下。

附图说明

图1是目标物及烯烃在不同环氧化试剂用量下的回收率，图中a代表MOAH，b代表类胡萝卜素，c代表甾烯，d代表角鲨烯；

图2是目标物及烯烃在不同环氧化反应时间下的回收率，图中a代表MOAH，b代表类胡萝卜素，c代表甾烯，d代表角鲨烯；

图3是本发明方法分离的植物油中MOSH组分的色谱图；

图4是本发明方法分离的植物油中MOAH组分的色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对发明作进一步的详细说明，但不用视为限定本发明的范围。

本申请的发明人在开发本检测方法时，对植物油前处理方法的多种参数进行了优化，下面通过如下实施例1对环氧化条件的优化进行说明。

实施例1

1.1环氧化试剂用量的确定

步骤（1）环氧化反应：称取250mg橄榄油试样于四支5mL玻璃离心管中，加入650μL正己烷后，分别加入不同体积环氧化试剂 mCPBA溶液（200mg/mL，溶于乙醇），室温下振荡15min，转速为500rpm，然后加入500μL乙醇和2mL硫代硫酸钠水溶液（100g/L），室温下涡旋30s，除去过量过氧酸。最后移取800μL上层有机相，转移至装有适量无水硫酸钠的进样小瓶，制得上样液；

步骤（2）固相萃取：准确移取500μL上样液至分子筛SPE柱，让样液慢慢渗入到填料中，关闭阀门，静置约30min，然后使用转接头将该柱连接在0.3%硝酸银硅胶SPE柱顶部，组成串联柱。用3mL异辛烷淋洗串联柱，弃去，再用10mL异辛烷洗涤串联柱，以1mL/min流速洗脱并收集洗脱液于KD浓缩管，得到MOSH组分。随后移除分子筛柱，用12mL苯/二氯甲烷/正己烷溶液（5/20/75, v/v/v）洗涤下层硝酸银SPE柱，前2mL洗脱液仍为MOSH组分，与先前收集的MOSH组分合并，后10mL洗脱液用另一KD浓缩管收集，得到MOAH组分；

步骤（3）测定：将步骤（2）收集的两部分洗脱液在40℃水浴中氮吹浓缩至0.5mL，采用PTV-GC-FID测定，外标法定量；

气相色谱条件如下：色谱柱为长度×内径×膜厚为15 m×0.25 mm×0.1 µm ，DB-1石英毛细管柱；PTV参数：初始温度50℃保持 1 min（分流比 200:1），以290℃/min升温至340℃并保持18 min（分流阀关闭 1 min，随后打开分流阀，以50:1分流比洗脱衬管中残留的高沸点物质），进样量5μL；柱温箱升温程序：初始温度50℃，保持4 min，以40℃/min的速率升至330℃，保持10 min，总运行时间为21 min；载气为高纯氮气，流速2.0 mL/min；FID温度为345℃。

其中，不同的环氧化试剂用量分别为125μL、250μL、500μL和1000μL mCPBA溶液（200mg/mL，溶于乙醇），在环氧化反应时间为15min的条件下进行回收率实验，确定最佳环氧化试剂用量。试验结果见图1。由图1可以看出，环氧化试剂用量从25mg增加至50mg时，角鲨烯含量从8%降低至3.4%，甾烯含量从22%降低至5.8%，胡萝卜素含量从39%降低至7.5%。使用100mg环氧化试剂时，还存在0.3%角鲨烯、0.7%甾烯和1.6%胡萝卜素，再增加至200mg时，角鲨烯、甾烯和胡萝卜素的含量降低至0.2%和0.4%和0.9%。MOAH含量则分别降低了12%、15%、19%和24%。可以看出，随着环氧化试剂用量增大，烯烃干扰逐渐减小，但是MOAH的损失则在逐渐增大，为了平衡两者，因此选用了100mg环氧化试剂进行衍生化反应。

1.2环氧化反应时间的确定

在其他条件与1.1一致的情况下，步骤（1）加入500μL环氧化试剂 mCPBA溶液（200mg/mL，溶于乙醇）后，考察了不同环氧化反应时间（室温下震荡5min、10min、15min、30min、60min）对目标物MOAH和烯烃回收率的影响。试验结果见图2。从图2明显可以看出，随着反应时间增加，烯烃和MOAH含量都在不断降低，15分钟后，98%的角鲨烯和83%的胡萝卜素被移除，MOAH含量则减少了19%，继续延长反应时间，反应没有明显变化，即环氧化试剂在前15分钟已耗尽，因此确定环氧化最佳反应时间为15分钟。

实施例2

一种分离测定橄榄油中MOSH和MOAH的方法，包括以下步骤：

步骤（1）环氧化反应：称取250mg橄榄油试样于5mL玻璃离心管中，加入650μL正己烷和500μLmCPBA溶液（200mg/mL，溶于乙醇），室温下振荡15min，转速为500rpm，然后加入500μL乙醇和2mL硫代硫酸钠水溶液（100g/L），室温下涡旋30s，除去过量过氧酸。最后移取800μL上层有机相，转移至装有适量无水硫酸钠的进样小瓶，制得上样液；

步骤（2）固相萃取：准确移取500μL上样液至分子筛SPE柱，让样液慢慢渗入到填料中，关闭阀门，静置约30min，然后使用转接头将该柱连接在0.3%硝酸银硅胶SPE柱顶部，组成串联柱。用3mL异辛烷淋洗串联柱，弃去，再用10mL异辛烷洗涤串联柱，以1mL/min流速洗脱并收集洗脱液于KD浓缩管，得到MOSH组分。随后移除分子筛柱，用12mL苯/二氯甲烷/正己烷溶液（5/20/75, v/v/v）洗涤下层硝酸银SPE柱，前2mL洗脱液仍为MOSH组分，与先前收集的MOSH组分合并，后10mL洗脱液用另一KD浓缩管收集，得到MOAH组分；

步骤（3）测定：将步骤（2）收集的两部分洗脱液在40℃水浴中氮吹浓缩至0.5mL，采用PTV-GC-FID测定，外标法定量；

气相色谱条件如下：色谱柱为长度×内径×膜厚为15 m×0.25 mm×0.1 µm ，DB-1石英毛细管柱；PTV参数：初始温度50℃保持 1 min（分流比 200:1），以290℃/min升温至340℃并保持18 min（分流阀关闭 1 min，随后打开分流阀，以50:1分流比洗脱衬管中残留的高沸点物质），进样量5μL；柱温箱升温程序：初始温度50℃，保持4 min，以40℃/min的速率升至330℃，保持10 min，总运行时间为21 min；载气为高纯氮气，流速2.0 mL/min；FID温度为345℃。

图1和图2为测定橄榄油中MOSH和MOAH组分的色谱图，可以看到，本发明方法可有效去除油脂、正构烷烃及烯烃，两组分有效分离，因此该方法适合橄榄油中MOSH和MOAH的分离检测。

实施例3

一种分离测定橄榄油加标样品中MOSH和MOAH的方法，包括以下步骤：

步骤（1）环氧化反应：称取250mg橄榄油试样于三支5mL玻璃离心管中，分别加入2.5、5.0、12.5μL1g/L Gravex913润滑油标准储备液，加入650μL正己烷和500μLmCPBA溶液（200mg/mL，溶于乙醇），室温下振荡15min，转速为500rpm，然后加入500μL乙醇和2mL硫代硫酸钠水溶液（100g/L），室温下涡旋30s，除去过量过氧酸。最后移取800μL上层有机相，转移至装有适量无水硫酸钠的进样小瓶，制得上样液；

步骤（2）固相萃取：准确移取500μL上样液至分子筛SPE柱，让样液慢慢渗入到填料中，关闭阀门，静置约30min，然后使用转接头将该柱连接在0.3%硝酸银硅胶SPE柱顶部，组成串联柱。用3mL异辛烷淋洗串联柱，弃去，再用10mL异辛烷洗涤串联柱，以1mL/min流速洗脱并收集洗脱液于KD浓缩管，得到MOSH组分。随后移除分子筛柱，用12mL苯/二氯甲烷/正己烷溶液（5/20/75, v/v/v）洗涤下层硝酸银SPE柱，前2mL洗脱液仍为MOSH组分，与先前收集的MOSH组分合并，后10mL洗脱液用另一KD浓缩管收集，得到MOAH组分；

步骤（3）测定：将步骤（2）收集的两部分洗脱液在40℃水浴中氮吹浓缩至0.5mL，采用PTV-GC-FID测定，外标法定量；

气相色谱条件如下：色谱柱为长度×内径×膜厚为15 m×0.25 mm×0.1 µm ，DB-1石英毛细管柱；PTV参数：初始温度50℃保持 1 min（分流比 200:1），以290℃/min升温至340℃并保持18 min（分流阀关闭 1 min，随后打开分流阀，以50:1分流比洗脱衬管中残留的高沸点物质），进样量5μL；柱温箱升温程序：初始温度50℃，保持4 min，以40℃/min的速率升至330℃，保持10 min，总运行时间为21 min；载气为高纯氮气，流速2.0 mL/min；FID温度为345℃。

步骤（3）中标准曲线绘制方法如下：配置Gravex913润滑油（含73%MOSH和27%MOAH）系列标准溶液，浓度为2.0、10.0、50.0、100.0、200.0、500.0 mg/L，对系列标准曲线溶液进行气相色谱仪分析，以被测物峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标建立标准工作曲线。

表1和表2是本方法分析橄榄油加标样品中MOSH和MOAH的实验数据。表1和表2给出了本分析方法的线性相关系数、检出限、定量限、回收率、精密度（RSD）等相关参数，表明该方法结果可靠，精密度好，采用双层固相萃取柱交替净化，能有效去除基质对测定的干扰，从而获得较低的检出限和定量限，通过程序升温进样大体积进样，进一步降低了检出限。

表1 线性相关系数、检出限、定量限

表2 三种加标样品的回收率和精密度（RSD）（n=6）

注：n表示实验重复次数。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡是依据本发明的技术实质，对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明的技术方案范围内。