用于定量生物试样中的胆汁酸的试剂盒及定量生物试样中的胆汁酸的方法与流程

本发明涉及一种用于定量生物试样中的胆汁酸的试剂盒及定量生物试样中的胆汁酸的方法。
背景技术：
：作为用于定量蛋白质、酶或无机化合物等的高灵敏度且容易的测定法，广泛地利用荧光检测法。荧光检测法为如下方法：检测对认为包含通过特定波长的光被激发而发出荧光的测定对象物质的试样照射上述特定波长的激发光时发出的荧光，由此确认测定对象物质的存在。在测定对象物质不是荧光体的情况下，使利用荧光色素标记与测定对象物质特异性结合的物质而得的物质与试样接触，之后以与上述相同的方式，检测照射激发光时发出的荧光，由此能够确认测定对象物质的存在。在上述荧光检测法中，已知为了提高检测的灵敏度而利用由等离激元共振产生的电场增强的效果的方法。该方法中，为了产生等离激元共振，准备在透明的支撑体上的规定区域设置有金属膜的传感器芯片。然后，从支撑体中的与金属膜形成面相反的一面侧以全反射角度以上的角度对支撑体与金属膜的界面射入激发光。通过照射该激发光而在金属膜产生表面等离激元，通过由该表面等离激元的产生而引起的电场增强作用，荧光得到增强，从而信号/干扰比(S/N比)有所提高。利用表面等离激元激发的荧光检测法(表面等离激元荧光：SurfacePlasmonFluorescence，以下，称为“SPF法”)相较于利用落射激发的荧光检测法(以下，称为“落射荧光法”)，可获得约10倍的信号增强度，从而能够以高灵敏度进行测定。血液中的低分子抗原(例如，甲状腺素(T4)及皮质醇等)很少单独存在，在大多数情况下以与血液中蛋白质(例如，白蛋白等)结合的状态存在。因此，在利用了抗原抗体反应的临床诊断中，需要从血液中蛋白解离低分子抗原，通常可使用水杨酸钠等来作为解离剂。胆汁酸为在哺乳类的胆汁中广泛存在的类固醇衍生物中具有胆烷酸骨架的化合物的统称。关于该胆汁酸，也与其他低分子抗原同样地，在血液中通常与白蛋白等血液中蛋白质、牛磺酸结合，它们被称为结合胆汁酸(胆汁盐)。关于该胆汁酸，通常有10种，但是主要是胆酸、脱氧胆酸及鹅去氧胆酸这3种。将这些多种化合物的集合称为胆汁酸。胆汁酸的主要作用为在消化道内促进胶束的形成，并促进膳食脂肪的吸收。关于狗及猫中的血清胆汁酸的定量，被认为是反映肝细胞功能及肠肝门静脉循环的检查。例如，在显示高肝酶活性但没有黄疸的狗、猫中，为了检测需要临床确诊的肝胆道系统疾病，示出血清胆汁酸的有用性。并且，在先天性门静脉循环分流的诊断中，为了提高诊断率，推荐空腹时及饭后的胆汁酸定量。胆汁酸浓度的值高时，怀疑急性肝炎、慢性肝病、胆汁淤积、肠内细菌过量繁殖、门静脉分流(portosystemicshunt；PSS)等，另一方面，胆汁酸浓度的值低时，怀疑肠吸收不良。如上所述，在狗及猫的诊断中，测定胆汁酸浓度来作为反映肝细胞功能及肠肝门静脉循环的指标，在非专利文献1中公开有简单的胆汁酸的测定方法。另一方面，在血清及其他体液中的配体检验法中，希望减少或者完全去除干扰物质对所观测到的信号的影响。在专利文献1中记载有：作为用于使配体从其络合物解离的解离剂，使用水杨酸或8-苯胺基-1-萘磺酸。以往技术文献非专利文献非专利文献1：Seibertetal.(2014)，PeerJ，DOI10.7717/peerj.539专利文献专利文献1：日本特表2001-513877号公报技术实现要素：发明要解决的技术课题如上所述，在狗、猫的诊断中进行胆汁酸的定量，但是在大型机器或简单的POCT(Pointofcaretesting：重点护理即时检验)测定装置中，也使用利用了酶法的测定方法、显色时利用了酶反应的方法。关于利用酶反应的方法，最佳反应温度范围非常窄，需要将测定装置设定为适于酶反应的最佳的温度，在接通装置的电源之后或低温环境下的测定时等调整为最佳温度，这需要时间，从而存在无法进行迅速的测定的问题。并且，关于作为低分子抗原的胆汁酸，在血液中，与高分子成分(白蛋白等血液中蛋白质)结合而存在，因此为了定量胆汁酸，需要用解离剂使其从血液中蛋白解离。作为解离剂，要求从高分子成分充分地解离胆汁酸成分。本发明的课题在于，提供一种能够从高分子成分充分地解离胆汁酸而提高测定精度，并且能够不受电源接通时或低温环境等测定胆汁酸的环境影响，而在各种环境下迅速地进行高精度的胆汁酸的定量的用于定量胆汁酸的试剂盒以及定量胆汁酸的方法。用于解决技术课题的手段为了解决上述问题，本发明人等对高效地解离与白蛋白结合的胆汁酸的解离剂进行深入研究的结果，发现通过使用干燥状态的铵盐即特定的解离剂而能够解决上述问题，从而完成了本发明。即，根据本发明，提供以下发明。(1)一种试剂盒，其用于定量生物试样中的胆汁酸，所述试剂盒包含：干燥状态的由下述通式(I)表示的化合物；荧光粒子，该荧光粒子包含与胆汁酸具有结合性的第一结合物质；及基板，该基板具有检测区域，所述检测区域包含与胆汁酸或上述第一结合物质中的任一者具有结合性的第二结合物质，[化学式1]式中，R表示-NH-C6H5、-NH2或-NH-CH2-CH2-NH2。(2)根据(1)所述的试剂盒，其中，在通式(I)中，由R表示的基团存在于萘环的5位、7位或8位，其中，萘环上的取代位置如下。[化学式2](3)根据(1)或(2)所述的试剂盒，其中，在通式(I)中，R为-NH-C6H5。(4)根据(1)至(3)中任一项所述的试剂盒，其中，在通式(I)中，由-SO3-表示的基团存在于萘环的1位或3位，其中，萘环上的取代位置如下。[化学式3](5)根据(1)至(4)中任一项所述的试剂盒，其中，上述基板还具有进行用于校正从检测区域获得的数据的测定的参考区域。(6)根据(1)至(5)中任一项所述的试剂盒，其中，包含与胆汁酸具有结合性的第一结合物质的荧光粒子为包含与胆汁酸具有结合性的第一结合物质的荧光胶体粒子。(7)根据(6)所述的试剂盒，其中，上述荧光粒子为荧光乳胶粒子。(8)根据(1)至(7)中任一项所述的试剂盒，其中，与胆汁酸具有结合性的第一结合物质为与胆汁酸具有结合性的至少3种抗体。(9)根据(8)所述的试剂盒，其中，与胆汁酸具有结合性的至少3种抗体包括抗胆酸抗体、抗脱氧胆酸抗体及抗鹅去氧胆酸抗体。(10)一种定量生物试样中的胆汁酸的方法，所述方法包含：处理工序，用干燥状态的由下述通式(I)表示的化合物，对生物试样进行处理；反应工序，使在上述处理工序中被处理的生物试样和包含与胆汁酸具有结合性的第一结合物质的荧光粒子进行反应；及生物试样相关荧光信息获取工序，获取与上述生物试样的量相关的荧光信息，[化学式4]式中，R表示-NH-C6H5、-NH2或-NH-CH2-CH2-NH2。(11)根据(10)所述的方法，其中，在通式(I)中，由R表示的基团存在于萘环的5位、7位或8位，其中，萘环上的取代位置如下。[化学式5](12)根据(10)或(11)所述的方法，其中，在通式(I)中，R为-NH-C6H5。(13)根据(10)至(12)中任一项所述的方法，其中，在通式(I)中，由-SO3-表示的基团存在于萘环的1位或3位，其中，萘环上的取代位置如下。[化学式6](14)根据(10)至(13)中任一项所述的方法，其还包含：荧光粒子相关荧光信息获取工序，获取与上述荧光粒子的量相关的荧光信息；及标准化工序，根据在荧光粒子相关荧光信息获取工序中获取的荧光信息，对在生物试样相关荧光信息获取工序中获取的荧光信息进行标准化。(15)根据(10)至(14)中任一项所述的方法，其中，包含与胆汁酸具有结合性的第一结合物质的荧光粒子为包含与胆汁酸具有结合性的第一结合物质的荧光胶体粒子。(16)根据(15)所述的方法，其中，上述荧光粒子为荧光乳胶粒子。(17)根据(10)至(16)中任一项所述的方法，其中，与胆汁酸具有结合性的第一结合物质为与胆汁酸具有结合性的至少3种抗体。(18)根据(17)所述的方法，其中，与胆汁酸具有结合性的至少3种抗体包括抗胆酸抗体、抗脱氧胆酸抗体及抗鹅去氧胆酸抗体。发明效果根据本发明的试剂盒及方法，能够不受测定胆汁酸的环境影响，而在各种环境下迅速地进行高精度的胆汁酸的定量。附图说明图1表示剥离剂为水杨酸的情况下的相关性及剥离剂为化合物1的情况下的相关性。图2表示本发明的试剂盒中所包含的传感器芯片的示意图。图3表示本发明的试剂盒中所包含的传感器芯片的分解图。具体实施方式以下，对本发明进行进一步详细说明。[用于定量生物试样中的胆汁酸的试剂盒]本发明的用于定量生物试样中的胆汁酸的试剂盒包含：干燥状态的由下述通式(I)表示的化合物；荧光粒子，该荧光粒子包含与胆汁酸具有结合性的第一结合物质；及基板，该基板具有检测区域，所述检测区域包含与胆汁酸或上述第一结合物质中的任一者具有结合性的第二结合物质。[化学式7]式中，R表示-NH-C6H5、-NH2或-NH-CH2-CH2-NH2。(生物试样)作为生物试样，只要是有可能包含作为测定对象物质的胆汁酸的试样，则并无特别限定，例如，能够举出生物试样、尤其动物(例如，人、狗、猫等)的体液(例如，血液、血清、血浆、脊髓液、泪液、汗、尿、脓、鼻涕、或咳痰)或者排泄物(例如，粪便)、器官、组织、粘膜、皮肤等。(胆汁酸)关于胆汁酸，存在10种，但是在狗、猫的情况下，作为胆汁酸，由胆酸、脱氧胆酸及鹅去氧胆酸这3种占大致100％。例如，若用平均值表示狗的血液中的3种结构不同的胆汁酸的比率，则成为胆酸:脱氧胆酸:鹅去氧胆酸＝74％:20％:6％的比例(日本兽医学杂志：TheJapanesejournalofveterinaryscience，52(2)1990)。以下，示出胆酸、脱氧胆酸及鹅去氧胆酸的结构。[化学式8]关于血液中的低分子抗原(例如，甲状腺素(T4)、皮质醇等)，很少单独存在，在大多数情况下以与结合蛋白(例如，白蛋白等)结合的状态存在。因此，在利用了抗原-抗体反应的临床诊断药中，需要从结合蛋白解离低分子抗原。胆汁酸也相同，在血液中，以与白蛋白等结合的状态稳定地存在。作为解离该结合状态的解离剂，通过使用干燥状态的铵盐即由通式(I)表示的化合物，能够从高分子成分充分地解离胆汁酸而提高测定精度，并且能够不受测定胆汁酸的环境影响，而在各种环境下迅速地进行高精度的胆汁酸的定量。推测为，干燥状态的铵盐即由通式(I)表示的化合物能够在血清中充分溶解，由此发挥上述作用效果。(解离剂)在本发明中，作为解离剂，使用由通式(I)表示的化合物。在通式(I)中，由R表示的基团表示苯胺基(-NH-C6H5)、氨基(-NH2)或乙二胺基(-NH-CH2-CH2-NH2)。磺酸基的抗衡阳离子为铵离子(NH4+)。由R表示的基团优选为苯胺基(-NH-C6H5)或氨基(-NH2)，更优选为苯胺基(-NH-C6H5)。由R表示的基团可以存在于萘环的5位、6位、7位或8位中的任一个，但是优选存在于5位、7位或8位，更优选存在于7位或8位，尤其优选存在于8位。由-SO3-表示的基团可以存在于萘环的1位、2位、3位或4位中的任一个，但是优选存在于1位或3位，更优选存在于1位。其中，萘环上的取代位置如下。[化学式9]作为由通式(I)表示的化合物的具体例，可举出以下化合物。[化学式10]化合物1[化学式11]化合物2[化学式12]化合物3[化学式13]化合物4关于由通式(I)表示且抗衡阳离子为NH4+的解离剂，与抗衡阳离子为Mg2+或Na+的解离剂相比，在狗血清中的溶解度高且非常良好，在利用由等离激元共振产生的电场增强的效果的胆汁酸的测定中，能够进行高精度的测定。另外，上述化合物1由TokyoChemicalIndustryCo.，Ltd.(目录编号：A5351，商品名称：ANS-NH4(＝铵8-苯胺基-1-萘磺酸盐(Ammonium8-Anilino-1-naphthalenesulfonate))[疏水荧光探针(Hydrophobicfluorescentprobe)])市售。关于由通式(I)表示的解离剂，为了从高分子成分充分地解离胆汁酸，优选预先混合包含胆汁酸的生物试样的方式。关于解离剂，由于能够稳定地保存，因此优选以干燥的状态保管于容器中，优选当与试样进行混合时在容器中进行溶解而发挥解离功能的方式。作为解离剂的用量，针对每1mL的生物试样，优选为0.1μmol以上且100μmol以下，更优选为0.4μmol以上且50μmol以下。本发明的试剂盒包含干燥状态的由通式(I)表示的化合物。在此，所谓干燥状态，是指以水分含量为30质量％以下的固态包含由通式(I)表示的化合物，而不是作为溶液。该水分含量更优选为20质量％以下，进一步优选为15质量％以下。该水分含量能够通过重量测定法来求出。(第一结合物质)本发明中所使用的第一结合物质为与胆汁酸具有结合性的物质。作为第一结合物质，能够使用抗体，但是并无特别限定。在第一结合物质为抗体的情况下，例如，能够使用由通过胆汁酸被免疫的动物的血清制备的抗血清、从抗血清提纯的免疫球蛋白组分、通过使用通过胆汁酸被免疫的动物的脾脏细胞进行细胞融合而获得的单克隆抗体、或者它们的片段[例如，F(ab’)2、Fab、Fab’或Fv]等。关于这些抗体的制备，能够通过常规方法来进行。而且，关于该抗体，可以是如嵌合抗体等的情况那样施加了修饰的抗体，并且即便是市售的抗体，也能够使用通过公知的方法由动物血清或培养上清液制备的抗体。如上所述，作为第一结合物质，能够使用与胆汁酸具有结合性的(优选特异性识别胆汁酸的)抗胆汁酸抗体。与胆汁酸具有结合性的第一结合物质可以使用与胆汁酸具有结合性的至少3种抗体。即，在胆汁酸中包含胆酸、脱氧胆酸及鹅去氧胆酸，因此在本发明中，作为第一结合物质，可以制作抗胆酸抗体、抗脱氧胆酸抗体及抗鹅去氧胆酸抗体，并使用上述3种抗体。作为抗胆酸抗体、抗脱氧胆酸抗体及抗鹅去氧胆酸抗体的具体的制作方法，例如，以抗胆酸抗体的制作方法为例在以下进行说明。能够混合胆酸、牛血清白蛋白(BovineSerumAlbumin，以下简称为BSA)及缩合剂来制作胆酸·BSA结合体。将结合体用作小鼠免疫致敏抗原，并对于小鼠背部皮下进行多次免疫。在该情况下，能够适当地选择完全佐剂(弗氏完全佐剂(Freund‘sCompleteAdjuvant)：FCA)和/或不完全佐剂(弗氏不完全佐剂(Freund‘sIncompleteAdjuvant)：FIA)并与免疫致敏抗原进行混合而使用。所谓完全佐剂，为刺激免疫的物质，是石蜡与ARLACEL的混合物。所谓不完全佐剂，是指在完全佐剂中添加杀灭的分枝杆菌或结核菌的死菌，并进一步增强抗原性的佐剂。在几个星期中适当进行数次免疫致敏之后从小鼠进行采血并实施抗体效价的测定。在观察到抗体效价的充分的上升的情况下向腹腔内施用抗原，数日后摘除脾脏。通过使以这种方式从免疫小鼠摘除的脾脏细胞与突变株骨髓瘤细胞(骨髓瘤)融合，能够制作具备抗体产生能力的融合细胞。从该融合细胞中仅选择针对目标抗原的抗体产生细胞，进而为了只增殖该细胞株而进行有限稀释。能够进行稀释后的细胞的培养(克隆)。将如此获得的融合细胞株注射到小鼠的腹腔内，并通过增殖腹水型抗体产生细胞，能够在腹水中产生单克隆抗体，回收这些抗体，由此能够获得目标抗体。(荧光粒子)作为本发明中所使用的荧光粒子，能够使用通常能用于免疫反应中的通过荧光而着色的粒子，例如，能够使用荧光聚苯乙烯珠等荧光高分子粒子、荧光玻璃珠等荧光玻璃粒子。作为荧光粒子的材质的具体例，有使用了苯乙烯、甲基丙烯酸、(甲基)丙烯酸缩水甘油酯、丁二烯、氯乙烯、醋酸乙烯酯丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸苯酯或甲基丙烯酸丁酯等单体的高分子、或使用了2种以上的单体的共聚物等合成高分子粉末，优选为使它们均匀地悬浮而得的乳胶。并且，可举出其他有机高分子粉末、无机物质粉末、微生物、血细胞、细胞膜片或脂质体等。包含与胆汁酸具有结合性的第一结合物质的荧光粒子，优选为包含与胆汁酸具有结合性的第一结合物质的荧光胶体粒子。在使用乳胶粒子的情况下，作为乳胶的材质的具体例，可举出聚苯乙烯、苯乙烯-丙烯酸共聚物、苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、苯乙烯-(甲基)丙烯酸缩水甘油酯共聚物、苯乙烯-苯乙烯磺酸盐共聚物、甲基丙烯酸聚合物、丙烯酸聚合物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、氯乙烯-丙烯酸酯共聚物及聚乙酸乙烯酯丙烯酸酯等。作为乳胶，优选为至少包含苯乙烯来作为单体的共聚物，尤其优选为苯乙烯与丙烯酸或甲基丙烯酸的共聚物。乳胶的制作方法并无特别限定，能够通过任意的聚合方法来制作。其中，若抗体标记时存在表面活性剂，则抗体固定化变得困难，因此关于乳胶的制作，优选通过无乳化剂乳化聚合即不使用表面活性剂等乳化剂的乳化聚合来进行。在通过聚合而获得的乳胶本身为荧光性的情况下，能够直接用作荧光乳胶粒子。在通过聚合而获得的乳胶为非荧光性的情况下，能够通过在乳胶中添加荧光物质(荧光色素等)来制作荧光乳胶粒子。即，荧光乳胶粒子能够通过在包含水及水溶性有机溶剂的乳胶粒子的溶液中添加荧光色素并进行搅拌等来制造。还能够将含有荧光色素的脂质体、微胶囊等用作荧光粒子。关于荧光显色，只要吸收并激发紫外光等，并在恢复到基底状态时释放，则并无特别限制，例如，能够使用黄绿色(激发波长505nm/释放波长515nm，以下相同)、蓝色(350～356nm/415～440nm)、红色(535～580nm/575～605nm)、橙色(540nm/560nm)、红橙色(565nm/580nm)、深红色(625nm/645nm)、暗红色(660nm/680nm)等荧光显色。关于发出这些荧光的荧光粒子，例如，能够从ThermoFisher公司获得，在ThermoFisher公司中以FluoSpheres(注册商标)的商品名称市售。荧光粒子的平均粒径根据粒子的材质、定量胆汁酸的浓度范围、测定设备等而不同，但是优选为0.001～10μm(更优选为0.001～1μm)的范围。(平均粒径的测定方法)荧光粒子的平均粒径能够通过市售的粒度分布计等来测量。作为粒度分布的测定法，已知有光学显微镜法、共焦激光显微镜法、电子显微镜法、原子力显微镜法、静态光散射法、激光衍射法、动态光散射法、离心沉降法、电脉冲测量法、色谱法、超声衰减法等，市售与各自的原理对应的装置。从粒径范围及测定的容易度考虑，在本发明中优选使用动态光散射法。作为使用了动态光散射的市售的测定装置，可举出NanotracUPA(NIKKISOCO.，LTD.)、动态光散射式粒度分布测定装置LB-550(HORIBA，Ltd.)、浓缩系统(concentrated-system)粒度分析仪FPAR-1000(OTSUKAELECTRONICSCo.，LTD)、ZETASIZERNanoseries(纳米)(Malvern公司)等，在本发明中，作为在25℃的测定温度下测定出的中值粒径(d＝50)的值而求出。(荧光粒子表面的第一结合物质)作为第一结合物质，使用3种以上的结合物质(例如，抗胆酸抗体、抗脱氧胆酸抗体及抗鹅去氧胆酸抗体)时，能够吸附于1个荧光乳胶粒子的表面而使用。在该情况下，所使用的荧光粒子的每一个荧光粒子具有上述3种结合物质。或者，可以分别制作吸附有上述3种以上的结合物质中的1种(例如，抗胆酸抗体)的荧光乳胶粒子、吸附有上述3种以上的结合物质中的另1种(例如，抗脱氧胆酸抗体)的荧光乳胶粒子及吸附有上述3种以上的结合物质中的又1种(例如，抗鹅去氧胆酸抗体)的荧光乳胶粒子，并使用上述3种荧光乳胶粒子的混合物。优选将用作第一结合物质的3种以上的结合物质吸附于1个荧光粒子(每一个荧光粒子)的表面而使用。胆汁酸为多种不同物质的集合体，但是优选使用具有各种不同物质所结合的所有结合物质的荧光粒子。作为本发明的一方式，能够使用具有抗胆酸抗体、抗脱氧胆酸抗体及抗鹅去氧胆酸抗体的全部的荧光粒子。通过设为上述结构，所有荧光粒子能够与由存在于生物试样中的不同物质构成的所有胆汁酸(即，胆酸、脱氧胆酸及鹅去氧胆酸)进行相互作用。因此，优选将至少3种结合物质结合于每一个荧光粒子。在使用抗体结合荧光粒子的情况下，除抗体结合数的粒子间分布以外，能够对1个生物试样使用1种荧光粒子来进行胆汁酸的定量。(利用第一结合物质进行的荧光粒子的修饰)作为将第一结合物质固定于荧光粒子的方法，例如，记载于日本特开2000-206115号公报、ThermoFisher公司FluoSpheres(注册商标)聚苯乙烯微球F8813中所附的协议等中，能够使用任何制备免疫凝集反应用试剂的公知的方法。并且，作为将作为结合物质的抗体固定于粒子的原理，还能够采用物理吸附及通过共价键进行的化学键合中的任一原理。作为覆盖在将抗体固定于粒子之后未被抗体所包覆的粒子表面的封闭剂，能够使用公知的物质、例如BSA、脱脂牛奶、酪蛋白、源自大豆的成分、源自鱼的成分或聚乙二醇等、以及包含上述物质或性质与上述物质相同的物质的市售的免疫反应用封闭剂等。根据需要，这些封闭剂还能够实施通过热、酸/碱等而进行的部分改性等预处理。以下，例示将抗体固定于粒子的具体的方法。在以粒子的固体成分浓度成为0.1～10质量％的方式进行分散的液中，添加调整为0.01～20mg/mL的浓度的抗体溶液，并进行混合。在温度为4～50℃的条件下持续搅拌5分钟～48小时。接着，通过离心分离或其他方法来分离粒子和溶液，并充分地去除溶液中的未与粒子结合的抗体。之后，反复进行0～10次通过缓冲液清洗粒子的操作。混合粒子和抗体，实施使抗体结合于粒子的操作之后，优选使用不参与抗原抗体反应的成分、优选为蛋白质、更优选为BSA、BlockAce(注册商标)、脱脂牛奶及酪蛋白等封闭剂，保护粒子表面的未结合有抗体的部分。将抗原、抗体等固定于粒子时，能够根据需要添加稳定剂。所谓稳定剂，只要是蔗糖、多糖类等合成高分子或者天然高分子等、稳定抗原、抗体的稳定剂，则并无特别限制，还能够使用ImmunoassayStabilizer(AdvancedBiotechnologiesInc(ABI公司))等的市售的稳定剂。(基板)在本发明中，为了实现高灵敏度的测定，优选采用进行后述表面等离激元荧光(SPF)检测的测定法。作为该情况下的基板，优选使用在表面具有金属膜的基板。作为构成金属膜的金属，只要能够产生表面等离激元共振，则并无特别限定。可优选举出金、银、铜、铝或铂等自由电子金属，尤其优选金。在使用金的情况下，后述检测区域成为金膜表面。上述金属能够单独使用或组合使用。并且，考虑对上述基板的附着性，可以在基板与由金属形成的层之间设置由铬等形成的夹层。金属膜的膜厚是任意的，但是例如优选为1nm以上且500nm以下，尤其优选为10nm以上且200nm以下。若超过500nm，则无法充分地检测介质的表面等离激元现象。并且，在设置由铬等形成的夹层的情况下，该夹层的厚度优选为0.1nm以上且10nm以下。金属膜的形成通过常规方法来进行即可，例如，能够通过溅射法、蒸镀法、离子镀敷法、电镀法、无电解镀敷法等来进行，但是为了设置基板材质和金属膜的混合层来提高金属膜的密合性，优选通过溅射法制作金属膜。在该情况下，基板材质和金属膜的混合层的厚度只要能够确保足够的密合性，则并无特别限制，但是优选为10nm以下。金属膜优选配置于基板上。在此，所谓“配置于基板上”，除了包含金属膜配置成与基板上直接接触的情况，还包含金属膜配置成不与基板直接接触而隔着其他层的情况。作为本发明中能够使用的基板的材质，例如，能够使用作为一般光学玻璃的一种的BK7(硼硅酸盐玻璃)等光学玻璃、或者由合成树脂、具体而言聚甲基丙烯酸甲酯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚碳酸酯或环烯烃聚合物等相对于激光为透明的材料形成的玻璃。这种基板优选为相对于偏振光不显示各向异性且加工性优异的材料。作为用于SPF检测的基板的优选方式，能够举出在聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)上蒸镀金膜而得的基板等。基板具备检测区域，所述检测区域包含与胆汁酸或第一结合物质中的任一者具有结合性的第二结合物质。(第二结合物质)第二结合物质为与胆汁酸具有结合性的物质，或与第一结合物质具有结合性的物质。在通过夹心法(Sandwichassay)进行定量的情况下，作为第二结合物质，能够使用与胆汁酸具有结合性的物质。在通过竞争法进行定量的情况下，作为第二结合物质，能够使用与第一结合物质具有结合性的物质。在本发明中，优选通过竞争法进行定量，作为第二结合物质，优选使用与第一结合物质具有结合性的物质。作为第二结合物质，并无特别限定，但是作为优选的例子，可举出抗原、抗体或它们的复合物，但是优选为抗原，作为第二结合物质，尤其优选使用胆汁酸(其为与第一结合物质具有结合性的物质)。作为第二结合物质，在使用胆汁酸的情况下，第二结合物质优选为构成胆汁酸的至少3种不同结构的物质(胆酸、脱氧胆酸及鹅去氧胆酸等)、或上述3种不同结构的物质与载体的结合体。所谓载体，是指能够与上述至少3种测定对象物质的多个分子结合的物质。在此，作为优选的第二结合物质，是包含相同种类的测定对象物质的多个分子与一分子的载体结合而成的至少3种结合体的方式。作为优选的载体的一例，可举出蛋白质等，其中，具体而言，能够举出牛血清白蛋白等。在本发明中，第二结合物质尤其优选包含胆酸和/或胆酸·白蛋白结合体、脱氧胆酸和/或脱氧胆酸·白蛋白结合体、以及鹅去氧胆酸和/或鹅去氧胆酸·白蛋白结合体。(将第二结合物质固定于基板的方法)关于将第二结合物质固定于基板的方法，例如，记载于由Nunc公司所提供的TechNotesVol.2-12等中，能够使用任何制备一般ELISA(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay：酶联免疫吸附法)试剂的公知的方法。并且，可以通过在基板上配置自组织单分子膜(SAM：Self-AssembledMonolayer(自组装单层膜))等而实施表面修饰，作为将第二结合物质固定于基板的方法，还能够采用利用了物理吸附的方法及利用了通过共价键进行的化学键合的方法中的任一方法。作为覆盖将第二结合物质固定于基板之后未被第二结合物质所包覆的基板表面的封闭剂，能够使用公知的物质、例如BSA、脱脂牛奶、酪蛋白、源自大豆的成分、源自鱼的成分或聚乙二醇等、以及包含上述物质或性质与上述物质相同的物质的市售的免疫反应用封闭剂等。根据需要，这些封闭剂还能够实施通过热、酸/碱等而进行的部分改性等预处理。(检测区域＜测试区域＞)本发明能够在基板上设置检测生物试样中有无胆汁酸的测试区域。在该测试区域中，例如能够通过捕获胆汁酸，检测与胆汁酸结合的标记量并进行定量来定量胆汁酸。或者，能够通过如下方法来定量胆汁酸：仅使得与胆汁酸结合的标记无法结合，只捕获未与胆汁酸结合的标记，并算出与胆汁酸结合的标记量。该检测方法称为竞争法，在此，对与竞争法相关的基板进行说明。优选在基板的测试区域具有与存在于荧光粒子上的所有结合物质(例如，抗体)进行反应的位置。作为本发明的优选的一方式，优选在基板的测试区域上具有存在于试样中的胆汁酸的方式。在该情况下，使胆汁酸和BSA在缩合剂的存在下进行反应，而制作胆汁酸·BSA结合体，将该结合体吸附于测试区域上，由此能够制作测试区域。在该情况下，优选在测试区域上将3种胆汁酸(胆酸、脱氧胆酸及鹅去氧胆酸)·BSA结合体以随机混合的状态配置。胆汁酸·BSA结合体能够通过如下方法来结合于基板上的测试区域：溶解于缓冲液，并点加到基板上，放置一定时间之后，吸出上清液，并进行干燥等。(参考区域＜控制区域＞)在本发明中，为了尽可能地抑制测定环境、尤其是测定温度的影响，在基板上具有控制区域，用控制区域的信息对测试区域的信息进行标准化，由此能够将环境依赖性抑制为非常低。参考区域(控制区域)为进行用于校正从检测区域获得的数据的测定的区域。作为控制区域，优选设计成不依赖于所使用的生物试样中的待检测的测定对象物质的量，而能够与所有标记结合。优选具有与作为标记的荧光粒子上所存在的所有抗体相互作用的抗体。通过如此设计，用控制区域的信息对测试区域的信息进行标准化，由此即使在例如低温环境下生物试样的流动、反应速度受到影响的情况下，也能够通过标准化消除该影响，并能够获得始终高精度且不受测定环境影响的结果。作为存在于控制区域中的优选的抗体，若具有识别存在于荧光粒子上的3种以上的结合物质(例如，抗体)的功能，且该抗体源自小鼠，则优选为抗小鼠抗体，若荧光粒子上的抗体源自山羊，则优选为抗山羊抗体。这些控制区域上的抗体能够通过如下方法来结合于基板：溶解于缓冲液，并点加到基板上，放置一定时间之后，抽吸上清液，并进行干燥等。(非特异性吸附防止物质)本发明的试剂盒优选进一步利用与胆汁酸不具有特异性结合性的物质、或者结合物质修饰荧光粒子。例如，在竞争法中，存在除了对不包含胆汁酸且呈阴性的生物试样起反应以外，还对包含胆汁酸且呈阳性的生物试样起反应而呈阴性的生物试样，解决高值偏差的问题被认为是一种课题。虽然显示这种假阴性的原因尚不明确，但认为其原因之一应该是通过未被抗体覆盖的荧光粒子表面和检测区域(测试区域)的非特异性相互作用而存在原来不希望结合的荧光粒子。并且，即使在与存在于测试区域上的物质相同的物质存在于荧光粒子表面上的情况下，游离的抗体等存在于生物试样中时，该抗体与存在于测试区域上的物质和荧光粒子表面上的物质中的两者均结合，由此即使在测定包含胆汁酸且呈阳性的生物试样的情况下有时也检测为阴性。通常，为了抑制对固相表面(例如荧光粒子表面、基板的金膜表面)的非特异性吸附，使用利用BSA的封闭，但是在某种特定的生物试样中存在与BSA进行反应的抗BSA抗体的情况下，以在荧光粒子上的BSA与基板上的BSA之间进行交联的方式进行反应，从而有时会引起高值偏差。因此，作为优选的结合物质，优选使用与胆汁酸不具有特异性结合性，且不与显示如上述那样的假阴性的原因物质结合的物质。作为结合物质，能够使用与胆汁酸不具有结合性的抗体、或者不用于测试区域的蛋白质(蛋白质A(ProteinA)、蛋白质G(ProteinG))等，但是其中优选为与胆汁酸不具有结合性的抗体。具体而言，能够使用由通过与胆汁酸不同的抗原被免疫的动物的血清制备的抗血清、从抗血清提纯的免疫球蛋白组分、通过使用通过胆汁酸被免疫的动物的脾脏细胞进行细胞融合而获得的单克隆抗体、或者它们的片段[例如，F(ab’)2、Fab、Fab’或Fv]等。关于这些抗体的制备，能够通过常规方法来进行。而且，关于该抗体，可以是如嵌合抗体等的情况那样施加了修饰的抗体，并且即便是市售的抗体，也能够使用通过公知的方法由动物血清或培养上清液制备的抗体。在本发明中，作为结合物质，尤其优选使用抗CRP(C反应性蛋白)抗体的方式。(抗体)在本发明中，抗体能够与其动物种类、亚类等无关地使用。例如，在本发明中能够使用的抗体为源自小鼠、大鼠、仓鼠、山羊、兔子、绵羊、牛、鸡等能够引起免疫反应的生物的抗体，具体而言，为小鼠IgG、小鼠IgM、大鼠IgG、大鼠IgM、仓鼠IgG、仓鼠IgM、兔子IgG、兔子IgM、山羊IgG、山羊IgM、绵羊IgG、绵羊IgM、牛IgG、牛IgM、鸡IgY等，多克隆或单克隆均能够使用。片段化抗体为衍生自具有至少1个抗原结合位点的完整抗体的分子，具体而言为Fab、F(ab’)2等。这些片段化抗体为通过酶或化学处理、或者利用基因工程学方法而获得的分子。(试剂盒的其他要件)本发明的试剂盒用于测定胆汁酸的方法，且为胆汁酸测定诊断用试剂盒。在本发明中为包含传感器芯片的试剂盒，该传感器芯片包含实施胆汁酸的测定时固定有胆汁酸·白蛋白结合体等第二结合物质的基板和保持干燥状态的由上述通式(I)表示的化合物的第一容器及作为保持荧光粒子的部件的第二容器，但也可以包含表面等离激元激发装置及荧光测定设备等用于胆汁酸的测定的各种设备或装置。而且，作为试剂盒要件，可以包括包含已知量的胆汁酸的试样、操作说明书等。[定量生物试样中的胆汁酸的方法]本发明的定量生物试样中的胆汁酸的方法包含：处理工序，用干燥状态的由下述通式(I)表示的化合物，对生物试样进行处理；反应工序，使在上述处理工序中被处理的生物试样和包含与胆汁酸具有结合性的第一结合物质的荧光粒子进行反应；及生物试样相关荧光信息获取工序，获取与上述生物试样的量相关的荧光信息。用干燥状态的由通式(I)表示的化合物，对生物试样进行处理的处理工序，能够通过如下方式进行：混合生物试样(通常为液态)和干燥状态的由通式(I)表示的化合物，并将由通式(I)表示的化合物溶解于生物试样(液体)中。干燥状态的由通式(I)表示的化合物包含于本发明的试剂盒中，优选为包含于作为试剂盒的一部分的容器中、例如杯中的方式，上述处理工序能够在该杯的内部进行。进行上述处理工序的环境条件并无特别限定，但是通常能够在0℃～40℃、优选为10℃～30℃下进行。具有第一结合物质的荧光粒子包含于本发明的试剂盒中，优选为包含于作为试剂盒的一部分的容器中、例如杯中的方式，优选为该容器为与包含干燥状态的由通式(I)表示的化合物的容器不同的容器的方式。使在上述处理工序中被处理的生物试样和具有与胆汁酸具有结合性的第一结合物质的荧光粒子进行反应的反应工序，能够通过如下方式进行：将通过将由通式(I)表示的化合物溶解于生物试样(液体)中而获得的溶液注入包含荧光粒子的容器中，与包含与胆汁酸具有结合性的第一结合物质的荧光粒子进行混合，并进行搅拌。通过获取与生物试样的量相关的荧光信息的生物试样相关荧光信息获取工序，定量胆汁酸。关于本发明中的定量，只要是胆汁酸的量的测定，则以最广泛的概念来解释。作为测定方法的具体实施方式，可举出竞争法及夹心法，但是优选竞争法。以下，对竞争法的一例进行说明。在竞争法中，首先，使包含胆汁酸的生物试样及抗胆汁酸抗体标记荧光粒子与固定有胆汁酸/白蛋白比为7以上且14以下的胆汁酸·白蛋白结合体的胆汁酸免疫测定用基板接触。在该生物试样中不存在胆汁酸的情况下，通过抗胆汁酸抗体标记荧光粒子和基板上的胆汁酸(即，胆汁酸·白蛋白结合体中的胆汁酸)，在基板上引起抗原抗体反应。另一方面，在生物试样中存在胆汁酸的情况下，在生物试样中的胆汁酸与抗胆汁酸抗体标记荧光粒子之间引起抗原抗体反应，阻碍抗胆汁酸抗体标记荧光粒子与基板上的胆汁酸(即，胆汁酸·白蛋白结合体中的胆汁酸)之间的抗原抗体反应。在上述反应结束之后，去除未与基板上的白蛋白结合的抗胆汁酸抗体标记荧光粒子。接着，通过检测基板上的免疫复合物(即，抗胆汁酸抗体标记荧光粒子和基板上的胆汁酸·白蛋白结合体中的胆汁酸的复合物)的形成程度来作为荧光强度，能够测定生物试样中的胆汁酸的浓度等。竞争法中的荧光的测定方式能够采用酶标仪测定或者流量测定中的任一测定，例如，能够通过以下方法来进行测定。预先，准备多个胆汁酸浓度不同且胆汁酸量是已知的试样，并预先混合该试样及抗胆汁酸抗体标记荧光粒子。使该混合液与固定有胆汁酸·白蛋白结合体的区域接触。在混合液与结合体以特定的时间间隔接触的期间，测定来自固定有胆汁酸·白蛋白结合体的区域的荧光信号来作为多个荧光信号。根据该多个荧光信号，在各胆汁酸浓度下，求出荧光量的时间变化(斜率)。将该时间变化绘制为Y轴，且将胆汁酸浓度绘制为X轴，使用最小二乘法等适当的拟合方法，获取胆汁酸浓度相对于荧光量的时间变化的关系式。根据如此获取的关系式，并利用使用了作为检查目标的生物试样的荧光量的时间变化的结果，能够定量生物试样中所包含的胆汁酸量。该胆汁酸量的定量优选在短时间内进行。具体而言，优选在10分以内进行，更优选8分以内，进一步优选在6分以内进行。优选在该定量时间中包含如下时间，即利用使用最小二乘法等适当的拟合方法预先获取的荧光量的时间变化和胆汁酸浓度的关系式，使试样及抗胆汁酸抗体标记荧光粒子与固定有胆汁酸·白蛋白结合体的检测区域接触之后，根据使用了作为检查目标的生物试样的荧光量的时间变化的结果，换算生物试样中所包含的胆汁酸量的时间。在夹心法中，并无特别限定，但是例如能够通过以下步骤来测定胆汁酸。使有可能包含胆汁酸的生物试样和包含与胆汁酸具有结合性的第一结合物质的荧光粒子在基板上接触。在生物试样中存在胆汁酸的情况下，在胆汁酸、荧光粒子及基板之间产生结合反应(抗原抗体反应等)。其结果，在生物试样中存在胆汁酸的情况下，形成由与基板结合的第二结合物质、胆汁酸及具有第一结合物质的荧光粒子形成的免疫复合物。在夹心法中，在第二结合物质、胆汁酸及具有第一结合物质的荧光粒子的反应结束之后，去除未形成上述免疫复合物的、具有第一结合物质的荧光粒子，并进行清洗。接着，通过检测免疫复合物的形成程度来作为荧光强度，能够测定胆汁酸的浓度等。另外，荧光强度与胆汁酸的浓度具有正相关关系。(流路)本发明的优选的方式中，能够将混合有可能包含胆汁酸的生物试样和具有第一结合物质的荧光粒子而得的混合液应用于基板上，并展开在流路上。所谓流路，只要是使生物试样和具有第一结合物质的荧光粒子流下至检测区域的通道，则并无特别限制。作为优选的流路的方式，存在点加包含具有第一结合物质的荧光粒子的生物试样液的点加口、作为检测区域的金属膜及超越金属膜的流路，且具有生物试样能够在金属膜上通过的结构。优选为，能够相对于金属膜，在与点加口相反的一侧设置抽吸口。(表面等离激元荧光测定)作为本发明中的荧光的检测方法，并无特别限定，但是例如优选使用能够检测荧光强度的设备、具体而言使用酶标仪或用于进行利用表面等离激元激发的荧光检测(SPF)的生物传感器等来检测荧光强度。另外，荧光的测定方式可以是酶标仪测定，也可以是流量测定。利用表面等离激元激发的荧光检测法(SPF法)较利用落射激发的荧光检测法(落射荧光法)，能够以高灵敏度进行测定。作为表面等离激元荧光(SPF)生物传感器，例如能够使用如日本特开2008-249361号公报中记载那样的传感器，所述传感器具备：光波导，由透射规定波长的激发光的材料形成；金属膜，形成于该光波导的一表面上；光源，产生光束；光学系统，使上述光束通过光波导，并以产生表面等离激元的入射角射入于上述光波导与金属膜的界面；及荧光检测机构，检测通过由利用上述表面等离激元被增强的渐逝波激发而产生的荧光。本发明的利用使用了荧光粒子的表面等离激元激发的荧光检测(SPF)系统优选为检测依赖于固定于基板上的金属膜上的胆汁酸的量的来自荧光物质的荧光的测定方法，且为与所谓的乳胶凝集法不同的方法，所述乳胶凝集法为例如检测光学透明度随着溶液中的反应的进行的变化来作为浊度的方法。在乳胶凝集法中，乳胶试剂中的抗体致敏乳胶和生物试样中的抗原通过抗体反应而结合，并进行凝集。该凝集块随着时间而增大，根据向该凝集块照射近红外光而获得的每单位时间的吸光度变化，定量抗原浓度的方式为乳胶凝集法。在本发明中，与乳胶凝集法相比，能够提供一种非常简单的胆汁酸的检测方法。(标准化)进而，本发明的方法可以是如下方法，该方法包含获取与生物试样中的胆汁酸相关的荧光信息的生物试样相关荧光信息获取工序、及获取与荧光粒子的量相关的荧光信息的荧光粒子相关荧光信息获取工序、以及通过在荧光粒子相关荧光信息获取工序中获取的荧光信息，对在生物试样相关荧光信息获取工序中获取的荧光信息进行标准化的标准化工序。在此，测定使含有用由通式(I)表示的化合物处理的生物试样与包含与胆汁酸具有结合性的第一结合物质的荧光粒子的混合液与具有检测区域(测试区域)和参考区域(控制区域)的基板接触并在检测区域和参考区域上产生表面等离激元而被释放的荧光的强度的工序中，测定基于在检测区域上产生的表面等离激元的荧光的强度的工序为生物试样相关荧光信息获取工序，测定基于在参考区域上产生的表面等离激元的荧光的强度的工序为荧光粒子相关荧光信息获取工序。求出在该2个工序中获取的荧光强度在单位时间内的增加速度来作为荧光信号值的变化率，检测区域的信号值的变化率除以参考区域的信号值的变化率的工序为标准化工序。通过以下的实施例，对本发明进行进一步具体的说明，但是本发明不受实施例的限定。实施例实施例1：(1)胆汁酸·牛血清白蛋白结合体的制备(1-1)胆酸·牛血清白蛋白结合体的制备向超级脱水二甲基甲酰胺(以下，标记为DMF。WakoPureChemicalIndustries，Ltd.制造)1.2mL中添加胆酸(WakoPureChemicalIndustries，Ltd.制造)50mg、N-羟基琥珀酰亚胺(以下，标记为NHS。WakoPureChemicalIndustries，Ltd.制造)67mg、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(以下，标记为EDC。WakoPureChemicalIndustries，Ltd.制造)110mg并进行混合，对胆酸进行了活性酯化。将该经活性酯化的胆酸滴加于溶解有作为白蛋白的1种的牛血清白蛋白(以下，标记为BSA。WakoPureChemicalIndustries，Ltd.制造)322mg的磷酸缓冲液(以下，标记为PBS。WakoPureChemicalIndustries，Ltd.制造)65mL的水溶液中并进行了反应。反应结束之后，使用乙腈(以下，标记为ACN。WakoPureChemicalIndustries，Ltd.制造)/水的比率为1/3的溶液1L并通过透析对反应溶液进行了提纯。最后进行冷冻干燥，获得了白色的固体。[化学式14](1-2)脱氧胆酸·BSA结合体的制备向超级脱水DMF1.2mL中添加脱氧胆酸(WakoPureChemicalIndustries，Ltd.制造)50mg、NHS67mg、EDC110mg并进行混合，对脱氧胆酸进行了活性酯化。将该经活性酯化的脱氧胆酸滴加于溶解有BSA322mg的PBS65mL的水溶液中，并进行了反应。反应结束之后，使用ACN/水的比率为1/3的溶液1L并通过透析对反应溶液进行了提纯。最后进行冷冻干燥，获得了白色的固体。(1-3)鹅去氧胆酸·BSA结合体的制备向超级脱水DMF1.2mL中添加鹅去氧胆酸(WakoPureChemicalIndustries，Ltd.制造)50mg、NHS67mg、EDC110mg并进行混合，对鹅去氧胆酸进行了活性酯化。将该经活性酯化的鹅去氧胆酸滴加于溶解有BSA322mg的PBS65mL的水溶液中，并进行了反应。在反应结束之后，使用ACN/水的比率为1/3的溶液1L并通过透析对反应溶液进行了提纯。最后进行冷冻干燥，获得了白色的固体。(2)利用MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)的胆汁酸/BSA标记摩尔比(结合体的胆汁酸/白蛋白比)的测定(测定步骤)将在(1-1)至(1-3)中制备的结合体溶解于0.1质量％三氟乙酸(TFA):ACN的比率为2/1的溶液中，并调整为1mg/mL的浓度。混合该溶液1μL和基质(SA；芥子酸(WakoPureChemicalIndustries，Ltd.制造))4μL，并在金板上以1μL点加了4个点。在自然干燥之后，将金板插入MALDI-TOF-MS装置(AppliedBioSystems公司的产品Voyager)中，每个点累计900个镜头，并获取了成为质量信息的数据(N＝4)。使用该数据，采用与胆汁酸·BSA结合体对应的峰值的、峰值强度的最大值的50％强度处的分子量中心值来作为BSA结合体的峰值，并将从该峰值垂直下垂的位置视作胆汁酸·BSA结合体的分子量，取N＝4的平均值，以(胆汁酸·BSA结合体的分子量-天然(native)BSA的分子量)/胆汁酸的分子量(例如，在胆酸的情况下为408-18＝390)计算出胆汁酸相对于BSA的结合数。将所获得的结合体的胆汁酸/BSA比示于表1中。[表1]结合体胆汁酸·BSA结合体胆汁酸/BSA摩尔比结合体-1胆酸·BSA13结合体-2脱氧胆酸·BSA13结合体-3鹅去氧胆酸·BSA13(3)产生相对于胆酸的抗体、相对于脱氧胆酸的抗体、或相对于鹅去氧胆酸的抗体的杂交瘤的制作、以及抗体产生(3-1)免疫原使用了在上述制作的各2mg胆酸·BSA结合体、脱氧胆酸·BSA结合体及鹅去氧胆酸·BSA结合体来作为小鼠免疫致敏的免疫原。(3-2)杂交瘤的制备作为小鼠免疫致敏的免疫原，使用了胆酸·BSA结合体。将第一次免疫设为100μg/只的量，将第2次以后的免疫设为50μg/只的量，在小鼠背部皮下施用胆酸·BSA结合体并进行了免疫。在免疫中，第一次施用与完全弗氏佐剂(CompleteFreund‘sadjuvant；CFA)混合而得的乳剂，在第2次～第4次的免疫中施用了与不完全弗氏佐剂(IncompleteFreund’sadjuvant；IFA)混合而得的乳剂。以2周间隔进行了4次免疫。另外，第3次、第4次免疫的第二周进行采血，使用采血清100μL并通过ELISA测定来进行了抗体效价的测定。确认抗体效价为目标值，将第4次免疫起2周后的免疫作为最终免疫，用磷酸缓冲液(PBS，WakoPureChemicalIndustries，Ltd.制造，pH7.1～7.3)1mL稀释溶解作为抗原的结合体，以施用于小鼠的腹腔内的形式进行。施用3天后摘除了小鼠的脾脏。以7:1的细胞数的比例混合从小鼠摘除的脾脏细胞和突变株骨髓瘤细胞(骨髓瘤：P3-X63-Ag8-U1)之后，添加聚乙二醇(PEG)，在离心分离后漂浮于培养基(RPMI-1640(罗斯威尔帕克纪念研究所培养基：RoswellParkMemorialInstituteMedium)+10质量％胎牛血清(FetalBovineSerum：FBS))。将该漂浮的脾脏细胞接种到96孔板，以使细胞数量成为1.0×105(细胞/孔)。第二天，添加HAT培养基(次黄嘌呤·氨基蝶呤·胸苷培养基)，用抗体测定系统的ELISA对所增殖的杂交瘤的培养上清液进行了筛选。用PBS稀释作为测定用抗原的胆酸·BSA结合体以使成为500ng/mL，添加到ELISA的杯中并静置，将测定用抗原固定于杯的底部，并去除上清液。作为针对成为测定对象的脾脏细胞所产生的抗体的二次抗体，使用了抗小鼠IgGHRP标记抗体。IgG表示免疫球蛋白G，HRP表示辣根过氧化物酶。使用24孔板培养根据ELISA的结果呈阳性的孔，采集了各1mL的培养上清液。用相同的抗体测定系统的ELISA再次进行了二次筛选。在细胞融合时的同一个孔中，选择ELISA信号高的前6个孔而放入小瓶中。使用包含10质量％的FBS的基础培养基RPMI1640，对每一个小瓶中的细胞进行有限稀释而制备了稀释物。用移液管向6个96孔板的每一个孔中添加了一滴稀释物。通过显微镜对每一个孔进行观察，确认到每一个孔中的细胞为单细胞。培养3周之后，以与上述相同的方式，通过抗体测定系统的ELISA对增殖的杂交瘤的培养上清液进行了筛选。选择ELISA信号高的前10个孔，结束了杂交瘤的制备。关于所获得的抗体的亚类的确定，使用了Isotypingkit(Roche公司制造)。(3-3)利用小鼠腹水法的抗体的产生进一步以相同的方式，对所选择的10个孔的细胞进行ELISA筛选，对于信号高的前1个孔的细胞，通过小鼠腹水法(使用2只小鼠)制作了抗体。将所获得的抗体称为抗胆酸抗体-1。(3-4)针对月脱氧胆酸的抗体及针对鹅去氧胆酸的抗体的制备针对脱氧胆酸的抗体及针对鹅去氧胆酸的抗体的制备也以与上述相同的方式进行。将所获得抗体分别称为抗脱氧胆酸抗体-1及抗鹅去氧胆酸抗体-1。(3-5)抗体的亚类和抗体产生量将在上述制备的抗体的亚类和抗体产生量示于表2中。[表2]亚类和产生抗体量(4)抗小鼠抗体的制作准备源自小鼠的球蛋白(LAMPIREBiologicalLaboratories公司制造，目录编号7404302，小鼠γ—球蛋白盐析法(MouseGammaGlobulinSaltFractionation)，500mg)，通过第一次施用与完全弗氏佐剂(CFA)混合而得的乳剂，且在第2次～第4次的免疫中施用与不完全弗氏佐剂(IFA)混合而得的乳剂的方法，对于对山羊的免疫致敏(皮下免疫)以2周间隔进行了4次免疫。然后，进行ELISA测定并确认抗体效价的上升之后，进行全血采集，通过离心分离获得了抗血清。然后，通过ProteinA柱(Thermoscientific公司制造的PierceProteinAColumns，目录编号为20356)进行提纯，从而获取了目标抗小鼠抗体。(5)抗CRP抗体的制作准备市售的人CRP(KITAYAMALABESCO.，LTD.制作)，通过第一次施用与完全弗氏佐剂(CFA)混合而得的乳剂，且在第2次～第4次的免疫中施用于不完全弗氏佐剂(IFA)混合而得的乳剂的方法，对于对小鼠的免疫致敏(皮下免疫)以2周间隔进行了4次免疫。然后，进行ELISA测定并确认抗体效价的上升之后，进行全血采集，通过离心分离获得了抗血清。然后，通过ProteinA柱(Thermoscientific公司制造的PierceProteinAColumns，目录编号为20356)进行提纯，从而获取了目标抗CRP抗体-1。(6)吸附有3种抗胆汁酸抗体的荧光粒子1的制备以如下方式制备了用3种抗胆汁酸抗体标记的荧光粒子。在2质量％(固体成分浓度)荧光乳胶粒子水溶液(Invitrogen公司制造，平均粒径200nm)357μL中，添加50mmol/L的MES(2-吗啉乙磺酸(2-Morpholinoethanesulfonicacid))缓冲液(pH6.0)282μL，并添加5mg/mL的抗胆酸抗体-1(在上述制作的)5.3μL、5mg/mL的抗脱氧胆酸抗体-1(在上述制作的)5.3μL、5mg/mL的抗鹅去氧胆酸抗体-1(在上述制作的)6.9μL及5mg/mL的抗CRP抗体-1(虚拟)(在上述制作的)75.5μL，在室温下搅拌了15分钟。然后，添加10mg/mL的EDC水溶液7.5μL，在室温下搅拌了1.5小时。添加2mol/L的甘氨酸(Glycine)(WakoPureChemicalIndustries，Ltd.制造)水溶液37.5μL并搅拌15分钟之后，进行离心分离(15,000rpm，4℃，15分)，使荧光乳胶粒子沉淀，rpm表示每分钟转速(revolutionperminute)，为1rpm＝1min-1。然后，去除上清液，添加PBS(pH7.4)750μL，通过超声波清洗机使荧光乳胶粒子再分散。再次进行离心分离(15,000rpm，4℃，15分)并去除上清液之后，添加包含1质量％BSA的PBS(pH7.4)750μL，使荧光乳胶粒子再分散，由此制备了结合有3种抗胆汁酸抗体和抗CRP抗体的荧光乳胶粒子的1质量％溶液。(7)基板的制作准备了聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)的基板(MITSUBISHIRAYONCO.，LTD.制造，ACRYPET(注册商标)VH)。通过磁控溅射法，在检测区域和参考区域这两处，分别以单面宽度成为4mm，且长度成为3mm的方式制作厚度为45nm的金膜，并将其用作用于构成基板的芯片。在该芯片的检测区域的金膜表面上，点加以含有比率(以质量比计为1:1:1)包含结合体1、结合体2及结合体3的液(浓度：在50mmol/L的MES缓冲液(pH6、150mmol/LNaCl)中为50μg/mL)，并进行干燥，从而制作了多个固定有3种结合体的基板1。并且，在各基板的参考区域中，点加包含在(4)中制作的抗小鼠抗体的液(浓度：在50mmol/L的MES缓冲液(pH6、150mmol/LNaCl)中为50μg/mL)，并进行了干燥。在将如此制备的多个基板1用作传感器芯片的流路之前，使用预先制备的清洗用溶液(包含0.05质量％Tween20(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯，WakoPureChemicalIndustries，Ltd.制造)的PBS(pH7.4))300μL，反复清洗了3次。(8)流路型传感器芯片的制作以成为日本特开2010-190880号公报的第2实施方式的结构的方式，制作了流路型传感器芯片。将其示意图示于图2、图3。图2为传感器芯片1的示意图，图3为传感器芯片1的分解图。传感器芯片1由上部部件2、中间部件3及基板4构成。在上部部件2设置有第一容器5及第二容器6。另外，将第一容器5及第二容器6统称为容器组7。在基板4上形成有流路10，在流路10上形成有检测区域8及参考区域9。(9)利用大型机器(现有的胆汁酸测定试剂)的测定在免疫测定中，通过作为由本领域技术人员广泛使用的大型机器的日立自动分析装置7170，根据操作说明书，准备76种胆汁酸的量不同的试样并分别进行测定，获得胆汁酸的测定量，由此作为胆汁酸的量为已知的试样。(10)使用了荧光粒子的胆汁酸的免疫测定(10-1)使用了化合物1的剥离剂的情况下的胆汁酸的免疫测定准备专用杯，添加化合物1的剥离剂51μg并进行了干燥。准备了通过(9)的大型机器(日立自动分析装置7170)测定出的胆汁酸的量为已知的试样。在25℃的环境下，在包含经干燥的化合物1(水分含量为15质量％以下)的杯中，添加100μL的上述试样，溶解并混合解离剂和试样，放置了5分钟。然后，在包含在(6)中制备的吸附有3种胆汁酸抗体的荧光粒子1的杯中，预先经10分钟一边搅拌一边进行了混合。接着，分别点加在密封有在(7)中制作的基板1的流路型传感器芯片。点加之后，一边进行泵抽吸一边使混合液以10μL/分的速度流下，并与固定有胆汁酸·BSA结合体的金膜表面上接触之后，持续1.5分钟在检测区域和参考区域上产生表面等离激元，测定了所释放的荧光的强度。求出在各基板中获得的检测区域及参考区域各自的荧光强度在单位时间内的增加速度来作为荧光信号值的变化率，并将检测区域的信号值的变化率除以参考区域的信号值的变化率，由此进行了标准化。并且，准备胆汁酸浓度为0的试样，并以相同的方式，由没有胆汁酸的试样进行了荧光信号值的标准化。(10-2)将水杨酸用作解离剂的情况下的胆汁酸的免疫测定(10-1)的免疫测定中，将化合物1的解离剂变更为水杨酸(针对每一个专用杯为1.12mg)，除此之外，以与(10-1)相同的方式，进行免疫测定，进行了荧光信号值的标准化。(11)校准曲线的制作使对于在(10-1)及(10-2)中求出的胆汁酸的量为已知的试样进行标准化而得的荧光信号值与在(9)中求出的利用大型机器的相同试样的测定值对应，对于使用了化合物1或水杨酸来作为剥离剂的测定，分别制作了校准曲线。(12)与现有胆汁酸试剂的相关性改善确认使用市售的狗受检体的76种试样，以与(10-1)及(10-2)中所记载的免疫测定相同的方式，使用化合物1或水杨酸来作为解离剂，分别进行了来自蛋白质的胆汁酸的解离。在上述76种试样中，均根据校准曲线求出胆汁酸的量，对通过大型机器的对照法求出的值进行绘制，求出相关系数。将结果示于图1。在图1中，y＝0.97x+0.03及y＝0.98x+0.09分别表示相关式，R表示相关系数。根据图1中所示的结果可知，与水杨酸相比，使用作为本发明的剥离剂的化合物1，由此相关性得到改善，并确认到本发明的效果。实施例2：在实施例1的(12)中，在5℃的环境下，对于76种试样，使用解离剂1，获得了测定结果。该结果与对在25℃的环境下获取的通过大型机器的对照法求出的值进行绘制而得的结果、在25℃的环境下进行的测定结果同样地可获得高精度的相关系数，确认到能够实现不受环境影响的测定。实施例3：在实施例1的(12)中，即使使用干燥状态的化合物2(水分含量为15质量％以下)来作为解离剂，也可获得与化合物1的情况相同的相关系数R＝0.94，确认到本发明的效果。比较例1：在使用将作为解离剂的化合物1的抗衡阳离子变更为Mg2+的解离剂的情况下，在狗血清中的溶解性低，相对于大型机器的测定结果偏差非常大，从而无法进行测定。符号说明1-传感器芯片，2-上部部件，3-中间部件，4-基板，5-第一容器，6-第二容器，7-容器组，8-检测区域，9-参考区域，10-流路。当前第1页1 2 3