一种同时检测ALV和REV抗体的试剂盒及方法与流程

本发明涉及一种同时检测alv和rev抗体的试剂盒，本发明还涉及该试剂盒的制备方法与应用，属于生物检测技术领域。

背景技术：

禽白血病(avianleukemia，al)是由禽白血病病毒(avianleukemiavirus，alv)引起的家禽肿瘤性疾病。要是淋巴细胞性白血病，其次是成红细胞性白血病、成髓细胞性白血病。此外还可引起骨髓细胞瘤、结缔组织瘤、上皮肿瘤、内皮肿瘤等。大多数肿瘤侵害造血系统，少数侵害其他组织。alv在各类鸡群都广泛性感染，包括白鸡、蛋鸡和地方黄鸡。对alv的防控措施，只有通过疾病净化，没有其它更好的捷径。alv既可以水平传播，也可以垂直传播。

鸡网状内皮组织增生病是由鸡网状内皮组织增生症病毒(rev)引起的，其急性型表现为死前嗜睡。慢性型表现为矮小综合征，生长发育停滞，羽毛生长不良，冠髯苍白。运动失调，肢体麻痹。

alv与rev属于禽免疫抑制病原，此类病原的感染呈逐年上升趋势。禽的免疫抑制病原会使鸡群对其它病毒或细菌变得更为易感，而且使其感染的症状、病变不典型。在临床上多重病毒混合感染的情况非常普遍，容易造成误诊，其鉴别诊断通常需借助实验室诊断技术，如：病毒的分离和鉴定、血清学试验、酶联免疫吸附试验以及分子生物学诊断等。传统经典的病毒分离方法操作复杂、耗时、费力。部分血清学检测方法敏感性低，特异性差，而且操作方法繁琐，一次只能检测一种病原。不利于疾病的及时诊断治疗，造成重大的经济损失。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明的第一个目的是提供一种同时检测alv和rev抗体的试剂盒；本发明的第二个目的是提供上述试剂盒的制备方法。本发明的第三目的是提供同时检测alv和rev抗体的试剂盒的应用。

为此，本发明提供的第一个技术方案是这样的：

一种同时检测alv和rev抗体的试剂盒，包被有revenv蛋白的xmap磁珠、包被有alvp27蛋白的xmap磁珠，alv阳性血清、alv阴性血清、rev阳性血清、rev阴性血清、生物素标记的山羊抗鸡igy多克隆抗体、链霉亲和素藻红蛋白、pbs/tbn缓冲液。

本发明提供的第二个技术方案是这样的：

进一步，上述的一种同时检测alv和rev抗体的试剂盒的制备方法，所述的制备包被有alvp27蛋白的xmap磁珠依次包括下述步骤：

1)提取alv、rev病毒核酸；

2)构建重组抗原表达质粒

对步骤1)提取的病毒核酸分别进行rt-pcr扩增；扩增结束后均回收纯化pcr产物，用限制性内切酶于37℃双酶切3h；酶切产物进行电泳回收，分别与同样经双酶切后的质粒pet28a连接，转化dh5α感受态细菌，转化平板上挑取单个菌落进行pcr及酶切鉴定，阳性菌落进行测序鉴定；测序正确质粒转入感受态bl21进行诱导表达；

3)sds-page检测重组蛋白的表达

收集步骤2)诱导后的重组子，冰上冷却，12000rpm离心2min，细胞沉淀用pbs/tbn洗涤一次，再次离心收集沉淀，在沉淀中加入50μlpbs/tbn进行超声破碎后离心分上清和沉淀，沉淀用尿素溶解，将二者煮沸5min，取20ul直接用于sds-page；

4)重组蛋白亲和层析纯化

5)抗原偶联磁珠。

进一步，上述的一种同时检测alv和rev抗体的试剂盒的制备方法，步骤2)rt-pcr扩增时的反应体系：一步法pcr酶混合液2μl；2×1一步法pcr缓冲液，12.5μl；核苷酸序列seqidno：1所示的上游引物10μm，1μl；核苷酸序列如seqidno：2所示的的下游引物10μm，1μl；rna，2.5μl；或者是核苷酸序列seqidno：3所示的上游引物10μm，1μl；核苷酸序列如seqidno：4所示的的下游引物10μm，1μl；rna，2.5μl；无rna酶dh2o，upto25μl；rt-pcr扩增时的反应程序：反转录50℃，30min，预变性95℃，15min，一个循环；变性94℃，30s，退火55℃，30s，延伸72℃，50s，35个循环；再延伸72℃，10min。

进一步的，述的一种同时检测alv和rev抗体的试剂盒的制备方法，抗原偶联磁珠包括如下步骤：

1)将磁珠放置室温平衡20分钟后，涡旋、超声20s，重悬磁珠；

2)将磁珠转移到usascientificmicrocentrifuge低结合律试管中，12000rpm离心3min，沉淀磁珠，并去除上清；

3)加入100μl双蒸水涡旋、超声，重悬磁珠；12000rpm离心3min，沉淀磁珠，并去除上清；

4)加入80μlactivationbuffer(100mmph6.2磷酸二氢钠)涡旋、超声，重悬磁珠；

5)加入10μl浓度为50mg/ml的硫代琥珀酰亚胺(sulfo-nhs)以及10μl浓度为的50mg/ml的碳酰二亚胺(edc)，涡旋、超声混匀；

6)避光，室温轻摇孵育20min后，12000rpm离心3min，沉淀磁珠，并去除上清；

7)加入250μl50mm的mes(ph5.0)缓冲液，涡旋、超声后，12000rpm离心3min，沉淀磁珠，并去除上清；

8)加入检测抗原和50mm的mes(ph5.0)缓冲液，使其总体积为500μl，涡旋、超声混合均匀；

9)避光，室温轻摇孵育2h后，12000rpm离心3min，沉淀磁珠，并去除上清；

10)加入500μl的pbs/tbn/tbn缓冲液(其配方为pbs+0.01％bsa+0.02％.吐温+0.05％叠氮钠)，涡旋、超声，重悬磁珠后，12000rpm离心3min，沉淀磁珠，并去除上清；

11)重复步骤10)两次；

12)加入pbs/tbn/tbn缓冲液，涡旋、超声，重悬磁珠，并将偶联好的磁珠于4℃避光保存。

本发明提供的第三个技术方案是这样的：

一种同时检测alv和rev抗体的试剂盒的应用，包括下述步骤：

1)将已偶联检测抗原的磁珠涡旋、超声，悬浮磁珠，并用pbs/tbn/tbn将其稀释到工作浓度100个/μl；

2)将待检样品按比例稀释好后，每个反应孔中加入磁珠和样品各50μl；

3)避光，室温振荡孵育1h；

4)每孔加入100μl的pbs/tbn/tbn洗板3次；

5)加入100μl终浓度为4μg/μlrpe标记的小鼠荧光二抗igg；避光，室温震荡孵育30min；

6)每孔加入100μl的pbs/tbn/tbn洗板3次；

7)每孔加入100μlpbs/tbn/tbn重悬；

8)上机检测。与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下技术优点：

1、我们申请提供的技术方案通过原核表达系统成功地表达了alv-p27蛋白和rev-env，该蛋白为可溶表达，将样品进行适当洗涤裂解及复性透析后，与磁珠偶联，用于液相芯片系统检测血清中的抗体。通过对临床样本的检测，发现与传统elisa检测方法结果基本一致，用xmap方法可以检测到1：6400稀释度，用elisa方法检测到1:25稀释度，xmap方法灵敏度比elisa高出256倍。检测结果显示特异性优异，与其他禽病原阳性血清无交叉反应且重复性好。在临床样品检测中检出阳性样品比elisa要高出54.54％。

2、本申请提供的技术方案建立的alv和rev-env抗体检测xmap技术，实现了对血清中的alv和rev抗体的同步快速检测，样本用量少，操作简单、快速，可大大降低检测成本。而且检测方法特异性强、敏感性高，整合其它免疫抑制病的xmap检测方法，可以实现多种不同目的病原抗体同时进行检测，适合用于spf鸡的日常监测、临床诊断和流行病学调查。目前全国养禽业在推动禽白血病净化工作，我们所建立的方法比传统elisa方法更具优势，可以应用其中。

3、本发明提供的技术方案可以同时检测alv和rev抗体，节约了检测时间，提高了工作效率。

附图说明

图1是目的基因扩增电泳图；

图2是xmap特异性分析图；

图3是xmap敏感性分析图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的权利要求做进一步的详细说明，对于本申请为详细披露的信息，均按照本领域常规技术手段进行。

实施例1

本申请用于表达alvp27蛋白和revenv蛋白的引物，两端分别添加相应的酶切位点和保护性碱基，并由生工生物工程(上海)股份有限公司广州分公司合成。引物信息见表1。

表1引物序列

实施例2本发明提供检测alv和rev抗体的方法，具体如下：

(1)重组质粒的构建

天根核酸自动抽取仪提取alv病毒核酸，操作按说明书进行。得到的rna样本进行采用takaraprimescript^tmonesteprt-pcrkitver.2试剂进行rt-pcr扩增，反应体系：primescript1stepenzymemix，2μl；2×1stepbuffer，12.5μl；上游primer(10μm)，1μl；下游primer(10μm)，1μl；rna，2.5μl；rnasefreedh2o，upto25μl；反应程序：反转录50℃，30min，预变性95℃，15min，一个循环；变性94℃，30s，退火℃，s，延伸72℃，s，35个循环；再延伸72℃，10min。扩增产物电泳结果见图1。

pcr产物回收纯化后，用限制性内切酶于37℃双酶切30min；酶切产物进行电泳回收，分别与同样经双酶切后的质粒pet28a连接，转化dh5α感受态细菌，转化平板上挑取单个菌落进行pcr及酶切鉴定，阳性菌落进行测序鉴定。测序正确质粒转入感受态bl21进行诱导表达。

(2)重组蛋白的表达

收集诱导后的菌液，12000rpm离心20min，菌体沉淀用pbs/tbn洗涤后，超声破碎，分离上清和沉淀，沉淀用尿素溶解。各取样20μl用于sds-page电泳分析。

(3)重组蛋白的纯化

a)平衡：用5倍体积的平衡缓冲液对空柱进行平衡；

b)样品准备，吸取1mlni-ntaagarose置于样品中，4℃，振摇，结合1h。

c)装柱：小心将溶菌产物-树脂混合物加入到空柱子中，柱子底盖密闭。

d)收集流穿液：开底盖收集流出液。收集流出液用于sds-page电泳分析。

e)洗涤：用10倍体积的平衡缓冲液洗涤一次，收集洗涤液用于sds-page电泳分析。

f)洗涤：washbuffer清洗两次。收集清洗片段用于sds-page电泳分析。

g)洗脱：10倍体积elutionbuffer洗脱重组体蛋白，收集片段用于sds-page电泳分析。

h)各取20ul用于sds-page电泳分析

(4)xmap检测抗原的包被

1)将磁珠放置室温平衡20分钟后，涡旋、超声20s，重悬磁珠；

2)将磁珠转移到usascientificmicrocentrifuge低结合律试管中，12000rpm离心3min，沉淀磁珠，并去除上清；

3)加入100μl双蒸水涡旋、超声，重悬磁珠；12000rpm离心3min，沉淀磁珠，并去除上清；

4)加入80μlactivationbuffer(100mmph6.2磷酸二氢钠)涡旋、超声，重悬磁珠；

5)加入10μl浓度为50mg/ml的硫代琥珀酰亚胺(sulfo-nhs)以及10μl浓度为的50mg/ml的碳酰二亚胺(edc)，涡旋、超声混匀；

6)避光，室温轻摇孵育20min后，12000rpm离心3min，沉淀磁珠，并去除上清；

7)加入250μl50mm的mes(ph5.0)缓冲液，涡旋、超声后，12000rpm离心3min，沉淀磁珠，并去除上清；

8)加入检测抗原和50mm的mes(ph5.0)缓冲液，使其总体积为500μl，涡旋、超声混合均匀；

9)避光，室温轻摇孵育2h后，12000rpm离心3min，沉淀磁珠，并去除上清；

10)加入500μl的pbs/tbn/tbn缓冲液，涡旋、超声，重悬磁珠后，12000rpm离心3min，沉淀磁珠，并去除上清；

11)重复步骤10)两次；

12)加入pbs/tbn/tbn缓冲液，涡旋、超声，重悬磁珠，并将偶联好的磁珠于4℃避光保存。

(5)xmap检测方法的建立

将包被检测抗原的磁珠稀释到工作浓度，阳性血清、阴性血清分别稀释100倍使用。rpe标记的二抗按1:500稀释使用。每个样品做2个重复取平均值，检测阈值的计算公式为：cutoff值＝阴性平均值+3sd。

依照检测仪器luminex200的说明进行检测后，结果下表所示：

表2revxmap检测结果

表3alvxmap检测结果

根据cutoff值计算公式，alv的检测cutoff值约为600，rev的检测cutoff值约为500。当检测样品的mfi值大于cutoff值时，该实验数据才能进行有效分析。

待测样品的分析判断：

针对rev：1)当待测样本的mfi值＞500时，判断为阳性样本；2)待测样本的mfi值≤500时，判断为阴性，需要进行重复实验或采取其他检测方法进一步验证。

针对alv：1)当待测样本的mfi值＞600时，判断为阳性样本；2)待测样本的mfi值≤600时，判断为阴性，需要进行重复实验或采取其他检测方法进一步验证。

实施例3特异性分析

采用所建立的xmap检测方法对alv，rev,mdv，reo，ibdv，ndv,aiv,ibv和iltv阳性血清进行检测，设2个重复，并计算mfi平均值，并根据阈值判断检测结果。实验结果如图2所示，只有alv和rev阳性血清的mfi值较高，其他均较低，判断为阴性，说明本检测体系特异性良好。

实施例4敏感性分析

分别用单重xmap对alv和rev进行灵敏度检测，并和elisa做比对。分别将阳性高免血清按1:25；1:50；1:100…倍比稀释，spf阴性血清按1:100稀释后作为阴性对照。rep标记二抗按1:500稀释使用。每个样品设2个重复，并计算平均值。

alv、rev的xmap检测敏感性分析结果如图3所示，结果表明alv和rev的最低检测限度均为1：6400。

实施例5稳定性分析

用所建立的xmap检测方法分别对alv和rev两个不同稀释度的高免血清做重复检测，计算其变异系数，分析批内差异。对上述实验作3次重复，通过三次实验的均值计算变异系数，分析批间差异。

表4alv和rev多重xmap检测的稳定性分析

该结果表明alv和rev多重xmap检测方法的批内差和批间差均低于3％，表明所建立的方法检测性能稳定，结果可靠，具有可重复性的特点。

实施例6临床样品的检测验证

用所建立的xmap检测方法对22份临床样品进行检测，并与elisa检测方法做比对。其检测结果如表5所示。

表5

序列表

<110>广州维佰生物科技有限公司

<120>一种同时检测alv和rev抗体的试剂盒及方法

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>33

<212>dna

<213>禽白血病病毒(avianleukemiavirus)

<400>1

cgggatcccctgtagtgattaagacagagggac33

<210>2

<211>32

<212>dna

<213>禽白血病病毒(avianleukemiavirus)

<400>2

acgtcgacctagggctggatagcagacgacat32

<210>3

<211>24

<212>dna

<213>内皮组织增生症病毒(reticuloendothelialhyperplasia)

<400>3

caggaattcatggactgtctcacc24

<210>4

<211>24

<212>dna

<213>内皮组织增生症病毒(reticuloendothelialhyperplasia)

<400>4

agagtcgacttgacctagggtatc24