本发明涉及生物和生物医学技术成像领域，也可应用到其它领域需要长时间成像进行弱光光谱分析的领域，具体涉及一种红细胞生物光子检测方法。
背景技术：
血液标本是体外诊断标本的重要来源之一，血液标本能够全面的放映出人体的各项生理指标和机体的健康状况，采集血液标本作为检验项目在医疗诊断中占有较大比重，而红细胞作为血液中含量最多的细胞，其生理指标、功能、发育状态、临床表征等反映了生命体的代谢水平和功能状态，在临床检测中具有重要意义。正常人血液pH值始终保持在相对稳定的水平，其波动变化很小。血液的pH值稳定依靠血液中的缓冲碳酸和磷酸共轭缓冲体系、细胞内外的钠离子和钾离子交换、肺的呼吸排除多余的二氧化碳功能及肾脏的排酸保碱功能来维持。以往的研究表明，pH值的改变对红细胞的形态及变形性、膜蛋白结构与脂质双分子层、膜的稳定性与变形性以及血红蛋白都会产生影响，进一步影响到红细胞对O2和CO2的运输功能。这些变化都将会影响到血液在血管中的流速和血管的通畅，从而影响到整个血液循环系统和人体的健康。
生物光子又称超弱生物光子辐射，是生命体在生理活动或者在病理条件下所辐射出的一种极其微弱的光子流。通常情况下，生物光子指的是自发光，它是生物体在排除外界光源刺激的条件下由其自身的生命活动所释放的光子。一般认为，生物光子是由生命体自身的新陈代谢所产生的，有机体内的物质发生氧化还原反应，产生的高能态原子由于不稳定而退激回到低能态，将能量以辐射的形式向外发出，产生了生物光子。另外也有观点认为，DNA等遗传物质在合成过程中也产生生物光子，DNA分子的双链碱基互补配对构成的谐振腔结构和碱基对使DNA分子具备极强的储存和发射生物光子的能力。随着研究的深入，现在认为生物光子的产生机制可能是十分复杂的过程，它与生物体的生理状态和量子特性相关联，也可能携带着十分重要的生物学信息。
有鉴于此，急需提供一种红细胞生物光子检测方法对红细胞在pH环境改变下的生物光子辐射变化进行检测，探究红细胞在机体生物光子能量和信息传递上的作用，并为体外血液检测提供临床检测标准。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是提供一种红细胞生物光子的检测方法，包括以下步骤：制备红细胞稀释液；实验准备及成像系统预热；开始试验；定位拍照；实验成像；序列图像处理；数据分析。
在上述方法中，所述制备红细胞稀释液具体包括以下步骤：
A11、小鼠眼球取血：用镊子快速摘取眼球，小鼠倾斜一定角度使流出眼眶的血液滴入EP管中；
A12、红细胞分离：室温下将EP管直立静置待红细胞自然沉降或者采用低速离心的方法获取红细胞；
A13、制备红细胞稀释液：将获取的红细胞进行洗涤、离心、吸除白细胞层处理，稀释获得1×104个/μL的红细胞的稀释液，将红细胞的稀释液放置预设的环境下保存。
在上述方法中，所述实验准备及成像系统预热具体包括以下步骤：
A21、稳定室温，保持实验时的室温为预设温度，启动冷却液循环泵对光子成像器件进行制冷，开启EM-CCD的最大制冷模式，开启HCImage成像控制软件，并在正式成像前按成像时的设置启动光子成像器件的拍摄程序，对其进行预热，以稳定其背景基线；
A22、试剂准备；按照试剂配方配制灌流液,分别配置pH＝7.4,pH＝6.0,pH＝5.0与pH＝4.0的灌流液；
A23、配制抗凝剂；准备EP管加入抗凝剂备用，并在4℃的环境下保存。
在上述方法中，所述步骤A13具体包括以下：
用移液器吸出位于红细胞层上面的白细胞层，留下底层的沉淀为红细胞，再用红细胞洗涤液充分混匀红细胞，低速离心后，弃上清留下沉淀，完成后将获取的红细胞再通过上述方法洗涤两次；
红细胞通氧和细胞计数：用移液器将洗涤好的红细胞转移到离心管中，加入灌流液形成红细胞混合液，将由95％的O2和5％的CO2混合气体导入到红细胞混合液离心管中；离心红细胞混合液，弃上清；再加入灌流液，用移液器缓慢吹打混匀后转移到EP管中，再加入灌流液，再对EP管中的红细胞计数；将红细胞稀释到1×104个/μL形成红细胞的稀释液，取250μL的红细胞的稀释液离心后备用。
在上述方法中，所述开始试验包括以下步骤：
在检验皿中加入预设量的特异性抗体，再将红细胞的稀释液加入到检验皿中，将灌流液通入灌流槽，调节灌流液的流动速率，使灌流槽中灌流液的液面浸没检验皿。
在上述方法中，所述定位拍照包括：
待红细胞的稀释液完全沉淀到检验皿底部后，将EM-CCD的模式设置为Normal-CCD，每帧曝光时间为1s，在较暗光线下调整视野和焦距，完成定位拍照并将定位照保存到工作目录下。
在上述方法中，所述序列图像处理具体包括以下步骤：
使用图像采集软件HCImage将成像过程中获得的原始文件转换为TIF格式的单张时序图像数据，在Matlab 7.0的工作目录中使用本团队自主编制的程序对时序图像进行处理，去除宇宙射线引起的亮斑；Matlab 7.0处理后的图像再转移到HCImage图像处理平台进行目标区灰度值的提取；实验开始时拍摄的定位照用于划定序列图像样本目标区域，目标区域划定后HCImage成像软件会自动提取序列灰度图像目标区中的AGVs，同时选择非样本区域进行AGVs的提取，作为图像的BGVs；获得的灰度值最后输出到Microsoft Excel进行数据的分析样本图像目标区域的RGVs，其中RGVs＝AGVs-BGVs。
在上述方法中，所述数据分析包括：
按照序列图像每5帧计算一个平均值，得到一个时间分辨率为5分钟的数据序列；根据实验的样本数计算其标准误及与对照组之间的统计学差异。
在上述方法中，所述检验皿放置在一个灌流槽中，所述检验皿的高度低于所述灌流槽的高度，所述灌流槽的敞口端内壁设有用于卡放高透光玻璃的卡槽，所述卡槽位置高于所述检验皿的高度。
在上述方法中，所述抗凝剂由40g/L的柠檬酸钠溶液与0.9g/L的氯化钠制配成。
本发明提供的红细胞生物光子检测方法，具有以下特点：
(1)以EM-CCD为核心的光子成像系统和自主设计的红细胞灌流装置，可以实现对红细胞辐射的生物光子进行检测；
(2)操作简便：使用自主设计的检验皿和灌流液循环系统进行成像，实现高通量设计，步骤简要、操作方便；
(3)功能丰富：根据检测条件可以调整不同的实验参数，可广泛应用于生命科学研究、医学临床检查等领域。
附图说明
图1为本发明中红细胞生物光子检测装置的结构示意图；
图2为图1中A部的结构放大示意图；
图3为本发明中检验皿25的结构示意图，其中，
(a)为设有一个存放槽，(b)为设有多个存放槽；
图4为本发明提供的红细胞生物光子检测方法的流程图；
图5为本发明提供的红细胞在不同pH值环境下的相对灰度值曲线图；
图6为本发明提供的红细胞在不同pH值环境下的相对灰度值柱状图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式和说明书附图对本发明做出详细的说明。
如图1-2所示，本发明提供了一种红细胞生物光子检测装置，包括成像子系统、多通道灌流系统以及对灌流液和灌流槽进行加热并调控温度的双控恒温灌流控制器。
成像子系统用于图像采集及分析，包括，用于隔绝外界光线和宇宙射线的暗箱12，用于成像的高透光镜头，用于检测超弱光信号的光子成像器件13及其控制器14，用于对光子成像器件进行辅助制冷的冷却液循环泵15，工作台以及用于各部件的安装支架及成像的调焦操作的定制支架。冷却液循环泵15用来输出冷却水，对成像器件进行制冷。成像器件为当前常用的电子倍增CCD(EMCCD)；具体可参见专利CN103536277A。
多通道灌流系统用于切换实验所需灌流液以及当灌流液循环流动时保证红细胞固定不流动。
多通道灌流系统包括多通道切换器21，控制多通道切换器21自动切换通道的通道切换控制器31,通过导管分别与多通道切换器21入口端连接的多个用于存放不同pH值灌流液的灌流瓶22，以及通过导管与多通道切换器21出口端连接的灌流槽23的入口端。多通道切换器21与灌流槽23入口端之间设有蠕动泵24；灌流槽23的出口端经一个蠕动泵24连接用于存放实验后排出的灌流液的废液瓶26。
双控恒温灌流控制装置包括分别设于多通道切换器21与灌流槽23之间的加热泵以及设于灌流槽23底面用于加热灌流槽23的加热金属板，加热泵与加热金属板通过控制器自动控制。
如图3所示，还包括放置灌流槽23中且用于固定存放红细胞的检验皿25，检验皿25包括至少一个存放槽251，这种结构的设计以提高单批次检验的标本数量，实现高通量设计。检验皿25的高度低于灌流槽23的高度，灌流槽23的内壁设有用于卡放高透光玻璃231的卡槽232，卡槽232位置高于检验皿25的高度，使灌流槽23形成一密闭空间。这种结构的设计在检验皿的上方覆盖一块高透光玻璃231，为灌流液创造一个流动填充空间，密封覆盖的设计是为了精确控制固定液位高度，保证检出效率，并且消除灌流液由于流速不稳定造成的成像信号波动较大，以及灌流液液面凹陷不平造成的光子信号向四周散射导致部分信号丢失的偏差，实验中，检验皿25底层将会埋有用于固定红细胞群并保证在灌流液不断对红细胞进行灌流的情况下，红细胞不会随灌流液一起流动并保持相对的稳定状态的特异性抗体，保证实验的检出效率。
通道切换控制器31根据设置在特定的时间将会自动切换通道，使不同的pH值的灌流液流入灌流槽23，本实施例中设置为在时间节点前5min切换通道实现更换灌流液；计算机32用于处理成像子系统采集到的图像并对图像数据进行分析。
本发明还提供了一种红细胞生物光子检测方法，如图4所示，下面通过具体实施例来说明本方法。
实施例：灌流液pH值的改变对小鼠红细胞生物光子辐射强度的影响一、实验材料：
所用动物为成年昆明小鼠(30±5克，2-3月龄)，购自湖北省疾病预防控制中心的实验动物研究中心。所有的动物实验均通过中南民族大学动物管理委员会认可。
二、实验步骤
S1、制备红细胞稀释液，包括以下步骤
S11、小鼠眼球取血：用镊子快速摘取眼球，小鼠倾斜一定角度使流出眼眶的血液滴入EP管中。
S12、红细胞分离：室温下将步骤S11的EP管直立静置待红细胞自然沉降或者采用低速离心的方法获取红细胞。
再用移液器吸出位于红细胞层上面的白细胞层，留下底层的沉淀为红细胞，再用1×红细胞洗涤液充分混匀红细胞，通过10min且2000r/min的低速离心后，弃上清留下沉淀，完成后将获取的红细胞再通过上述方法洗涤两次。
S13、红细胞通氧和细胞计数：用移液器将洗涤好的红细胞转移到50mL离心管中，加入pH为7.4的灌流液形成25mL红细胞混合液，将由95％的O2和5％的CO2混合气体导入到含有体积为25mL的红细胞混合液离心管中。离心红细胞混合液，弃上清；再加入500μL的pH为7.4的灌流液，用移液器缓慢吹打混匀后转移到1.5mL EP管中，再加入同种灌流液至体积为1mL，再对EP管中的红细胞计数，将红细胞稀释到1×104个/μL形成红细胞的稀释液，取250μL的红细胞的稀释液离心后备用，将红细胞的稀释液放置4℃的环境下保存。
S2、实验准备及成像系统预热：包括
S21、稳定室温，保持实验时的室温为24-25℃，启动冷却液循环泵对光子成像器件进行制冷，开启EM-CCD的最大(MAX)制冷模式，开启HCImage成像控制软件，并在正式成像前按成像时的设置启动光子成像器件的拍摄程序，对其进行预热，以稳定其背景基线。
S22、试剂准备；按照试剂配方配制灌流液,分别配置pH＝7.4,pH＝6.0,pH＝5.0与pH＝4.0的灌流液；本实施例中，灌流液用醋酸调节pH值。
S23、配制抗凝剂，防止血液凝固，以获得可以计数的红细胞群；准备1.5mL的EP管加入200uL的抗凝剂备用，并在4℃的环境下保存。抗凝剂由40g/L的柠檬酸钠溶液与0.9g/L的氯化钠制配成。
本实施例具体设置为：
温控装置的启动时间：待灌流液充满灌流槽后开启温控系统，使灌流槽中灌流液温度维持在37℃。
灌流液的切换：实验设计pH值在灌流槽中改变的时间节点为实验开始后60分钟，90分钟，120分钟。这三个时间节点分别表示实验开始后的第60分钟灌流槽中的pH值由7.4变为6.0，第90分钟灌流槽中的pH值由6.0变为5.0，第120分钟灌流槽中的pH值由5.0变为4.0。每一梯度的pH值维持的时间是30分钟。灌流液需提前5分钟更换，保证灌流液在灌流槽中改变整个环境的pH值改变时间一致，因此，分别在实验开始后的第55分钟、第85分钟与第115分钟时切换多通道灌流系统相应的通道。
本实施例将待检的红细胞混合液缓慢注入设有特异性抗体的检验皿中，待红细胞完全沉淀到检验皿底部后，可开始进行下一步。
S3、开始试验：在检验皿中加入3.1ul的特异性抗体,再将50μL红细胞的稀释液加入到检验皿中，启动蠕动泵，以7ml/min的流速将灌流液通入灌流槽，并形成循环；本实施例中特异性抗体可以为抗-DlgG。
S4、定位拍照：待红红细胞的稀释液全沉淀到检验皿底部后，将EM-CCD的模式设置为Normal-CCD，每帧曝光时间为1s，在微弱光线下调整视野和焦距，完成定位拍照并将定位照保存到工作目录下。
S5、实验成像：关闭暗箱，设定好总拍照时间后开始拍摄成像，并形成序列图像。
S6、序列图像处理：使用图像采集软件HCImage将成像过程中获得的原始文件转换为TIF格式的单张时序图像数据。在Matlab 7.0的工作目录中使用本团队自主编制的程序对时序图像进行处理，主要去除宇宙射线引起的亮斑(因为其灰度值非常高，对图像分析有重要影响)。Matlab 7.0处理后的图像再转移到HCImage图像处理平台进行目标区灰度值的提取。实验开始时拍摄的定位照用于划定序列图像样本目标区域。目标区域划定后HCImage成像软件会自动提取序列灰度图像目标区中的灰度值(Grey values,GVs)信息，本研究只需要提取每一张图像目标区域的平均灰度值(Average grey values,AGVs)，不提取目标区域每个素像点灰度值；同时也选择非样本区域进行平均灰度值的提取，作为此图像的背景(本底)灰度值(Background grey values，BGVs)。获得的灰度值最后输出到Microsoft Excel进行数据的分析。样本图像目标区域相对灰度值(Relative grey values，RGVs)的计算通过如下公式获得：RGVs＝GVs-BGVs，如图5所示，为红细胞在不同pH值环境下的相对灰度值曲线图。
S7、数据分析：按照序列图像每5帧计算一个平均值，得到一个时间分辨率为5分钟的数据序列。根据实验的样本数计算其标准误及与对照组之间的统计学差异。本实施例使用Graphpad Prism软件进行统计学分析和做图。
检测结果：
在保证其他实验条件一致的情况下，使用成像子系统检测红细胞在pH环境改变下的生物光子辐射情况，结果如图6所示，从图中能够看到红细胞在生理条件下有稳定的生物光子辐射，在酸性环境下的生物光子的辐射强度比正常生理条件的辐射强度有明显的增加。
本发明提供的红细胞生物光子检测装置及方法，具有以下特点：
(1)以EM-CCD为核心的生物光子成像系统(UBIS)和自主设计的红细胞低速灌流装置，可以实现对红细胞辐射的生物光子进行检测；
(2)灵敏度高：以EM-CCD为光子成像器件，并配合暗箱等相关的元件，可以达到很好的信噪比；
(3)操作简便：使用自主设计的检验皿和灌流液循环系统进行成像，实现高通量设计，步骤简要、操作方便；
(4)扩展性好：该系统中，各器件相互独立，更换方便，选择多样，具有很好的扩展性和升级潜力；
(5)功能丰富：根据检测条件可以调整不同的实验参数，可广泛应用于生命科学研究、医学临床检查等领域。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人应该得知在本发明的启示下作出的结构变化，凡是与本发明具有相同或相近的技术方案，均落入本发明的保护范围之内。