一种水产品中孔雀石绿快速定量检测系统的制作方法

本实用新型涉及一种检测系统，特别是涉及一种水产品中孔雀石绿快速定量检测系统。

背景技术：

孔雀石绿（Malachite Green，MG）是有毒的三苯甲烷类化学物，作为杀菌剂和消毒剂被广泛应用于水产养殖，本品针对鱼体水霉病和鱼卵的水霉病有特效，也可以很好的用于鳃霉病、小瓜虫病、车轮虫病、指环虫病、斜管虫病、三代虫病，和其他一些细菌性疾病都有很好的效果。农业部以将孔雀石绿列为水产上的禁药，非食用鱼的观赏鱼还可以使用。

孔雀石绿既是工业性的染料，又可以说是一种杀真菌剂，许多国家曾经采用孔雀石绿来杀灭鱼类体内外寄生虫和鱼卵中的霉菌，对鱼类水霉病、原虫病等的控制是非常有效的，而且操作起来也非常的方便，价格低廉。只需少量，即会有效果。加上价格便宜，因此人们将广泛使用在水产养殖上。孔雀石绿对治疗鱼身碰撞刮伤是相当有效，可以防止细菌感染，避免伤口溃烂、扩散，常在幼鱼2～3周龄、或捞捕池中成鱼及后续运输过程，在水中添加孔雀石绿治疗鱼身外伤。因此，长期以来孔雀石绿在水产养殖业中的使用极为普遍。

孔雀石绿被鱼体吸收后，会代谢为危害更大的隐性孔雀石绿（Leucomalachite Green，LMG），并沉积于脂肪组织，对人畜具有高毒、高残留及“三致”（致畸、致癌、致突变）等副作用，因此世界上许多国家已将孔雀石绿列为水产养殖禁用药物，美国食品与药物管理局( FDA ) 的规定养殖业不得使用孔雀石绿；欧盟法案2002 /675 /EC的规定，动物源性食品中孔雀石绿和无色孔雀石绿残留总量限制为2μg/kg；日本也明确规定在进口水产品中不得检出孔雀石绿残留；我国在农业行业标准《NY5071- 2002无公害食品鱼药使用准则》中也将孔雀石绿列为禁用药物。我国在2002年前就将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中，禁止用于食品动物。我国标准委员会发布实施GB/T19857—2005《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留的测定》为2µg/kg。由于没有低廉有效的替代品，孔雀石绿在水产养殖中的使用屡禁不止。

为了规范这些要求，市场上就需要大量试剂盒来检测，目前市场上使用检测水产品的孔雀石绿的酶标试剂盒，但ELISA试剂盒需要酶标仪、温育反应条件、洗板条件，操作工作环境和专业技术人员；而快速胶体金虽然检测方便，不需专业技术人员和工作环境，但其检测的灵敏度低，且只能定性，检测范围窄。而本实用新型专利的目的就是克服以上两类试剂盒的各自缺点，通过简单的操作，现场快速、准确、高灵敏地定量（半定量）分析，实现在水产品的现场检测。

技术实现要素：

本实用新型的目的就是提供一种水产品中孔雀石绿快速定量检测系统，能完全解决上述现有技术的不足之处。

本实用新型的目的通过下述技术方案来实现：

一种水产品中孔雀石绿快速定量检测系统，包括层析检测卡、层析扫描仪、客户端和云平台；所述层析扫描仪用于搭载层析检测卡，并对层析检测卡进行扫描；所述层析扫描仪无线连接客户端；客户端通过互联网连接云平台，该云平台用于储存被测孔雀石绿的标准曲线；所述层析检测卡包括装配在外壳内的检测卡本体，该检测卡本体包括底板，在底板上依次设置样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述标记垫由载体基层和标记物组成，标记物为载体基层上喷涂镧系荧光检测微球和镧系荧光质控微球形成的一层膜，所述检测微球和质控微球均为表面带有羧基聚苯乙烯微球，且检测微球和质控微球的粒径均为50～500nm，所述硝酸纤维素膜上包被BSA-LGM半抗原为检测线，包被羊抗鸡抗体为质控线，在外壳上对应样品垫开设加样孔，对应硝酸纤维素膜上的检测线和质控线开设视窗孔；该客户端内置有接收模块、数据处理模块、存储模块和通信模块，所述接收模块、存储模块和通信模块均与数据处理模块连接；接收模块用于接收层析扫描仪传递而来的数据，并传递给数据处理模块；数据处理模块进行数据分析并将结果传递给存储模块和通信模块；通信模块通过互联网连接云平台。

作为优选，所述底板为PVC底板，在PVC底板上从左至右依次粘贴样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，且样品垫的右端搭在标记垫的左端上，标记垫的右端搭在硝酸纤维素膜的左端上，吸水纸左端搭在硝酸纤维素膜的右端上。

作为优选，所述检测微球为标记有孔雀石绿的单抗的微球，质控微球为标记有鸡lgY或兔lgG的质控微球；所述硝酸纤维素膜上的检测线包被BSA-LGM半抗原；所述硝酸纤维素膜上质控线采用的羊抗鸡抗体为羊抗鸡lgY的lgG或者羊抗兔lgG。

作为优选，所述标记在生物原料上的镧系荧光微球的镧系荧光是指镧系元素Eu、Sm或Tb与β－二酮配基产生的荧光。其发光效率高、吸收光谱宽、发射光谱很窄、斯特克斯位移宽，使其荧光光谱分析的灵敏度很高。

作为优选，所述客户端为带有上网功能的手机或平板电脑。

名词解释：

羊抗鸡lgY的lgG：羊抗鸡lgY的免疫球蛋白G；

羊抗兔lgG：羊抗兔lgG的免疫球蛋白G；

鸡lgY：鸡卵黄抗体；

兔lgG：兔免疫球蛋白G；

BSA-LGM半抗原：孔雀石绿通过化合键与BSA耦连形成的高分子复合物。

与现有技术相比，本实用新型的有益效果在于：

1.操作简单，能实现现场快速、准确、高灵敏地定量（半定量）分析，实现食品和饲料的现场检测；

2.灵敏度高，检测的批内差及批间差小，有较好的重复性，性能稳定，与2-硝基苯甲醛衍生物（NPAMOZ、NPSEM、NPAOZ)等呋喃类代谢物的衍生化产品没有交叉反应；

3.可实现孔雀石绿现场快速检测，通过云平台实现统计、管理，具有较高的实用价值。

附图说明

图1是本实用新型实施例一的原理框图；

图2是本实用新型实施例一中层析检测卡的结构示意图；

图3是图1中检测卡本体的结构示意图；

图4是图3的俯视图；

图5是孔雀石绿检测标准曲线；

图6是本实用新型实施例二中层析检测卡的结构示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本实用新型作进一步的说明。

施例一

如图1至图5所示，一种水产品中孔雀石绿快速定量检测系统，包括层析检测卡、层析扫描仪、客户端和云平台。

所述层析扫描仪用于搭载层析检测卡，并对层析检测卡进行扫描；所述层析扫描仪无线连接客户端；客户端通过互联网连接云平台，该云平台用于储存被测孔雀石绿的标准曲线。

所述层析检测卡包括装配在外壳10内的检测卡本体，所述检测卡本体包括PVC底板1，在PVC底板1上从左至右依次粘贴样品垫2、标记垫3、硝酸纤维素膜4和吸水纸5，且样品垫2的右端搭在标记垫3的左端上，标记垫3的右端搭在硝酸纤维素膜4的左端上，吸水纸5左端搭在硝酸纤维素膜4的右端上。所述硝酸纤维素膜4上包被BSA-LGM半抗原为检测线6，包被羊抗鸡抗体为质控线7。在外壳10上对应样品垫2开设加样孔11，对应硝酸纤维素膜4上的检测线6和质控线7开设视窗孔12。

所述硝酸纤维素膜4上质控线4采用的羊抗鸡抗体为羊抗鸡lgY的lgG或者羊抗兔lgG。

所述标记垫3由载体基层和标记物组成，标记物为载体基层上喷涂镧系荧光检测微球和镧系荧光质控微球形成的一层膜，且检测微球为标记有隐性孔雀石绿抗体的微球，质控微球为标记有鸡lgY或兔lgG的质控微球。所述检测微球和质控微球均为表面带有羧基聚苯乙烯微球。并且，检测微球和质控微球的粒径均为50～500nm。

标记垫3上喷的镧系荧光微球，其镧系荧光是指镧系元素与β－二酮配基产生的荧光，标记在生物原料上的镧系荧光微球的镧系荧光物质是指镧系元素Eu、Sm和Tb与β－二酮配基产生的荧光。采用检测仪检测镧系元素与配合物的独特荧光光谱特性。

在进行层析检测时，水产品中孔雀石绿、隐性孔雀石绿抗体的标记物和硝酸纤维素膜上包被的BSA-LGM半抗原通过竟争法来检测水产品中的孔雀石绿。

所述客户端内置有接收模块、数据处理模块、存储模块和通信模块，所述接收模块、存储模块和通信模块均与数据处理模块连接；接收模块用于接收层析扫描仪传递而来的数据，并传递给数据处理模块；数据处理模块进行数据分析并将结果传递给存储模块和通信模块；通信模块通过互联网连接云平台。该客户端为带有上网功能的手机或平板电脑。

工作原理：

将待测样品进行前处理后，滴入层析检测卡的加样孔中，层析15分钟后，将层析检测卡放入层析扫描仪进行扫描，层析扫描仪内的激发光源发出激发光，对层析检测卡进行照射，使得层析检测卡上的荧光微球被激发产生荧光，层析扫描仪逐点采集层析检测卡上的荧光信号强度值，进而完成整个层析检测卡的检测。所述层析扫描仪将检测数据通过蓝牙传递给客户端的接收模块，数据处理模块根据层析检测卡的荧光信号强度检测数据，计算出层析检测卡上质控线和检测线的荧光信号强度值，同时数据处理模块通过通讯模块从云平台获得被测样品的孔雀石绿的标准曲线，并储存在存储模块，数据处理模块根据标准曲线（质控线和检测线的荧光信号强度值与标准曲线的对照关系），计算得出被测样品中孔雀石绿的含量，并进行显示，检测结果储存在存储模块中和云平台。

制备孔雀石绿检测标准曲线：

配置含有孔雀石绿的校准液（含孔雀石绿标准品）6份，浓度分别为0、0.2、0.5、2、10、20ppb（硝基孔雀石绿标准品）。将上述不同浓度的校准液分别加入装配好的层析检测卡的加样孔内，层析15分钟后，通过层析扫描仪进行检测，将6次得到的检测结果线性回归得到标准曲线，参见图4。

所述层析检测卡的使用方法：取2±0.05g均质样本，加入加入1毫升提取液（配方：对甲苯磺酸0.4g/L，盐羟胺0.2g/L，乙酸铵0.4g/L，4M氢氧化钠调PH4.5）盖上盖子剧列振荡2分钟，然后4ml的乙腈盖上盖子剧列振荡3分钟，转速4000r/min离心5分钟；取3毫升上清加入2毫升正已烷振荡1分钟，转速4000r/min离心2分钟，取下层液体1毫升，加入100微升0.7%硼氢化钾还原，60℃吹干。最后加入0.5毫升稀释液（10MmPBS，0.05% Tween-20，pH 为7.4），取80ul下层液体用于加入加样孔11中，在吸水纸5的作用下，样本从样品垫2向吸水纸5方向移动。在避免强光照射的情况下层析15min，然后用层析扫描仪对层析检测卡进行检测，参见图4的标准曲线。

上述层析检测卡的制备方法如下：

步骤一，把硝酸纤维素膜粘贴在PVC底板上，采用点膜喷金专用机器在硝酸纤维素膜上喷涂已稀释至0.3mg/ml的羊抗鸡lgY的lgG形成质控线和已稀释至0.2mg/ml的BSA-LGM半抗原形成检测线，喷量为1μl/cm，然后在37℃的温度下烘制8小时；

步骤二，制备标记有鸡lgY的镧系荧光微球和标记有隐性孔雀石绿抗体的镧系荧光微球，将1mL的镧系荧光微球加入到50mg的MES（2-（N-吗啡啉）乙磺酸）缓冲液（0.1M，pH7.0）中，再加入10mg碳二亚胺（EDC）和10mg N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐搅拌溶解，室温反应30分钟后进行离心操作，将离心沉淀物用50mM硼酸缓冲液（pH8.2）复溶，加入2mg透析过的鸡lgY，在室温条件下搅拌反应24小时，然后离心、封闭后，再在稀释液中保存（保存环境温度为2～8℃），即得标记有鸡lgY的镧系荧光微球；采用上述同样的方法标记隐性孔雀石绿抗体的镧系荧光微球；

步骤三，把标记有鸡lgY和标记有隐性孔雀石绿抗体的镧系荧光微球并分别稀释至浓度0.1μg/ml和3μg/ml，采用点膜喷金机器将其喷涂在载体基层上构成标记垫，喷量为2.5 μl/cm，然后在37℃的温度下烘制8小时；

步骤四，把样品垫、标记垫、吸水纸依次粘在PVC底板上，组装成大卡，再用剪切机切割成5mm宽的试纸条，装配在检测卡外壳内，即得到本孔雀石绿检测卡。

实施例二

参见图6，本实施例与实施例一的不同之处在于，所述层析检测卡的外壳10表面对应吸水纸5的位置开设有多个通孔13，有利于溶剂挥发出外壳10，确保检测结果准确，解决了现有技术的检测卡外壳采用封闭结构，溶剂无法挥发出去的技术问题。

为了保证挥发效果，在外壳10表面与吸水纸5大小相匹配的区域内等间距均匀开设通孔13。

实施例三

本实施例与实施例一或二的不同之处在于，所述检测卡本体倾斜固定在外壳10内，且样品垫2处于低端，吸水纸5处于高端。这种结构使得从加样孔11滴入的待测样品流速减缓，缓慢往上层析，保证足够的层析时间，能有效防止液体样品流动过快而影响检测结果，避免样品过快流入硝酸纤维素膜4导致检测结果失败。因为，如果待测样品流速过快，容易导致层析不充分，进而影响检测结果。检测卡本体倾斜的角度根据待测样品的不同具体进行设计。

实施例四

本实施例与实施例一的不同之处在于，所述层析检测卡的外壳10内设有容纳槽，且在检测卡本体的两侧对称设有2个容纳槽，在容纳槽内安装有片状干燥剂。这种设计使得干燥剂与检测卡本体保持在一起，使得检测卡本体湿度得到有效控制，从而提高检测精度。

作为层析检测卡的另一种优选结构，还可以在层析检测卡的外壳10表面设置带盖的样品储存槽，可以封存样品。所述样品储存槽的盖顶面与外壳10表面齐平，盖上设有凹坑，方便使用者手指施力向外翻开盖。

以上所述仅为本实用新型的较佳实施例而已，并不用以限制本实用新型，凡在本实用新型的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本实用新型的保护范围之内。