一种用于皮肤组织荧光光谱和后向散射光光谱原位测量的深度敏感光纤探针的制作方法

本发明涉及一种用于皮肤组织荧光光谱和后向散射光谱原位测量的光纤探针，通过探针的结构设计，实现荧光光谱及后向散射光谱的原位、深度敏感探测，属于光电和医学结合技术领域。

背景技术：

近年来，光学技术在基础生命科学研究以及生物医学诊断、治疗、监测和手术等方面取得了广泛、快速的发展，其典型应用包括：成像技术、光谱技术、组织内窥镜、血流监测、光动力治疗、激光手术等等。光学技术应用于生命科学和生物医学所面临的主要挑战包括：如何传输宽波段范围的照明光强到指定组织表面或特定部位；如何收集并传输组织微弱发射光信号(低于纳瓦量级)到探测器；如何以最少侵入性的方式使光学探针或辐射能量进入诊断和治疗区域。光学探针独特的物理和光传输特性使之可以帮助解决这些现实问题。因此，各种类型的光纤探针在生命科学相关的临床和科研中得以广泛应用。每一种光纤探针结构都有一定的优点和局限性，适用于不同的光谱波段和应用场景。

皮肤是人体中最重要的器官之一，其厚度随着不同人和不同所在部位有较大差异，但其基本结构均分为三层，即表皮层、真皮层与皮下组织。表皮层位于皮肤的最外层，由复层扁平上皮组成，一般厚度在0.07mm～0.23mm之间。真皮层位于表皮深层，向内与皮下组织相连。真皮层由致密结缔组织组成，其内分布大量胶原纤维、弹性纤维和各种结缔组织细胞，使得皮肤既具有弹性又具有籾性，一般厚度在1mm～2mm之间。皮下组织位于皮肤的深层，由大量疏松结缔组织和脂肪小叶组成，其中分布有汗腺、毛根、血管、淋巴管和神经等，此层是皮肤与皮下肌肉组织，骨组织之间的连接层，是贮存脂肪的主要场所，对维持体温具有重要作用。

皮肤组织中能发射荧光的物质有很多。每一种荧光物质具有特定的吸收光谱及荧光发射光谱，组织荧光来源于多种荧光物质的组合。组织中已经发现的较重要的荧光物质有糠氨酸、色氨酸、胶原、弹性蛋白、黄素腺嚓吟二核昔酸(fad)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)及其硫化物(nadph)、核黄素等。此外，皮肤组织结构决定了不同荧光物质在其中的分布存在差异，如角蛋白就仅存在于皮肤表皮层的角质层，而糠氨酸则主要存在于皮肤真皮层中。

辐射传输理论将传输介质的光学特性分为吸收与散射性质。皮肤对可见及近红外波长光的吸收主要来自于黑色素，血液和水分。黑色素存在于人体表皮层中，是决定皮肤在紫外与可见波长吸收性质的主要成分。黑色素在紫外、可见及近红外波段有较宽的吸收光谱，对较短波长的光的吸收更强。血液对光的吸收主要来自于血红蛋白，血红蛋白在400至600nm有较强吸收。相比较黑色素和血液，水在可见波长的吸收非常地低，几乎可以忽略不计，但随着波长的增大，尤其在红外波段水成为皮肤中最主要的吸收介质。

皮肤组织中不同成分的折射率变化使得组织具有较强的散射性质。组织中折射率较高的成分是连接纤维(包括胶原纤维、弹性纤维、网状纤维)，细胞膜，细胞器和细胞核。通常将这些折射率较高的组织成分定义为散射介质，其平均折射率范围约为1.39～1.47。折射率较低的成分为细胞质1.35与细胞间液1.37。散射性质主要来源于散射介质(连接纤维、细胞膜等)与背景介质(细胞质、细胞间液等)折射率的差异。

对于皮肤组织荧光光谱测量而言，面临的主要问题包括：(1)皮肤组织中存在很多具有荧光特性的成分，而这些成分往往具有不同的纵向分布。为实现不同荧光物质的检测，使探测到的荧光尽可能多的来自目标荧光物所在的皮肤组织，就涉及对探测深度的控制。(2)皮肤组织是典型的混浊介质。可见波段范围内，皮肤组织的吸收性质主要来源于黑色素以及血液中的含氧血红蛋白和脱氧血红蛋白；而散射性质主要来源于散射介质(连接纤维、细胞膜等)与背景介质(细胞质、细胞间液等)折射率的差异。皮肤组织吸收、散射特性会对入射到组织的激发光和组织再发射的荧光造成双重干扰，从而导致实际测量的原始荧光光谱不能直接反映组织荧光特性。后向散射光谱中包含组织吸收、散射特性，可用于复原组织荧光。因此，在荧光光谱测量时，原位测量后向散射光谱非常必要。(3)皮肤组织不同区域的微观成分各有差异，即使空间位置差异不大，其吸收、散射特性也会不一样。因而，组织光谱测量时，测量位置变化会导致光谱形状和强度变化。(4)皮肤组织属于软性材质，探针端面与皮肤组织表面的接触压力不同，会导致组织表面形状和组织内部微观结构发生变化，导致激发光和荧光在组织中的传输路径会发生改变，进一步导致测量得到的荧光光谱发生变化。(5)此外，在一定范围内，组织荧光光谱强度与激发光强度线性相关，而激发光源光强会随光源老化或供电电流波动而变化，在实际测量过程中需要针对激发光源的实时波动对荧光进行修正。本发明主要针对以上几个问题，设计一种用于人体皮肤组织荧光光谱及后向散射光谱实时、原位、深度敏感测量的光纤探针。

美国专利us8676283以及中国专利cn102697510公开了一种用于确定个体组织的组织状态的装置，所述装置中照明系统用于以激发光照射所述个体组织的一部分并检测由所述组织内化学物质所发出的荧光，包括：复数个激发纤维、和复数个彼此隔开并相对于所述激发纤维进行排列的接收纤维，使得能够优先收集来自皮肤真皮层的荧光信号。该照射系统仅简单的排列激发纤维和接收纤维，而忽略了光纤的数值孔径、组织光学参数等，无法实现深度分辨探测。

gerdkeiser等在文献reviewofdiverseopticalfibersusedinbiomedicalresearchandclinicalpractice中公开了光纤探针在不同研究中的应用。根据应用领域的不同，探针探测端面有不同的排布形式，但没有增加多个探测单元提高光谱测量稳定性的报道，且没有提出深度敏感的技术。

技术实现要素：

本发明的技术解决问题：克服现有技术的不足，提供一种用于组织荧光和后向散射光光谱测量的深度敏感光纤探针，克服了组织荧光光谱和后向散射光光谱测量过程中光谱强度依赖于激发和照明光源强度、探针探测端面与组织表面接触压力，且无法实现组织内部深层(如皮肤真皮层)荧光成分光谱特性检测的缺点。

本发明技术解决方案：一种用于皮肤组织荧光光谱和后向散射光光谱原位测量的深度敏感光纤探针，包括：激发光纤(1)、照明光纤(2)、收集光纤(3)、两路参考光纤、探针探测端面(5)；

激发光纤(1)，连接荧光激发光源(81)与探针探测端面(5)，用于将光源发出的激发光传导到待测组织(11)，以激发组织中的各荧光成分产生荧光光谱信号；

照明光纤(2)，连接照明光源(82)与探针探测端面(5)，用于将光源发出的照明光传导到待测组织(11)，以产生携带组织吸、散射特性的后向散射光光谱信号；

收集光纤(3)，连接探针探测端面(5)与光谱探测器(10)，用于将待测组织(11)的荧光光谱和后向散射光谱传导到光谱探测器(10)，供数据分析处理；

探针探测端面(5)，用于固定激发光纤(1)、照明光纤(2)、收集光纤(3)，并以一定形式排布，保证三束光纤相对位置不变，实现深度敏感探测；

两路参考光纤，第一路参考光纤(41)连接激发光源(81)和第一路光强探测器(91)；第二路参考光纤(42)连接照明光源(82)和第二路光强探测器(92)，用于实时监测光源波动；

激发光纤(1)、照明光纤(2)与两路参考光纤形成w形光纤束连接结构。

所述激发光纤(1)和照明光纤(2)采用相同的结构和材料，具有相同的芯径、数值孔径，保证激发光纤和照明光纤出射的光斑具有相同的大小、功率分布等。

所述激发光纤(1)和照明光纤(2)到收集光纤(3)之间的纤芯距离相同，保证相同波长下皮肤组织受激发射的荧光与后向散射光在组织中传输路径长度相等。

所述激发光纤(1)和照明光纤(2)数值孔径大于0.2，纤芯直径范围0.2mm～1mm；所述收集光纤(3)数值孔径大于0.2，纤芯直径在0.3mm～1mm之间。

所述激发光纤(1)、照明光纤(2)与收集光纤(3)的纤芯距离在0.3mm～1.2mm之间，最佳距离处荧光强度不随纤芯距离变化，即0.5mm～0.9mm之间；此外，为保证所测荧光与后向散射光比率最大，要求探针探测端面(5)与组织表面(11)间的距离为0mm，即探针探测端面(5)与组织表面(11)刚好接触。

所述探针探测端面(5)中激发光纤(1)、照明光纤(2)以及收集光纤(3)组合成多个独立的探测单元，保证单次测量中实现多通道光谱信号平均，提高光谱探测的稳定性。

所述探针探测端面(5)中，所有光纤分散形成的各激发光纤、照明光纤及收集光纤组合内部排布结构相同；在探针探测端面(5)中，各个探测单元均匀或随机分布。

在所述探针探测端面(5)中，激发光纤(1)、照明光纤(2)均匀的分布在收集光纤(3)周围，呈圆环形分布，保证组织受激发射的荧光与后向散射光在传输到收集光纤的路径上，经历相同的吸收、散射作用。

所述收集光纤(3)还可以连接光谱探测器(10)，或不同滤光片与光强探测器的组合。

所述收集光纤(3)与光谱探测器(10)之间设置有光学准直镜组，或收集光纤(3)末端附带自聚焦透镜，保证进入光谱探测器(10)的光束为准直光，提高后续测量系统校准的准确性。

所述探针探测端面(5)还可以置有压力传感单元(6)，实时反馈探针探测端面(5)与被测组织表面(11)之间的接触压力，用于指导测量过程中的压力控制或后期的压力修正。所述探针探测端面(5)的压力传感单元(6)是电学压力传感或光学压力传感。

本发明的原理：在本发明光纤探针中，激发光纤(1)两端分别连接激发光源(81)与探针探测端面(5)，照明光纤(2)两端分别连接照明光源(82)与探针探头端面(5)，第一参考光纤(41)连接激发光源(81)与第一光强探测器(91)，第二参考光纤(42)连通照明光源与光强探测器(92)，收集光纤(3)连通探针探测端面(5)与光谱探测器。光谱探测器用于测量不同波长下组织荧光和组织后向散射光强度，可连接的光谱探测器包括带分光器件的光谱仪或不同滤光片组与光强探测器的组合。激发光源用于激发组织中具有荧光特性的成分产生荧光，照明光源用于照射组织获取携带组织吸收、散射特性的后向散射光，可连接的激发光源和照明光源包括发光二极管、氘灯、氙灯、卤素灯中的一种或两种以上的组合。光强探测器示值用于实时监测光源发光强度，保证每次光谱测量时荧光激发强度与照明光源强度保持一致或将实际测量得到的光谱进行激发/照明光强归一化处理。可连接的光强探测器包括光电探测器或热释电探测器。

本发明涉及的探针探测端面(5)中，激发光纤(1)和照明光纤(2)分布在收集光纤(3)周围。激发光纤(1)、照明光纤(2)及收集光纤(3)分散形成若干个独立的探测单元，实现多点同时探测。采用多点探测时，激发光纤、照明光纤及收集光纤组合形成多个通道，各测量通道可按照一定规律均匀的分布在探针端面，也可随机分布在探针端面。激发光纤和照明光纤的结构、材料相同，且二者与收集光纤纤芯之间的距离也相同，保证荧光光谱和后向散射光谱测量位置和条件的一致。具体尺寸确定时，首先根据皮肤组织典型光学参数构建双层组织模型，并进行蒙特卡罗模拟，研究激发光纤和照明光纤的数值孔径，以及与收集光纤纤芯之间的距离，对组织荧光光谱和组织后向散射光光谱测量的影响；然后以组织荧光光谱强度与组织后向散射光光谱强度比率最大或探测深度达到待测荧光成分分布较多的区域为评价指标，选择合适的纤芯尺寸和芯芯距离。

本发明涉及的探针端面还设置压力传感单元，在光谱测量过程中实时反馈光纤探针端面与待测目标之间的接触压力，进而用于指导测量过程中的压力控制或后期针对各光谱形状、强度，或最终检测结果进行压力修正。

本发明与现有技术相比的优点在于：

(1)人体皮肤组织属于典型的混浊介质，组织吸收、散射特性会对组织荧光光谱造成干扰。本发明提供的光纤探针在组织荧光光谱测量的同时，测量当前探测点组织后向散射光光谱，结合相应的固有荧光光谱复原方法可得到更能反映组织荧光特性的固有荧光。此外，由于组织结构的不均匀性，距离相差不大的不同测量点出荧光成分浓度或黑色素等其他干扰物浓度也可能有差异，本发明提供的光纤探针在探测端面将激发光纤、照明光纤和收集光纤组合成一个单独的探测单元，其探测面积较大，适用于较为均匀的组织结构，或形成多个独立的探测单元，实现单次测量过程中多个探测点光谱数据平均，提高光谱测量的稳定性。最后，由于探针探测端面与组织表面接触压力会影响组织内部微环境，造成组织荧光和后向散射光光谱形状发生变化，本发明提供的光纤探针在探测端面设置有压力传感单元，指导接触压力的控制或提供算法进行修正，保证单次测量过程中荧光和后向散射光光谱测量压力，提高固有荧光光谱复原的有效性，也保证多次测量过程中测量条件的一致，提高多次测量的重复性。

(2)人体皮肤组织中具有荧光特性的成分很多，其激发/发射波长通常存在严重的重叠。单纯通过激发和发射波长的选择无法排除干扰物对待测组分荧光光谱的干扰。考虑人体皮肤组织具有多层结构，不同荧光物质在其中的分布存在差异，如角蛋白就仅存在于皮肤表皮层的角质层，而糠氨酸则主要存在于皮肤真皮层中。本发明所涉及光纤探针通过优化激发光纤、收集光纤数值孔径、纤芯距离，实现探测深度的控制，保证所测荧光尽可能多的来自目标荧光物所在的深度，提高光谱测量的准确性。

附图说明

图1为本发明结构组成框图；

图2为光纤探针-皮肤组织光学模型，收集光纤纤芯直径为d1，数值孔径为na，激发光纤与收集光纤纤芯距离为d2，光纤探针与组织表面距离为d3，入射光纤指激发光纤或照明光纤；

图3为光纤探针探测深度影响因素，包括收集光纤纤芯直径为d1，数值孔径为na，激发光纤与收集光纤纤芯距离为d2，激发光纤直径d4。

图4为收集光纤纤芯直径d1对荧光测量的影响；

图5为收集光纤数值孔径na对荧光测量的影响；

图6为入射光纤与收集光纤纤芯中心距离d2对荧光测量的影响；

图7为光纤探针与皮肤之间的距离d3对荧光测量的影响；

图8为光纤探针端面分布；

图9为不控制压力情况下的组织光谱；

图10为控制压力下的组织光谱。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明进行详细说明。

如图1所示，本发明中激发光纤1、照明光纤2以及两路参考光纤(第一路参考光纤41和第二路参考光纤42)构成w型光纤束连接结构，其中，激发光纤1连通激发光源81与探针探测端面5，照明光纤2连通照明光源82与探针探头端面5，第一路参考光纤41连接激发光源81与第一光强探测器91，第二路参考光纤42连通照明光源2与第二光强探测器92；此外收集光纤3连通探针探测端面5与光谱探测器10。

本发明通过蒙特卡罗模拟优化光纤探针中收集光纤3的芯径、数值孔径、激发光纤1与收集光纤3纤芯距离，来实现皮肤组织光谱的深度敏感探测。采用的“光纤探针-皮肤组织”光学模型如图2所示，其中收集光纤3直径为d1，数值孔径为na，激发光纤1与收集光纤2纤芯距离为d2，光纤探针与组织表面距离为d3。模拟时，给定待测组织表皮厚度为0.2mm，真皮厚度为0.55mm，且相应的横截面均为4mm×4mm，荧光物质分布在0.2mm～0.3mm。光纤探针探测深度影响因素如图3所示，其中d1表示收集光纤直径，d2为激发光纤与收集光纤纤芯距离，d4为激发光纤直径，α为收集光纤接收接收角度，d为探针探测深度。模拟时采用的激发光波长为370nm，发射荧光波长为480nm。对于表皮层，激发波长处吸收系数为188cm^-1，散射系数为135cm^-1，各项异性系数为0.73，折射率为1.40；发射波长处吸收系数为79cm^-1，散射系数为57cm^-1，各项异性系数为0.75，折射率为1.38；对于真皮层，激发波长处吸收系数为5.1cm^-1，散射系数为135cm^-1，各项异性系数为0.73，折射率为1.40；发射波长处吸收系数为1.1cm^-1，散射系数为57cm^-1，各项异性系数为0.75，折射率为1.38；选取的激发光波长和发射荧光波长分别对应着人体皮肤中糠氨酸、nadh荧光成分的吸收峰值波长和荧光发射峰值波长附近。

通过模拟发现，光纤探针探测深度随激发光纤与收集光纤纤芯距离增大而增大，随二者数值孔径na的增大而降低，随激发光纤与收集光纤纤芯芯径变化不明显。此外，收集光纤纤芯直径d1对荧光强度及后向散射光强度的影响如图4所示。随着收集光纤芯径d1的增加，所探测到的荧光与后向散射光强度均以近乎完全相同的幅度递增，这是由于收集光纤的端面面积与其直径呈二次函数关系，端面面积增加，所探测到的光强增加。收集光纤数值孔径na对荧光强度和后向散射光强度的影响如图5所示。随着收集光纤数值孔径na的增加，所探测到的荧光与后向散射光也均以单增规律变化，二者变化幅度基本相同。

图6和图7分别所示入射光纤与收集光纤纤芯距离d2、光纤探针端面与待测皮肤组织表面之间的距离d3对荧光与后向散射光的影响。二者的影响与前述收集光纤直径及收集光纤数值孔径影响完全不同：随着d2从0.1mm增加到1.5mm，后向散射光与荧光整体上均呈减弱趋势，但在0.6mm至0.9mm这个区间，荧光强度几乎保持不变，在d2为0.9mm时，归一化的荧光强度达到后向散射光强度的3.8倍；另外，随着d3从0mm单增到10mm，后向散射光与荧光的变化幅度也不一致，并分别在d3为1mm、2mm处达到极强，而当d3为0mm时，组织荧光与组织后向散射光之间的比率最大。

根据上述规律，为保证探针收集到的组织荧光与后向散射光强度超过最大值的10％，本发明要求收集光纤数值孔径大于0.2，收集光纤纤芯直径在0.3mm～1mm之间。考虑为保证荧光衰减幅度小于后向散射光衰减幅度，本发明要求入射光纤与收集光纤纤芯距离在0.3mm～1.2mm之间，最佳距离应处于荧光强度保持不变的0.5mm～0.9mm之间。此外，为保证所测荧光与后向散射光比率最大，要求探针端面与组织表面间的距离为0mm，即探针端面与皮肤组织表面刚好接触。

皮肤组织吸收、散射特性会对入射到组织的激发光和组织再发射的荧光造成双重干扰，从而导致实际测量的原始荧光光谱不能直接反映组织荧光特性。后向散射光谱中携带有组织吸收、散射特性，结合相应的蒙特卡罗或扩散理论的模型，可以进行光学参数提取和组织固有荧光光谱复原。但存在的问题是，后向散射光谱只能提取照明光源所对应的组织区域，为实现荧光光谱复原，需要保证荧光光谱和后向散射光谱测量部位相同。本发明认为单次测量中收集光纤及照明光纤所对应的组织具有相同的吸收、散射特性，为实现原位测量，要求激发光纤和照明光纤排布在收集光纤在周围，形成单个或多个圆形分布；要求收集光纤、照明光纤与收集光纤纤芯的距离保持一致；收集光纤与照明光纤可以间隔排列，也可按照顺序随机排列。除此之外，在单次测量中实现荧光光谱和后向散射光谱的测量，不仅能够保证测量位置的一致，还能保证接触压力、接触角度等条件相对一致，这对组织光谱多次测量之间的重复性至关重要。

在保证单次测量中荧光光谱与后向散射光谱测量位置相同的条件后，为控制多次测量时组织局部位置差异导致的组织吸收、散射特性差异，本发明在探针端面排布若干个激发光纤1、照明光纤2及收集光纤3的组合，如图8所示。其中，收集光纤1位于组合中心，两根激发光纤1和两根照明光纤2均匀分布在收集光纤周围；分布中收集光纤3位于组合中心，三根激发光纤1和三根照明光纤2均匀分布在收集光纤周围；分布中收集光纤依然居中，若干激发光纤和照明光纤呈两圈环形分布在收集光纤周围；#4分布中将#2分布按照3行×3列重复9次，实现9个通道的同时探测；#5分布则将#2随机重复若干次，形成多通道探测。在探针后端分别组合激发光纤、照明光纤和收集光纤，然后再连接到激发光源、照明光源以及光谱探测器。该方式实现了在不增加测量时间的前提下，通过单次测量实现多点探测。较之于单点探测而言，将测量单元分成若干个组合，可以明显提高多次光谱测量之间的重复性。另外，各个激发光纤、照明光纤和收集光纤组合可以均匀、规则的排布在探针端面，也可随机排布。

光纤探针端面与皮肤组织表面的接触压力会导致组织表面发生形变，使组织内部微观结构发生变化，进而导致组织荧光光谱和后向散射光谱发生变化，而且不同接触压力所造成的形变程度不一致。采用本发明所述光纤探针对人体前臂皮肤组织荧光光谱进行测量。在不考虑压力控制时，在皮肤组织同一位置处进行5次测量，得到的光谱曲线如图9所示，对420nm～600nm范围内的光谱强度进行积分求和，可得其变异系数为5％；另外，测量过程中保证接触压力变化小于10％时，在皮肤组织同一位置进行5次测量，所得光谱曲线如图10所示，对420nm～600nm范围内的光谱强度进行积分求和，可得其变异系数为2.5％。为保证测量时接触压力在一定范围内，本发明在光纤探针端面增加压力传感单元，实时监测测量过程中的接触压力并发送给控制系统，当接触压力超过允许范围时发出提示。

皮肤组织荧光光谱和后向散射光谱测量过程中，激发光源和可见波段照明光源都会因为驱动电流波动或使用环境变化，而出现一定的波动，进而导致荧光光谱和后向散射光谱出现波动。本发明增加第一参考光纤41、第二参考光纤42并连通光强探测器，来实时监测并校正激发光源81、照明光源82的发光强度变化。

其中，λx表示激发波长，λm表示发射波长；sfmeas(λm)，rmeas(λm)，rmeas(λx)分别表示实际测量的组织荧光光谱，发射波段后向散射光光谱、激发波段后向散射光光谱；idark表示对应的暗背景噪声；l1，l2分别为光强探测器输出的光强信号，分别对应激发光源和可见光照明光源；t1，t2，t3为相应的光谱探测器积分时间；sfcor(λx,m)为校正后的荧光光谱，rcor(λm)为校正后的发射波段后向散射光谱，rcor(λx)为校正后的激发波段后向散射光谱。

为保证sfcor(λx,m)、rcor(λm)以及rcor(λx)与检测设备自身无关，本发明采用w型的光纤探针结构，如图1所示。在测量光谱的同时，实时测量激发光源及照明光源的强度，然后通过上式进行光强归一化。除此之外，如果强度变化过大，如变化超过20％，也可通过调节光源供电电流直接控制光强或改变积分时间进行修正。

提供以上实施例仅仅是为了描述本发明的目的，而并非要限制本发明的范围。本发明的范围由所附权利要求限定。不脱离本发明的精神和原理而做出的各种等同替换和修改，均应涵盖在本发明的范围之内。