一种猫杯状病毒荧光定量检测卡及检测方法与流程

本发明涉及一种猫杯状病毒荧光定量检测卡及检测方法，属于生物检测领域。

背景技术：

猫杯状病毒(felinecalicivirus,fcv)属于杯状病毒科，疱疹病毒属，是一种单链rna病毒，呈正二十面体对称。可引起猫及猫科动物的口腔及呼吸道传染病，也可引起结膜炎，猫杯状病毒也被命名为猫传染性鼻-结膜炎病毒。感染该病毒后，患病动物可出现口腔溃疡、眼鼻分泌物增多、羞明、气管炎和支气管炎等症状。1957年fastier首次分离出该病毒，此后国内科学家也从病猫中分离出该病毒。fcv基因组全长7690bp，编码3个开放阅读框(orf)，orf1编码非结构蛋白，orf2编码衣壳蛋白前体，剩余的orf3编码一种功能未知的蛋白。猫杯状病毒不仅感染猫，也可感染豹子、东北虎及非洲狮等猫科动物。猫杯状病毒单独感染一般不会致命，但如果和其他病原混合感染将会引起致死性疾病。

fcv常和其他病毒和寄生虫等混合感染，且病毒自身较容易变异，导致fcv检测较为困难。目前fcv的检测方法包括血清中和实验、琼脂扩散实验、荧光定量pcr、elisa及胶体金等。这些检测方法需要专业的知识及专业的仪器设备，且对检测人员要求较高，得到的结果需要进行复杂的整理，耗时耗力。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种操作简单、结果易呈现且不需要专业仪器设备和操作人员的猫杯状病毒荧光定量检测卡，实现对猫杯状病毒及时、快速及高灵敏度地检测。

本发明所提供的一种猫杯状病毒荧光定量检测卡，其特征在于，包括加样槽、扫描窗及手持装置，所述加样槽覆盖在样品垫、结合垫及部分反应膜上方，所述扫描窗覆盖在反应膜上方，所述结合垫包被有荧光乳胶微球偶联的抗猫杯状病毒单克隆抗体，所述反应膜含有检测线及质控线，所述检测线包被有抗猫杯状病毒单克隆抗体，所述质控线包被有羊抗鼠多克隆抗体。

所述检测卡可对样本中猫杯状病毒的含量进行定量检测，赋予其特定的au值。

所述检测卡的待检测物为用拭子沾取的猫科动物的粪便及鼻腔、口腔、眼分泌物或血清。

所述加样槽下方样品垫、结合垫及反应膜的组装顺序为：结合垫上方2～3mm压接在反应膜下端，样品垫压接在剩余结合垫下端。

所述加样槽的形状为椭圆形，可容纳150μl液体。

所述检测线包被的抗猫杯状病毒单克隆抗体不同于结合垫上包被的荧光乳胶微球偶联的抗猫杯状病毒单克隆抗体，且检测线包被的抗猫杯状病毒单克隆抗体需要由溶解有0.5％蔗糖的硼酸缓冲溶液稀释。

所述质控线包被的羊抗鼠多克隆抗体需要由硼酸缓冲溶液稀释。

一种猫杯状病毒荧光定量检测卡的制备方法，其特征在于，由以下步骤组成：

(1)将荧光乳胶微球偶联的抗猫杯状病毒单克隆抗体均匀包被在结合垫上，于37℃烘箱中烘干备用；

(2)将稀释的抗猫杯状病毒单克隆抗体均匀包被在反应膜的检测线上，于37℃烘箱中烘干备用；

(3)将稀释的羊抗鼠多克隆抗体均匀包被在反应膜的检测线上，于37℃烘箱中烘干备用；

(4)将制备好的结合垫、样品垫和反应膜组装成包含加样槽、扫描窗和手持装置的检测卡。

本发明提供了一种猫杯状病毒的定量及赋值方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)制备不同含量的猫杯状病毒抗原校准品(0-500au)；

(2)将步骤(1)中稀释好的疫苗加至加样槽中，10min后检测其扫描窗中检测线的荧光值；

(3)将校准品及对应荧光值做线性拟合；

(4)临床样本测试时将测得的检测线荧光值带入拟合函数，计算所对应的au值。

本发明依据检验结果，提供了一种猫杯状病毒病情及预后的判断方法，其特征在于：

0-20au：阴性

20-50au：疑似携带

>50au：阳性

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明基于荧光定量侧向层析技术，一步加样后即可得到定量数值，操作简便。

(2)本发明的检测样本来源于患病动物的粪便、分泌物及血清，无需特殊处理，样本来源广，操作简单。

(3)本发明可对样本中的猫杯状病毒含量进行定量测定，结果较为直观。

(4)本发明提供了一种基于定量数值的猫杯状病毒感染病情及预后判断方法。

附图说明

图1显示了本发明的猫杯状病毒荧光定量检测卡的结构示意图；其中，1指示加样槽，其覆盖在样品垫、结合垫及部分反应膜上方；2指示扫描窗，其覆盖在反应膜上方；3指示手持区；4指示质控线；5指示检测线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但这些实施例仅是范例性的，并不限制本发明的范围。

实施例1.荧光乳胶微球的制备方法，包括以下步骤：

1.荧光乳胶微球的活化

(a)将定量的荧光乳胶微球溶液加到磷酸盐缓冲溶液中，混合均匀后在16000rpm下，离心20min后移去上清液，加入磷酸盐缓冲溶液，超声60s，得到荧光乳胶微球分散液。

(b)向步骤(a)中的荧光乳胶微球分散液中迅速加入edc&nhs活化剂，于涡旋振荡器上混合均匀后，室温下震荡活化30min。

2.荧光乳胶微球的偶联

(c)将步骤(b)中活化好的荧光乳胶微球分散液在16000rpm下，离心20min后移去上清液，用步骤(a)中的缓冲溶液清洗，再次以相同条件离心后弃去上清液，用步骤(d)中的缓冲溶液复溶重悬。

(d)将猫杯状病毒抗原加入缓冲溶液中，使其浓度稀释至0.34mg/ml

(e)将步骤(c)中复溶的荧光乳胶微球分散液加入到步骤(d)中的抗体稀释液中，在涡旋震荡器上混合均匀，超声60s，然后在室温下震荡反应3h。

3.荧光乳胶微球的封闭

(f)反应结束后，将步骤(e)中偶联好的荧光乳胶微球分散液超声60s，在16000rpm下，离心20min后移去上清液，加入封闭液，然后固定在涡旋振荡器上在室温下震荡反应12h。

4.荧光乳胶微球的重悬

(g)将步骤(f)中封闭好的荧光乳胶微球分散液，在16000rpm下，离心20min后移去上清液，再次加入等量的封闭液，混合均匀后再次在相同条件下离心。

(h)离心后，弃去步骤(g)中溶液的上清液，向其中加入微球重悬液，吹打均匀，得到制备好的荧光乳胶微球液分散液。

实施例2.一种猫杯状病毒荧光定量检测卡的制作方法，包括以下步骤：

(1)将结合垫浸泡于溶有bsa的磷酸盐处理液中，干燥后将制备好的荧光乳胶微球分散液均匀喷涂于结合垫上，于烘箱中干燥。

(2)将稀释至2mg/ml的抗猫杯状病毒单克隆抗体以1.6μl/cm的速度喷划于反应膜的检测线上，干燥。

(3)将稀释至2.6mg/ml的羊抗鼠多克隆抗体以1.2μl/cm的速度喷划于反应膜的质控线上，干燥。

(4)将喷涂有荧光乳胶微球的结合垫裁切下来，将前端的2～3mm粘贴覆盖在反应膜上。

(5)将样品垫浸泡于磷酸盐处理液中，干燥，将裁切成宽度为22.5mm的样品垫覆盖在反应膜的后端，且与反应膜下缘平行。

(6)将粘贴好结合垫、样品垫及反应膜的底板切成宽度为3.95mm的试纸条，将试纸条压入卡壳的下盖中，盖上上盖，组装成包含加样槽、扫描窗和手持装置的猫杯状病毒荧光定量检测卡。

步骤(6)中的底板为pvc底板。

步骤(6)中的卡壳为塑料卡壳。

实施例3.一种检测猫杯状病毒的方法，包括以下操作步骤：

(1)用拭子沾取待检动物的粪便及鼻腔、口腔、眼分泌物或血清，将沾取物溶解于稀释液中；

(2)将步骤(1)中的稀释液加至加样槽中，使其逐渐渗入样品垫和结合垫，最终将偶联有抗猫杯状病毒单克隆抗体的荧光乳胶微球渗透至反应膜，使得反应膜的检测线和质控线可以捕获荧光微球；

(3)将检测卡插入配套定量检测仪器中，仪器对扫描窗下的反应膜自动扫描，最终获得稀释液中猫杯状病毒的具体含量；

(4)分析检测结果，生成检测报告，判断患病动物的带毒情况并做进一步的诊断处理。

实施例4.检测卡性能评估

1.稳定性测定

将组装好的检测卡分别放置在4℃及50℃环境下做加速变性实验，每隔7d、14d及21d用试纸条对高、中、低三个浓度水平的样本进行检测，结果显示，三种浓度水平样本的检测cv值分别为4％、6％、6.5％，符合美国临床化学会对临床样本检测稳定性的要求。

2.准确性测定

将猫杯状病毒荧光定量检测卡成品在宠物医院临床检测，检测对象分为健康动物和患病动物，结果显示，95％的健康动物的检测值小于20au，处于正常值的设定范围，92％的患病动物的检测值大于50au，超过正常值的设定范围，说明本检测卡准确性较好，能应用于临床中对猫杯状病毒的即时检测。