一种快速联合检测丙型肝炎病毒抗原抗体的试纸的制作方法

本实用新型属于医学诊断技术领域，具体涉及一种快速联合检测丙型肝炎病毒抗原抗体的试纸。

背景技术：

丙型肝炎是一种全球性传染病。在我国属于乙类传染病的前五位，危害十分严重。丙型肝炎病毒(HCV)是1989年发现的非甲非乙肝炎病毒。主要通过输血、静脉注射等途径传播，危害大、病死率较高，目前市场尚无疗效明确的药物和疫苗进行治疗和预防。因此研制HCV的快速且能广泛应用的检测方法具有重要意义。

HCV抗体检测是目前使用最广泛的检测方法，但其缺点是存在较长的“窗口期”，HCV感染后至HCV抗体产生之前还有一段约40-70天的较长时期(平均66天)，此时献血员已被感染并具有传染性，应用目前的第三代和四代EIA检测试剂都不能检出，称为感染后血清阳转前的“窗口期”(preseroconversion window phase,PWP)。PWP的存在，是输血安全的重要威胁之一，使受血者依然有输入抗HCV筛选阴性的血液而感染HCV的危险。

HCV核心抗原是HCV感染的早期标志，在HCV RNA出现后的1-2天内即出现HCV核心抗原，且与HCV RNA的水平相平行，可以作为HCV复制的标志。有研究表明，HCV核心抗原检测与抗体检测相比，HCV核心抗原的检测可使检测的“窗口期”平均提前49天，缩短“窗口期”感染的风险。

技术实现要素：

为了解决现有技术存在的窗口期长的问题，本实用新型提供了一种快速联合检测丙型肝炎病毒抗原抗体的试纸，其具有操作简单、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等特点。

本实用新型所采用的技术方案为：

一种快速联合检测丙型肝炎病毒抗原抗体的试纸，包括多个试纸条和试纸盒，每个所述试纸包括样品垫，所述样品垫的一端压覆有胶体金垫，所述胶体金垫上吸附有胶体金标记的HCV核心抗原单克隆抗体和胶体金标记的HCV重组融合抗原，所述胶体金垫的另一端压覆有硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜的另一端压覆于吸样垫之下，所述硝酸纤维素膜上包被了三条线，分别为第一检测线、第二检测线和质控线；

进一步的，所述试纸盒包括壳体，所述壳体内设有卷轴，所述壳体上开设有出纸口，多个所述试纸条顺次连接且相连的两个所述试纸条之间设置有易撕刻痕，多个所述试纸条卷绕在所述卷轴上，且所述试纸条可从出纸口伸出。

本实用新型利用胶体金标记HCV重组融合抗原和HCV核心抗原单克隆抗体，在NC膜上包被相应配对的HCV重组融合抗原和HCV核心抗原单克隆抗体，运用夹心法检测待测样品中的HCV抗体和HCV核心抗原，具有操作简单、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点，不仅可以缩短检测的“窗口期”，又可以用于HCV早期筛查和HCV临床辅助诊断，同时也可以提高工作效率、节约成本。

另一方面，将试纸卷绕在卷筒中，保护试纸，免受污染，并将试纸从出纸口中伸出，采用激光技术将刻痕刻制在试纸上，在使用时，将其通过易撕刻痕撕成小条，取用便捷，使用方便。

进一步的，所述样品垫、所述胶体金垫、所述硝酸纤维素膜和所述吸样垫均粘贴在PVC支撑板上。

进一步的，每个所述试纸条的尾端设有一个定位孔，所述壳体上凸设有一个定位柱，所述定位孔的直径与所述定位柱的直径相等。

将定位孔插在定位柱上，可使外露的试纸条固定在壳体上，将壳体作为试纸条的一个握持部件，方便进行检测，检测完之后，将试纸条撕下，防止污染其他试纸条。

进一步的，每个所述试纸条的表面上均可移除的粘附有覆膜，所述覆膜自所述定位孔覆盖至所述所述试纸条的顶端。

试纸条上的覆膜能够防止试纸与空气直接接触，减少试纸中的化学试剂氧化现象，增加试纸的保质期，另外可以防止试纸表面不小心被污染弄脏，利于保证检测效果。

进一步的，所述出纸口的宽度为所述试纸条宽度的1.5～2倍。

本实用新型的有益效果为：

1.利用胶体金标记HCV重组融合抗原和HCV核心抗原单克隆抗体，在NC膜上包被相应配对的HCV重组融合抗原和HCV核心抗原单克隆抗体，运用夹心法检测待测样品中的HCV抗体和HCV核心抗原，具有操作简单、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点，不仅可以缩短检测的“窗口期”，又可以用于HCV早期筛查和HCV临床辅助诊断，同时也可以提高工作效率、节约成本。

2.将试纸卷绕在卷筒中，保护试纸，免受污染，并将试纸从出纸口中伸出，采用激光技术将刻痕刻制在试纸上，在使用时，将其通过易撕刻痕撕成小条，取用便捷，使用方便。

附图说明

为了更清楚地说明本实用新型实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本实用新型的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本实用新型的试纸条的结构示意图；

图2是本实用新型的结构示意图；

图3是图2的剖视图。

图中1-样品垫；2-胶体金垫；3-硝酸纤维素膜；T1线-第一检测线；T2线-第二检测线；C线-质控线；4-吸样垫；5-支撑板；11-试纸条；12-壳体；13-定位柱；14-定位孔；15-卷轴。

具体实施方式

为使本实用新型的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本实用新型的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本实用新型一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本实用新型中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本实用新型所保护的范围。

如图1～3所示，一种快速联合检测丙型肝炎病毒抗原抗体的试纸，包括多个试纸条11和试纸盒，每个所述试纸包括样品垫1，所述样品垫的一端压覆有胶体金垫2，所述胶体金垫2上吸附有胶体金标记的HCV核心抗原单克隆抗体和胶体金标记的HCV重组融合抗原，所述胶体金垫2的另一端压覆有硝酸纤维素膜(NC膜)3，所述硝酸纤维素膜3的另一端压覆于吸样垫4之下，所述硝酸纤维素膜4上包被了三条线，分别为第一检测线T1、第二检测线T2和质控线C。所述样品垫、所述胶体金垫、所述硝酸纤维素膜和所述吸样垫均粘贴在PVC支撑板5上。

本实用新型制备方法包括以下步骤：

1、HCV融合抗原的制备

根据HCV检测针对基因型分布的情况，采用不同基因型的基因片段或者几种基因型基因片段的组合，但选用的氨基酸区段不同，我们对上述基因型区段进行筛选，确定了其中的核心表位区段。为了从含有HCV基因的质粒上扩增出相应的片段，设计引物分别扩增出HCVCore、NS3、NS4片段。再以pMD18T-Core质粒为模板，经PCR扩增，获得相应酶切位点，最终经双酶切后插入到表达载体pET24a中。将其转化到E.coli BL21(DE3)受体菌中，经37℃诱导后,所含目的基因的嵌合抗原获得高效表达。

2、HCV单克隆抗体的制备

将HCV核心抗原50μg/只小鼠的量与福氏佐剂一起乳化，腹部表皮多点免疫BALB/C小鼠，每14天免疫加强一次。4次免疫后，取免疫小鼠的脾脏与瘤细胞按10：1融合，经过多次克隆化筛选出与HCV重组核心抗原有强烈反应并能稳定分泌抗体的单克隆细胞。将其注射进小鼠腹腔，7天左右待小鼠腹部肿胀后处死小鼠并取出腹水，采用硫酸铵沉淀法来纯化腹水，即可得到所需的单克隆抗体。

3、胶体金颗粒制备

采用氯金酸--枸椽酸三钠还原法制备直径为20～40nm的胶体金溶液：取990ml纯化水到入圆底烧瓶中，加入10ml 1％的氯化金，220℃左右加热煮沸，迅速加入20ml 1％枸椽酸三钠水溶液，溶液出现酒红色后，继续煮沸10分钟后停止加热。这样制备成直径大小为20～40nm的胶体金溶液。

4、胶体金垫的制备

取一定体积颗粒大小为20～40nm的胶体金溶液，用0.1M K2CO3溶液将PH值调至8.0左右，然后用磁力搅拌器缓慢搅拌。

4.1HCV重组融合抗原标记：按每100ml溶液慢慢加入1.5mgHCV重组融合抗原，继续搅拌2小时，再滴加终浓度为0.1％的PEG2000和1％BSA进行封闭，20分钟后11000r/min离心1小时，弃上清，沉淀用复溶液(含BSA、蔗糖、吐温20的硼酸盐缓冲液)复溶。

4.2HCV核心抗原单克隆抗体标记：按每100ml溶液慢慢加入0.5mgHCV核心抗原单克隆抗体，搅拌30分钟后，加入10％BSA继续搅拌5分钟，再加入10％的PEG2000，搅拌20分钟，11000r/min离心1小时，弃上清，沉淀用复溶液(含BSA、蔗糖、吐温20的硼酸盐缓冲液)复溶。

4.3制备金垫：将上述用胶体金标记好的HCV重组融合抗原与HCV核心抗原单克隆抗体按1：1混合混匀，按1ml溶液铺22cm2的比例加在无防布上，在温度20℃相对湿度小于30％的干燥间干燥2小时，制成胶体金垫。

5、包被

5.1抗HCV抗体包被：用1×PBS PH7.2～7.4将抗HCV抗体稀释成2mg/ml，然后用喷膜仪在NC膜下部按1ul/cm进行划线(C线)包被。

5.2HCV核心抗原单克隆抗体包被：用1×PBS PH7.2～7.4将HCV核心抗原单克隆抗体稀释成2mg/ml，然后用喷膜仪在NC膜上部按1ul/cm进行划线(T1线)包被。

5.3HCV重组融合抗原包被：用1×PBS PH7.2～7.4将鼠抗人IgG稀释成1.5mg/ml，然后用喷膜仪在NC膜中部按1ul/cm进行划线(T2线)包被。

上述包被完毕，在温度20℃相对湿度小于30％的干燥间干燥12小时，备用。

6、试剂盒组装

将样品垫、胶体金垫、NC膜、吸样垫按图1所示，依次搭接粘贴在底板上，切成3mm宽的小条，制成试纸条，试纸条也可以装在塑料卡中形成检测卡。

7、检测方法

将待测样品平衡至室温，把试纸条或试纸卡平放，在样品垫上加入2～3滴待测样品，若样品中含有HCV核心抗原，则与样品垫上的标记HCV核心抗原单克隆抗体的胶体金结合，形成复合物，并扩散到NC膜上进一步层析，遇到包被在NC膜上T1线处的HCV核心抗原单克隆抗体时，其复合物则又和包被的HCV核心抗原单克隆抗体结合，被捕获在T1线处，当捕获的胶体金复合物达到一定量时，则形成一条肉眼可见的T1线；若待测样品中不含有HCV核心抗原时，则不能形成相应的复合物，也不能形成T1线。同样当待测样品中含有HCV抗体时，则可在T2线处形成一条肉眼可见的T2线，反之，不能形成T2线。但若样品中同时含有HCV核心抗原和HCV抗体时，则可形成两条肉眼可见的T1线和T2线，而C线作为试剂的质控标准，无论样品中是否含有HCV核心抗原和HCV抗体，均会出现一条肉眼可见的C线。5～20分钟用肉眼直接观察结果，并判断其检测结果。

为了使本实用新型在使用中更为方便，所述试纸盒包括壳体12，所述壳体12内设有卷轴15，所述壳体12上开设有出纸口，多个所述试纸条11顺次连接且相连的两个所述试纸条11之间设置有易撕刻痕，多个所述试纸条卷绕在所述卷轴15上，且所述试纸条可从出纸口伸出，所述出纸口的宽度为所述试纸条宽度的1.5～2倍。同时，每个所述试纸条的尾端设有一个定位孔14，所述壳体上凸设有一个定位柱13，所述定位孔14的直径与所述定位柱13的直径相等。

为了防止试纸条免受污染，每个所述试纸条的表面上均可移除的粘附有覆膜，所述覆膜自所述定位孔覆盖至所述所述试纸条的顶端。

以上所述，仅为本实用新型的具体实施方式，但本实用新型的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本实用新型揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本实用新型的保护范围之内。因此，本实用新型的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。