用于测量溶液中的物质的吸光率的设备和方法与流程

本发明涉及一种用于测量溶液中的物质（典型地在400nm或更小的波长下展示uv光吸收的物质）的吸光率的设备和方法。

背景技术

许多物质由于它们的化学成分而吸收紫外光或可见光。光由物质的吸收多年来用作检测此类物质的存在和测量此类物质的浓度的基础。物质的浓度可利用比尔朗伯定律（beerlambertlaw）确定：

a=ebc

其中：

a是吸光率；

e是带有lmol^-1cm^-1的单位的摩尔吸光率；

b是以cm限定的样本的光路长度；以及

c是以mol^-1表示的溶液中的化合物的浓度。

可认为uv区域由波长在1nm到400nm的区域中的光组成，180nm到300nm的波长的光称为“深uv”。

用于检测在深紫外（uv）区域中吸收的物质的大部分分析仪器使用汞灯、氘灯或氙气闪光灯作为光源。这种仪器的一个示例是流通池（flowcell），其中包含一种或多种uv吸收物质的溶液在uv光源（例如，汞灯）和uv检测器（例如，光电倍增管或光电二极管）之间通过，且在到达检测器的uv光的强度方面的变化与溶液中的uv吸收物质的浓度相关。

在包括环境科学、生物科学和化学科学的许多行业中，蛋白质、核酸和缩氨酸的检测是极为重要的。蛋白质在深uv区域中主要具有两个吸收峰，在大约190nm处（肽键在该处吸收）具有最大值的一个很强的吸收带，和由于通过芳香族氨基酸（例如，酪氨酸、色氨酸和苯基丙氨酸）的光吸收在大约280nm处的另一个较弱的峰。

核酸吸收在大约260nm处的uv光，核酸的亚单位（嘌呤）中的一些在稍微低于260nm处具有吸光率最大值，而其他（嘧啶）在稍微高于260nm处具有最大值。由于光吸收芳香族氨基酸的含量，几乎所有蛋白质在大约280nm处具有最大吸光率。用来检测和测量蛋白质浓度的分析系统的检测器中的光源在历史上是汞-线灯。汞产生带有254nm而不在280nm处的波长的光，因此需要荧光转换器将由汞灯产生的254nm光变换至更长的波长，且带通滤波器用来切掉在280nm周围的区域。汞灯具有相对短的寿命且可证明是关于时间不稳定的；此外，这些灯的处理可导致环境问题。用来生成紫外光的其他灯（诸如，氘灯和氙气闪光灯）不利地需要高电压，需要复杂的电子器件且常常证明是关于时间不稳定的。所有的当前使用的紫外光源相对大且因此不适于分析仪器的小型化。此外，由于它们的操作所需要的高电压，所有的灯生成大量的热量。

最近开发了带有在250nm到365nm的范围中的发射的algan/gan类型的发光二极管（led）。sensorelectronictechnology,inc.（美国南卡罗莱纳州哥伦比亚市）开拓了这些uv发光5二极管的开发和使用，特别是用于对诸如生物污染水的流体进行辐照和灭菌（例如，us2005/0093485）。其他群体还采用uv发光二极管用于水净化系统（例如，phillipselectronics，wo2005/031881）。

在谱的可见区域中发射的发光二极管（led）已用于间接的光度检测（johnsc.等（2004）electrophoresis,25,3145-3152）和毛细管电泳中的物质的荧光检测（tsaic.等（2003）electrophoresis,24,3083-3088）。king等（analyst（2002）127,1564-1567）也报告了在379.515nm处发射用于无机阴离子的间接光度检测的uv发光二极管的使用。深uv发光二极管作为用于核酸的检测系统中的光源的使用在us2005/0133724中公开。然而，虽然公开了采用led的检测系统，但不存在实验数据以指示所提出的系统真正成功地用来测量聚合酶链反应化验中的核酸水平。因为不使用带通滤波器或分束器和参考检测器，描述的系统会缺少灵敏度、线性度和动态范围；led对温度中的微小变化很敏感，百分之一摄氏度的量级的变化导致基线中的漂移。此外，该系统缺少用于窄化带宽且阻挡谱的可见区域中的光的带通滤波器。相比于样本的自然带宽，窄的带宽（优选1比10的比率）提供响应的良好线性度和宽的动态范围。（practicalabsorbancespectrometry。ed.aknowles和c.burgess,chapmanandhall,纽约）。

jp2002005826公开一种用于测量臭氧浓度的系统。然而，没有提供显示线性度和动态范围的实验数据。该系统使用由金刚石半导体薄膜组成的固态发射器发射带有波长240至270nm的发射峰的紫外光。uv峰的半宽度处的发射谱稍微窄于臭氧的吸收谱的峰（发射最大值大约254nm）的半宽度。然而，尽管这可足够于测量臭氧浓度，但可减小带宽至例如臭氧吸收峰的半宽度的十分之一的带通滤波器的缺少将显著减小检测器的线性度和动态范围（practicalabsorbancespectrometry。ed.aknowles和c.burgess,chapmanandhall,纽约）。此系统还缺少参考光电检测器，因此没有进行发射光的强度的测量。这意味着由于温度中的变化的发射强度的改变的补偿是不可能的。

wo2007/062800（通过引用并入本文中）描述了使用uvled作为用于液体样本中的物质的浓度的分析的光源，但已发现：较宽的光谱是合乎需要的，以便使样本经受不同的波长且从而通过其在不同波长处的吸收特性较准确地或较快地限定物质。然而，已知的led仅具有有限的光波长输出范围。

wo2013/178770公开了一种用于测量溶液中的物质的吸光率的系统和方法，使用带有在uv谱内的波长的多个led以克服上文描述的问题。然而有利的是进一步开发技术（特别是关于成本效率）和创造更紧凑的设备。本发明解决这些问题以进一步改善领域内已知的方法和设备。

技术实现要素：

将理解的是，如本文使用的那样，用语“物质”是指任何化学个体。特别地，它包括有机化合物和无机化合物。有机化合物的示例包括但不限于蛋白质、缩氨酸、碳水化合物、脂类、核酸、蛋白质核酸、候选药物和外源物。无机物化合物的示例包括金属盐（例如，硫酸铁、30氯化铜、硝酸镍）。

本发明的目标在于消除或至少最大限度地减少上文描述的问题。这通过根据所附独立权利要求的设备和方法实现。

由于本发明，光从led中的每一个到光通道的传送相比于先前已知的可在更少的构件的情况下做得更紧凑，导致更有效且节省成本的设备。通过布置相关联的光纤束（该束包括多条光纤），来自每个led的光输出可由该束接收，该束提供从那个相应的led到流通池或多个流通池中的光通道中的每一个的光导而不需要先前需要的额外光纤束和额外构件（诸如分束器）。

根据本发明的方面，提供控制器以控制来自光源布置的光输出。控制器可选择led中的一个来给出光输出，使得来自led中的仅一个的光到达光通道，但控制器还可备选地将led控制成各自以不同频率发射光输出，使得来自每个led的光到达每个光通道，但一般不是同时地。

光通道可布置在相同的流通池中但具有不同的路径长度，使得不同吸光率的物质可关于本发明使用。备选地，光通道可布置在各自连接至设备的光纤的不同流通池中。

来自led的光输出可被过滤以容许仅一种波长或很窄的波长带的光到达光通道。滤波器可布置在led和光纤之间，但还可备选地布置在光纤和光通道之间或在光通道和检测器之间。在后者的情况下，对于每个光通道和每个led将需要一条光纤，例如布置在滤波器轮或类似结构上以容许特定滤波器在对应的led起作用时的移除和插入。另一种可能性是提供容许波长对应于led中多于一者的光的滤波器，使得在每个光通道之前或之后仅需要一个滤波器。

在本发明的一个实施例中，led和可选地还有关于led布置的光纤可为可替换的，使得用户可选择关于本发明使用哪些波长的光。

本发明的另外的优点和益处将由于下文的详细描述变得显而易见。

附图说明

现在将参照附图更详细地描述本发明，其中：

图1公开了本发明的优选实施例的示意图；以及

图2公开了本发明的另一个实施例的示意图。

具体实施方式

图1是根据本发明的设备的一个实施例的图示。设备10包括：发光二极管21,22,23的led光源布置20，其各自发射在谱的紫外部分中的光（uvled）；以及两个流通池31,32，各自具有入口313,323和出口314,324，包含物质的溶液可在流f中通过入口313,323和出口314,324。应注意的是，在一些应用中，光可具有在uv谱之外的波长（诸如，例如可见光），且本文参照在uv谱内的光所指的方面也适用于使用其他led的此类应用。

流通池31,32还包括带有光入口311,321和光出口312,322的光通道315,325，来自led光源布置20的光可通过光入口311,321和光出口312,322且由光电检测器41,42接收，光电检测器41,42可为uv敏感的光电倍增管或uv敏感的光电二极管。该设备还包括带通滤波器50，带通滤波器50在保持对于受关注的uv波长的低吸收系数的同时排斥不想要的波长且容许其他。滤波器的带宽最大是全宽度的一半，且优选地小于10nm，以给出良好的线性度和大的动态范围。

此优选实施例包括在led光源布置20中的三个led21,22,23，各自布置成发射谱内特定波长（不同于其他led的波长）的光，且各自布置有对应的光学滤波器51,52,53，光学滤波器构造成在防止其他光穿透滤波器的同时容许那种特定波长通过。与光源布置20的每个led21,22,23相邻的是光纤束60，光纤束60具有并排布置以接收通过滤波器51,52,53的光的多条光纤且提供从相应的led到光通道315,325中的每一个的引导光。光纤束60布置成使得来自每个led21,22,23的一条光纤连接至每个光通道315,325，使得在此实施例中三个led21,22,23中的每一个发射光到两条光纤60。在其他实施例中，led的数量可在光通道的数量可改变时改变，且应理解的是，本文参照此优选实施例描述的方面可容易适合于适应构造方面的此类差异。备选地，光学滤波器50可放置在光入口311,321处。

led光源布置20处的滤波器51,52,53可布置在轮或类似结构上，以便如需要的那样容许滤波器的变化。备选地，可使用容许多个波长带通过的滤波器，使得单个滤波器可容许来自所有led21,22,23的光通过。

流通池31,32具有形成光入口311,321的窗口，光入口311,321由uv可透过的材料（诸如，蓝宝石、石英或合成石英玻璃）制成且具有已知的路径长度。可使用其他材料，诸如聚合物。溶液在箭头f的方向上经由入口313,323和出口314,324通过流通池31和32，且可包含在<=300nm处具有光吸收的物质（例如，蛋白质或核酸）。来自led布置20的uv光用来辐照流通池31,32中的溶液s，光如由虚线指示的那样通过uv可透过的窗口311,321进入流通池31,32。通过溶液且离开窗口312,322的光然后由光电检测器41,42检测。如在本领域内众所周知的那样，检测且量化从光通道通过流通池31,32传播的光以确定流通池中的溶液中的物质的吸光率。

类似于由图2公开且在下文描述的实施例，光入口311,321和/或光出口314,324可包括光纤、玻璃棒或类似物以容许光进入和离开流通池31,32，且确定光通道的路径长度。

控制器70连接至led光源布置20，以通过选择led21,22,23中的哪一个将发射光来辐照流通池31,32中的溶液以控制设备的操作。该选择可通过接通led中的仅一者21或通过阻挡其他22,23以防止它们的光到达流通池31,32来进行。备选地，可容许led21,22,23同时但以不同频率发射光。控制器70也连接至检测器41,42，且能够接收对应于未由溶液吸收的通过光通道315,325的光的量的信号。这些信号可由控制器70分析和存储，或可传送至单独的单元（未示出）用于进一步的分析、存储和显示。控制器还可构造成控制流通池31,32中的溶液的流，或备选地那种控制可由单独的单元执行。

一旦测量溶液的吸收，那么溶液中的物质的浓度可利用比尔朗伯定律确定，其中物质的摩尔吸光率e已经是已知的。这可手动地或使用计算机或提供的控制器70来进行。备选地，物质的浓度可利用先前在给定波长（例如280nm）处对于受关注的物质产生的剂量响应曲线确定，或可使用在不同波长处生成的多个响应曲线。使用计算机经由至控制器70的数据链路进行这样的确定。在一些应用中，受关注的是吸光率的变化（例如在色谱柱中的蛋白质的分离期间），且因此不需要确定物质的浓度。在那种情况下，摩尔吸光率（e）不需要是已知的。使用两种频率的光也容许在吸光率到达阈值时较精密地监测吸光率中的这种变化，在该阈值处，切换至第二较少吸收的光可给出吸收的变化率的较好分辨率，以及因此浓度值的最大值或最小值的接近。

在此实施例中，通过流通池31,32的流f可为并行的或串联的，但在任一种情况下，流可使用不同的uv频率连续或同时监测以在溶液中的物质的浓度改变时提供较大范围的吸光率值。在变型中，两个流通池可具有不同的光路尺寸，从而进一步增加设备的范围。例如，在物质在第一频率下具有低吸光率的情况下，则可使用长的光路，且在相同物质在第二频率下具有高吸光率的情况下，则可使用短的路径长度。

图2公开了使用带有不同路径长度的两个光通道305,305'的双流通池30的备选实施例。led光源布置20仅具有两个led21,22，各自发射光，该光通过光学滤波器51,52且通过光纤60传送以便到达流通池30。为了提供不同的路径长度，提供玻璃棒80且将玻璃棒80插入到流通池30中以产生第一光通道和第二光通道305,305'，其中第一光通道305具有相比于第二路径长度305'显著更小的路径长度。在其他方面，图2的实施例对应于上文公开的优选实施例，且应注意的是，这两个实施例的特征可自由组合。

根据本发明的设备相比于先前已知的装置可做得更节省成本，相比于其他已知的装置使用更少的构件且需要更少的空间。

光源布置20的led和它们对应的光学滤波器50可为可替换的以容许带有不同波长的光输出的led的替换。这具有增加可由设备测量其吸光率的物质的数量的优点。

在操作中，各个实施例依赖于控制器70以控制辐照样本时的时刻。由于及时变更点（在该点处相应的uvled给样本池提供光）是简单任务，且采用的设备是稳定和低成本的，因而示出的实施例提供用于确定液体中的物质（通过测量其吸光率）的浓度的适应性强、可靠且低成本的液体装置。优选的是，发射达到400nm的光的uvled用于蛋白质、缩氨酸、核酸、细胞提取物、细胞溶解产物、细胞培养物或其组合的溶液中的浓度的测量，但本发明具有对于其他光波长的应用，特别是达到700nm的波长。已示出两个或三个led，但可采用多于三个，例如可使用四个或五个或六个或更多个led，且额外的led可发射可见光。在实施例中，已示出带通滤波器位于样本池30,31,32和它们相应的led光源之间，然而，如果滤波器放置在样本池之后但在检测器41,42之前，示出的设备将以相同的有效性起作用。在那种情况下，滤波器将需要改变，使得正确的滤波器与正确的led一起使用。

示意性地表示示出的led，且它们的形式可不同于示出的那样。可采用从相邻的半导体区域生成不同频率的光的所谓的多光源led，在这种情况下，示出的装置的规模会较小，但那里操作原理会是相同的。

用于所有实施例的一种操作模式是，在第一波长处搜寻那种物质（该物质甚至在低浓度下容易吸收在第一频率下的光）的低浓度，且然后在浓度增大时切换到不那么容易吸收的第二波长，从而提供较大的操作范围和灵敏度。在另一操作模式中，可按预定周期给led供能，且按匹配周期记录检测器的输出使得来自每个led的光强度根据周期记录。因此，可确定由每个led产生的输出，因为它由对应于周期的存储器中的不同组的值区别。周期性变化以在不同的led之间区分可在时域或频域中执行。可使该周期在时间上很短，例如一秒钟的若干分之几（几赫兹），使得其对眼睛看起来是led同时照明。检测器的辅助电子电路可布置成抑制或移除假信号（例如通过仅在切换周期内的预定时段期间检测输出），从而移除对于相应的led来自可在初始照明期间或在照明的结尾发生的信号的噪音。

根据本发明的设备和方法还可包括参考检测器，其布置成接收来自led的光的一部分，以提供用于与来自检测器的信号比较的参考信号。光可借助于光纤引导至参考检测器，或可以以其他合适的方式引导，且额外的构件（诸如分束器）可用来将光分成多部分。特别地，在多个光导用来将光传播至流通池的情况下（例如，用于来自不同源的不同波长的光的不同光导），则设想单个参考检测器或检测器阵列可用来从源中的每一者接收光，光导在检测器处或在检测器阵列处会合。实际上，可能的是将多条光纤中的一条从每个光源通到每个使用的流通池，且将光纤中的另一条通到参考检测器或通到其中使用多条光纤的检测器阵列，以在其使用期间对每个光源提供参考值。重要的是通过比较参考检测器强度和流通池检测器强度所测量的光强度中的差异，而不是强度的任何绝对值，故在参考路径中使用的光纤的长度不太重要，然而为了良好的实施，用于在流通池光路和参考检测器光路中使用的光导的大约相等的光纤长度是优选的。

上文的示例示出本发明的特定方面，且不意图在任何方面限制其范围且不应当如此理解。受益于如上文阐述的本发明的教导的本领域中的技术人员可另外实现许多修改。这些修改应理解为包含在如所附权利要求中阐述的本发明的范围内。为了确定此公开的范围，意图的是一个实施例的任何特征可与一个或多个其他实施例的另外的一个特征或多个特征组合。