糖胺聚糖、肝素及其衍生物的核磁共振分析方法与流程

本发明描述了一种用于表征糖胺聚糖，特别是肝素和低分子量肝素及其衍生物的核磁共振(¹h-nmr和1h-¹³chsqc)分析方法，该方法能够对这些物质进行定量分析。

发明背景

核磁共振(nmr)谱一般用于表征糖胺聚糖，特别是肝素和低分子量肝素及其衍生物，是最常用且最重要的分析技术之一。

该技术能够进行一维试验和二维试验，对测定分子结构的微小变化非常敏感，非常合适于表征这些化合物。

糖胺聚糖(gag)是带负电的线性多糖，平均分子量10-100kda(thestructureofglycosaminoglycansandtheirinteractionswithproteins.，gandhinsandmancerarl.chembioldrugdes2008；72:455-482)。糖胺聚糖有两大类：非硫酸化糖胺聚糖(如透明质酸)和硫酸化糖胺聚糖(如硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、肝素和硫酸乙酰肝素)。糖胺聚糖链由二糖单元或由糖醛酸(d-葡糖醛酸或l-艾杜糖醛酸)和氨基糖(d-半乳糖胺或d-葡糖胺)组成的二糖形成。

结构式1：不同类型糖胺聚糖的二糖单元通式

肝素是糖胺聚糖家族中的一种多糖，由糖醛酸(l-艾杜糖醛酸或d-葡糖醛酸)和d-葡糖胺交替连接而成。链中的l-艾杜糖醛酸可为2-o-硫酸酯和d-葡糖胺、n-硫酸酯和(或)6-o-硫酸酯，少数情况下为n-乙酰-l-艾杜糖醛酸或3-o-硫酸酯(mappingandquantificationofthemajoroligosaccharidescomponentofheparin.linhardtrj,ricekg,kimysetal.biochemj1988；254:781-787)。主要的二糖重复单元为三硫酸化二糖，2-o-磺基-l-艾杜糖醛酸(1→4)2-n-磺基-6-o-磺基-d-葡糖胺。

肝素寡糖链中的这种结构变异性源自这些化合物的生物合成和调节机制。在生物合成的第一阶段，由葡萄糖-半乳糖-半乳糖-木糖构成的四糖片段与蛋白质核心结合，开始糖蛋白链的生物合成。然后，葡糖醛酸(glca)残基和n-乙酰葡糖胺(glcnac)残基交替整合，形成约300单位的多糖链。与此同时，糖链延长，在各种酶的作用下，进行修饰。在n-脱乙酰基酶(n-磺基转移酶)的作用下，glcnac单元发生n-脱乙酰化和n-硫酸化，转化为n-磺基葡糖胺(glcns)。c5差向异构酶催化某些glca单元转化为艾杜糖醛酸(idoa)，然后在2-o-磺基转移酶的作用下进行2-o-硫酸化。接着，6-o-磺基转移酶将6-o-磺基转移至glcns单元和glcnac单元。最后，3-o-磺基转移酶作用于某些n-磺基-6-o-磺基葡糖胺(glcns6s)单元，形成n-磺基-3,6-o-二磺基葡糖胺(glcns3s6s)残基。

初始n-脱乙酰化的明显随机性和不完整性是在其生物合成的第一阶段导致肝素结构异质性的主要原因。硫酸化程度和位置的结构变异性是由生物合成酶修饰的不完全性造成的，这产生二糖取代模式不同的肝素钠分子。

尽管肝素优选用作钠盐，但也可用作其他碱金属或碱土金属盐，主要用作抗血栓和抗凝药。(anticoagulanttherapyformajorarterialandvenousthromboembolism.tranham,ginsbergjs.basicprinciplesandclinicalpractice.colmanrw,mardervj,clowesaw,georgejn,goldhabersz(ed).lippincottwilliamsandwilkins；2006:1673-1688)。

肝素可根据其分子量进行分类：未分级肝素(ufh)、平均分子量低于8000da的低分子量肝素(lmwh)和平均分子量低于3000da的超低分子量肝素(ulmwh)(chemoenzymaticsynthesisofhomogenousultralowmolecularweightheparins，xuy.etal.science2011；334:498-501)。lmwh和ulmwh源自ufh原始分子解聚，其制造过程可在分子结构中引入某些特征。所得分子的结构即衍生自起始材料肝素结构，也衍生自特征性残基和制造方法的特征。

在依诺肝素钠(在水性介质中用碱处理肝素苄酯进行消除反应)和贝米肝素钠(在非水介质中用碱处理进行消除反应)的制备过程中，分子的两个非还原端形成多数分子4,5-不饱和2-o磺基糖醛酸(δu2s)，分子还原端形成2-n-磺基-6-o-磺基葡糖胺。非还原端的结构为4,5-不饱和2-o-糖醛酸(δu)。除另外两种1,6-脱水衍生物2-n-磺基-1,6-脱水葡糖胺(1,6-an.a)和2-n-磺基-1,6-脱水甘露糖胺(1,6-an.m)外，上述残基的还原端还可为2-n-磺基-6-o-磺基甘露糖胺(碱催化c2发生差向异构化)。

结构式2：依诺肝素钠和贝米肝素钠的还原端和非还原端结构。

其他低分子量肝素也产生与制造过程相关的残留物。例如，用肝素酶处理进行β-消除制得的亭扎肝素钠，其非还原端可为4,5-不饱和2-o磺酸糖醛酸(δu2s)。

结构式3：亭扎肝素钠的还原端和非还原端结构。

用亚硝酸处理制得达肝素钠，可在分子的还原端形成2,5-脱水甘露糖醇残基。

结构式4：达肝素钠的还原端和非还原端结构。

本说明书中“肝素链中存在的单糖残基”是指常见于lmwh、ufh和gag链中的单糖残基或组分。这些残基包括4,5-不饱和2-o磺酸糖醛酸(δu2s)、4,5-不饱和糖醛酸(δu)、2-n-磺基-1,6-无水葡糖胺(1,6-an.a)、2-n-磺基-1,6-脱水甘露糖胺(1,6-an.m)、2-n-磺基-6-o-磺基葡糖胺(ans6s)、2,5-脱水甘露醇、n-磺基葡糖胺、葡萄糖醛酸、n-磺基-6-o-磺基葡糖胺、2-o-磺基脲酸、艾杜糖醛酸、n-磺基-3-o-磺基葡糖胺、n-磺基-3,6-o-二磺基葡糖胺、半乳糖醛酸、木糖、n-乙酰葡糖胺和n-乙酰基-6-o-磺基葡糖胺。

nmr法可以鉴定肝素和低分子量肝素制造过程中产生的典型残留物。

使用nmr进行结构表征的优点之一是，样品在分析前无需进行衍生化或色谱分离。换言之，无需中间处理步骤可直接对样品进行nmr分析。

核磁共振谱测定这些化合物中单糖残基的序列，并明确测定整个寡糖链中的n-乙酰化和n-和o-硫酸化位点。该技术能特异性地测定端基键的取向，区分葡糖醛酸的差向异构体艾杜糖醛酸。(advancinganalyticalmethodsforcharacterizationofanioniccarbohydratebiopolymers.langeslayd.j.phdthesisucriverside2013)。鉴于这些化合物的高度微观异质性和多分散性，完整表征肝素和低分子量肝素目前仍然存在困难。

该技术可用于获得与肝素和低分子量肝素的生产过程相关的结构性残基的信息，例如糖醛酸差向异构化的状态(艾杜糖醛酸与葡萄糖醛酸)、非还原端硫酸化和非硫酸化的4,5-糖醛酸残基比例(β-消除法或用肝素酶处理制得的低分子量肝素)。

与此类似，该技术的灵敏度高，已用于测定糖胺聚糖中杂质的筛选技术(analysisandcharacterizationofheparinimpurities.benis.etal.analbioanalchem2011,399:527-539)。

现有技术已经公开了用于糖胺聚糖，特别是肝素和低分子量肝素结构表征的各种nmr方法和试验。例如，¹³c-nmr光谱法测定不同动物来源的肝素钠的硫酸化程度(characterizationofsulfationpatternsofbeefandpigmucosalheparinsbynuclearmagneticresonance.casub.etal.arzneim.-forsch./drugres.1996.46:472-477)。

氢核的丰度高，旋磁比高，故¹h-nmr谱已广泛用于这些化合物的研究。1.8ppm-2.1ppm之间的区域包含在合成中引入的还原端n-乙酰基或甲基产生的信号。2.8ppm-4.6ppm之间的区域包含大部分糖环信号，这些信号高度重叠，难以直接从该区域提取结构信息。端基质子的信号位于4.6ppm-6.0ppm之间。这一区域的信号不密集，可以从中提取大量信息。对于经β消除反应制得的lmwh，该区域包含分子的非还原端的h4信号。

二维试验(2dnmr)的谱图有两个频率维度和另一个信号强度，这使其成为功能强大的工具，能够归属肝素衍生的寡糖结构，克服一维试验的信号重叠问题(characterizationofcurrentlymarketedheparinproducts:compositionanalysisby2d-nmr.keired.a.etal.anal.方法2013.5:2984-2994)。

tocsy(全相关谱)谱是低聚糖结构分析的一个绝佳起点，这种谱的信息能在同一自旋系统中发现核的关联性，本例是同一单糖内的所有质子。

另一种对此类化合物的结构表征特别重要的二维试验是¹h-¹³chsqc(异核单量子关联)，这种方法将质子的化学位移与碳13的化学位移相关联，能够归属gag衍生的低聚糖和单糖组合物的一级结构。(structuralelucidationofthetetrasaccharidepoolinenoxaparinsodium.ozugj.etal.anal.bioanal.chem.2002.403:2733-2744；structuralfeaturesoflowmolecularweightheparinsaffectingtheiraffinitytoantithrombin.bisioa.etal.thromb.hemost.2009.102:865-873)。

这种二维技术提高了光谱色散，能够定量相应的一维光谱中叠加在一起的信号积分(low-molecular-weightheparins:structuraldifferentiationbytwo-dimensionalnuclearmagneticresonancespectroscopy.guerrinim.etal.seminthrombhemost2007.33:478-487)。

共振线的强度与共振核的数量(自旋)成正比，故根据定义，核磁共振是一种定量光谱技术。原则上，这就能够精确地测定分子结构。

nmr使用的磁场强度较大，检测极限显著降低。尚无精确方法能够考察和控制试验方法以及光谱处理和评价，各试验室对相同样品进行的测量可能有显著差异(validationofquantitativenmr.malzf.andjanckeh.journalofpharmaceuticalandbiomedicalanalysis2005.38:813-823).

一般而言，糖胺聚糖的核磁共振，特别是肝素和低分子量肝素及其衍生物的光谱复杂，目前尚无特异性的验证方法能定量其特征信号，也不能对这些化合物进行正确表征和区分。

本发明的发明人设法克服现有技术中的这一障碍，开发了一种能够明确区分各种肝素的方法。用本发明所述方法得出的单糖组合物的百分比能够区分不同制造方法制得的低分子量肝素、肝素钠和其他糖胺聚糖。

发明总结

本发明的发明人开发了一种使用一维核磁共振¹h-nmr和(或)二维核磁共振¹h-¹³chsqc量化糖胺聚糖，特别是肝素和低分子量肝素及其衍生物的特征信号的方法。定量这些信号可测定这些化合物中每一种寡糖链的单糖组成，这是该化合物的特征。

本发明提供了一种用¹h-nmr一维核磁共振和(或)¹h-¹³chsqc二维核磁共振分析肝素链中有单糖残基的组合物的方法。二维核磁共振包括以下步骤：

a)肝素链中至少有一个单糖残基的组合物，以二甲基丙二酸(dmma)为内标测得其¹h-nmr一维核磁共振和(或)¹h-¹³chsqc二维核磁共振谱，然后

b)鉴定nmr谱中是否存在下列至少一种残基的一个特征信号：4,5-不饱和2-o-磺酸糖醛酸(δu2s)、4,5-不饱和糖醛酸(δu)、2-n-磺基-1,6-无水葡糖胺(1,6-an.a)、2-n-磺基-1,6-脱水甘露糖胺(1,6-an.m)、2-n-磺基-6-o-磺基葡糖胺(ans6s)、2,5-脱水甘露醇、n-磺基葡糖胺、葡萄糖醛酸、n-磺基-6-o-磺基葡糖胺、2-o-磺基脲酸、艾杜糖醛酸、n-磺基-3-o-磺基葡糖胺、n-磺基-3,6-o-二磺基葡糖胺、半乳糖醛酸、木糖、n-乙酰葡糖胺和n-乙酰基-6-o-磺基葡糖胺。

其特征在于，相对于dmma，标准化积分确定相对比例中的所述信号存在。如果不存在，则形成一种模式。通过该模式可以鉴定单糖残基来源性肝素，以比较在分析中获得的模式与先前在相同条件下获得的不同肝素的标准模式。

对这些产品及其单糖组成或特征残基的特征信号进行正确定量能够正确区分各种多糖及其来源。对于低分子量肝素，可确认产品是否按照所声明的方法进行制造。

残基的定量用相对于每种肝素完整结构的百分比表示。得出每种结构的特征性“照片”，能够明确推断和鉴定所分析的肝素和其制备过程。本发明的方法既可用作质量系统或方法(评估所分析的肝素是否符合一种确定的标准或是否掺假)以及分析和确定肝素新结构的特征信号的方法。本发明的方法可用作质量系统或方法。

必须证明生物仿制药(仿制药)和参比分子之间具有适当可比性之后，也就是证明除其他方面外，两种产品的结构具有适度相似性之后，卫生部门才能批准生物仿制药和(或)某些低分子量肝素的仿制药如依诺肝素钠。在结构方面必须证明的基本内容之一是形成寡糖链的单糖的相对比例，以及经统计评估后符合生物相似性标准。本发明的方法对此特别具有选择性。

本发明的发明人已经核实，尽管核磁共振已广泛用于表征这些化合物，但尚无用nmr定量分析糖胺聚糖的文献。没有这些方法就不能对在不适当的试验条件下研究和评估的相同样品进行适当比较。

文献报道这些化合物的不同组分残基的相对比例彼此显著不同，这清楚地表明这些方法不充分(genericversionsofenoxaparinavailableforclinicaluseinbrazilaresimilartotheoriginaldrug.glauserb.f.,vairob.c.,oliveirac.p.m.,cinellil.p.,pereiram.s.andmouraop.a.s.jthrombhaemost2011.9；1419-1422)。

本发明的目的是建立一种选择性的定量方法，以测定这些化合物结构中这些残基的信号比例，并对结果进行适当比较，避免与nmr试验条件相关的误差。发明人发现在¹hnmr和hsqc试验中可使用二甲基丙二酸(dmma)作为内标用于不同组分单糖信号的相对定量，因为除其他方面外，二甲基丙二酸的纵向弛豫时间(t1)小于1秒，与端基质子和碳的t1相似(molecularweightofheparinusing13cnuclearmagneticresonancespectroscopy.desaiu.r.andlinhardtr.j.,jpharmsci1995.84(2)；212-215)，这使极化转移良好，信号强度增加，适合于此目的。

使用¹h-nmr和¹h-¹³chsqc对这些化合物进行nmr分析的特征是以二甲基丙二酸作为内标对这些产品的特征信号进行定量。

令人惊讶的是，选择在¹h-nmr和¹h-¹³chsqc中以二甲基丙二酸(dmma)作为内标能够定量测定与肝素典型相关的糖胺聚糖的特征信号的百分比。方法的特异性、准确性、以及nmr谱信号和所分析的糖胺聚糖的特征残基的浓度之间的重复性和线性高，这样就可开发出一种前所未有地对所述糖胺聚糖进行定量分析的方法。

图的简要说明

图1：肝素生物合成历程示意图

图2：特异性¹h-nmr谱

图3：特异性¹h-¹³chsqc谱

图4：¹h-nmr线性

图5：¹h-¹³chsqc线性

图6：依诺肝素钠的¹h-nmr谱

图7：依诺肝素钠的¹h-¹³chsqc谱

缩写词与首字母缩写词

本说明书中使用的缩写词和首字母缩略词如下：

nmr：核磁共振

hsqc：异核单量子关联

gag：糖胺聚糖

ufh：未分级肝素

lmwh：低分子量肝素

ulmwh：超低分子量肝素

da:道尔顿

δu2s：4,5-不饱和2-o-磺基糖醛酸

δu：4,5-不饱和糖醛酸

1,6-an.a：2-n-磺基-1,6-无水葡糖胺

1,6-an.m：2-n-磺基-1,6-脱水甘露糖胺

tocsy：全面相关谱

tsp：3-(三甲基甲硅烷基)-丙酸-d4酸钠

dmma：二甲基丙二酸

mhz：兆赫

ppm：百万分之一

δ：化学位移

sw：谱宽

td：时域

t1：纵向松弛时间

ans：n-硫酸葡糖胺

g：葡萄糖醛酸

ans6s：n-磺基-6-o-硫酸葡糖胺

i2s：2-o-磺基脲酸

i：艾杜糖醛酸

ans3s：n-磺基-3-o-硫酸葡糖胺

gal：半乳糖醛酸

xyl：木糖

anac：n-乙酰葡糖胺

a6s：6-o-硫酸葡糖胺

a6oh：葡糖胺

g2s：2-o-磺基葡萄糖醛酸

m：甘露糖胺

mns6s：n-磺基-6-o-磺基甘露糖胺

epox：环氧

αred：α-端基差向异构体

βred：β-端基差向异构体

发明的详细说明

试验分析

使用brukeraviii-600oaviii-800核磁共振(nmr)仪进行nmr定量测定。所用试剂为氧化氘(d2o)99.9％、3-(三甲基甲硅烷基)-丙酸-d4酸(tsp)和二甲基丙二酸钠(dmma，nmr定量标准，tracecert级)为内标。

a)仪器条件

-频率：1h：600/800mhz,13c:150,9/201.2mhz

-温度：298k

b)采集参数(定量¹hnmr)

-90°脉冲：用定性1h谱测定

-采集窗口：sw＝10-12ppm/td＝64-128k

-扫描间延迟d1必须满足d1+aq≥20s

-扫描次数：12

c)采集参数(hsqc)

-90°脉冲：用定性¹h谱测定

-采集窗口：sw2(¹h)＝6ppm/td(f2)＝1k

sw1(¹³c)＝120ppm/td(f1)＝256-384

-脉冲间时间d1＝1.8-2s

-扫描次数：12

d)处理参数(¹h)

-处理窗口：si＝64-256k

-窗口功能：无

-相位调整：手动

-基线调整：自动(绝对)

e)处理参数(hsqc)

-处理窗口：si(f2)＝2k

-处理功能：qsine,ssb＝2

-相位调整：手动

-基线调整：自动

f)样品制备，配制以下溶液：

-溶液a[tsp]1mg/ml

-溶液b[d2o-tsp]0.002mg/ml:40μla[tsp]+19.96mld2o,总体积＝20ml

-溶液c[dmma]1.2mg/ml

-试验样品：在溶液b[d2o-tsp]500μl中加待研究产品50mg，加入二甲基丙二酸溶液c[dmma]100μl，然后置于直径5mm的nmr管中。

g)操作

将装有样品的nmr管置于波谱仪中。调整磁场的均匀性，然后优化¹h和¹³c核的谐波。测定定量¹h谱，参数与前述类似，但以下参数除外：

脉冲之间的时间d1＝1-2s

扫描次数：1-4

使用自动脉冲程序(topspin)测定90°脉冲值。然后测定定量¹h谱，使用分析方法规定的参数和先前测定的90°脉冲值(p1)。使用上述参数获得hsqc谱。然后根据上述参数处理所得波谱，以tsp-d4在0ppm处的信号作为化学位移参考。

二甲基丙二酸在以下化学位移处出现信号：

-¹hnmr：1.2-1.4ppm处出现单峰

-hsqc:在1.2-1.4ppm和26-27ppm处出现单峰

定量nmr方法验证所评估的参数如下：

特异性

测定该分析方法在样品中可能存在其他化学物质的情况下，明确地同时或单独测量和(或)鉴别目标分析物的能力。

这些试验测定的¹hnmr谱数据如下：

以及¹h¹³c-hsqc谱:

经验证，¹hnmr或¹h¹³c-hsqc谱信号之间无干扰(图2和3)。这表明该方法能够在无干扰的情况下区分待研究化合物的结构信号和样品中的其他产物如溶剂(氧化氘，d2o)、内标(二甲基丙二酸，dmma)和化学位移参考(tsp-d4)的信号。

定量限和线性

在这些参数条件下，测定了可精密而准确地适当定量的分析物最小量、该方法(经过数学变换)得出在确定的区间内与样品中分析物浓度成正比的结果的能力。

为评估定量限和线性，单独称量后在依诺肝素钠中添加7个浓度水平的内标，平行制备三份，对dmma的nmr信号积分(即dmma的nmr信号面积积分)进行定量测定。这些水平对应于以下工作浓度：

-0.2mm：工作浓度的13.5％

-0.3mm：工作浓度的20.3％

-0.76mm：工作浓度的50％

-1.2mm：工作浓度的80.1％

-1.5mm：工作浓度的100％

-1.8mm：工作浓度的120％

-2.27mm：工作浓度的150.2％

为满足该线性标准而建立的合格标准是，对于所得直线，两个试验的相关系数≥0.99。图4和图5中的图形表示¹hnmr和¹h¹³c-hsqc谱的dmma信号积分值与dmma浓度(mm)。两者很容易符合合格标准。

dmma的定量限浓度为0.20mm。所研究的样品信号强度小于该浓度的dmma信号强度，无法正确定量，故不能用于测定分子中残基的相对比例。

准确度

准确度表示通常认为的真实值或参考值与测得的试验值之间的接近程度。为计算样品浓度的试验值以进行评估，考察前述线性部分所得的直线方程。

准确度表示为已知量内标的百分回收率：

其中：

xm：测得的平均值

μ：认可的真实值

确定的合格标准是，以浓度限计算的回收率70.0-130.0％，其他水平的回收率80.0-120.0％。

测得的¹hnmr和hsqc数据如下：

¹hnmr和hsqc这两个试验得出的结论是，适用性符合样品信号准确度参数的验收标准，信号强度大于定量限。

精密度-重现性

在同一试验室中在短时间内以相同操作条件对同一样品进行一系列分析，以研究该方法的变异性。

连续三次对每一浓度进行分析。方法的可重现性表示为一系列测量值的变异系数(cv)，按如下方法计算：

其中：

s：标准差

x：结果的算术平均值。

满足这些准确度标准而建立的合格标准是，所有浓度水平的变异系数≤7％。

两次试验测得的数据如下：

¹hnmr和hsqc这两个试验得出的结论是，适用性符合样品信号准确度参数的验收标准，信号强度大于定量限。

实施例

以下的具体实施例用于说明本发明的性质。本说明书中纳入这些实施例仅用于说明目的，不应解释为对本发明权利要求的限制。

实施例1

依诺肝素钠的¹hnmr研究。

将依诺肝素钠50mg溶解于d2o-tsp溶液(溶液b)500μl中，然后加入dmma溶液(溶液c)100μl。将所得溶液置于直径为5mm的试管中。

所得的待分析溶液中的dmma浓度为1.5mm。

用brukeraviii-800核磁共振波谱仪进行试验。

测得的主要信号如下：

测得dmma和其余残基的信号积分值后，将积分值除以dmma信号的积分值就得出所述残基的标准化值。所有试验的内标浓度相对于残基浓度保持恒定，故可进行标准化，以免在分析一系列数个产品批次时可能出现的试验间变异性。

得出残基的标准化值后，根据以下公式计算其相对百分比：

为阐明操作步骤，显示四份依诺肝素钠样品m1、m2、m3和m4所得的一系列结果：

试验得出了以下每个所选信号的积分值：

其中m表示样品。

将其除以dmma积分得出所研究信号积分的标准化值：

最后，根据这些标准化值，计算每个信号相对于所有信号集合的相对比例：

对依诺肝素钠的区分良好的特征性信号(通常是对应于端基质子的那些信号，h1)进行定量测定，测得的相对比例值如下表所示：

在本说明书中，已测得的一维¹h-nmr和(或)二维¹h-¹³chsqcnmr谱中的峰的信号组，或无信号，参数“相对比例(％)”所表示的标准化积分的相对比例称为“信号模式”或简称为“模式”。

实施例2

使用实施例1所用的相同溶液进行¹h-¹³chsqc研究。测得的主要信号如下：

这些信号可以与分子中的单糖组分相关联，对这些信号进行定量就能够测定单糖组成。

使用与¹hnmr试验相同的操作，用dmma积分集合对每一个信号积分进行标准化。依诺肝素钠的特征信号的定量数据如下表所示：

这些试验表明，使用上述试验条件，能够获得一种分析一般的糖胺聚糖以及肝素和低分子量肝素及其衍生物的核磁共振(¹h-nmr和¹h-¹³chsqc)方法。特别而言，能够对这些物质进行定量分析。

实施例3

贝米肝素钠的¹hnmr研究。

测得的主要信号如下：

对贝米肝素钠良好区分的特征性信号(常对应于端基质子h1的信号)进行定量，所测得的一系列六份样品的相对比例值如下表所示。

实施例4

使用实施例3所用的相同溶液进行¹h-¹³chsqc研究。测得的主要信号如下：

这些信号可与分子中的单糖组份相关联，对这些信号进行定量能测定其单糖组份。

使用与¹hrmn试验相同的操作，用dmma积分确立的数值对每一个信号积分进行标准化。贝米肝素钠的特征信号的定量数据如下表所示：

实施例5

达肝素钠的¹hnmr研究。

测得的主要信号如下：

对达肝素钠良好区分的特征性信号(常对应于端基质子h1的信号)进行定量，所测得的一系列六份样品的相对比例值如下表所示。

实施例6

使用实施例5所用的相同溶液进行¹h-¹³chsqc研究。测得的主要信号如下：

这些信号可与分子中的单糖组份相关联，对这些信号进行定量能测定其单糖组份。

使用与¹hrmn试验相同的操作，用dmma积分确立的数值对每一个信号积分进行标准化。达肝素钠的特征信号的定量数据如下表所示：

实施例7

亭扎肝素钠的¹hnmr研究。

测得的主要信号如下：

对亭扎肝素钠良好区分的特征性信号(常对应于端基质子h1的信号)进行定量，所测得的一系列六份样品的相对比例值如下表所示。

实施例8

使用实施例7所用的相同溶液进行¹h-¹³chsqc研究。测得的主要信号如下：

这些信号可与分子中的单糖组份相关联，对这些信号进行定量能测定其单糖组份。

使用与¹hrmn试验相同的操作，用dmma积分确立的数值对每一个信号积分进行标准化。亭扎肝素钠的特征信号的定量数据如下表所示：

这些试验表明，使用上述试验条件，能够获得一种分析一般的糖胺聚糖以及肝素和低分子量肝素及其衍生物的核磁共振(¹h-nmr和¹h-¹³chsqc)方法。特别而言，能够对这些物质进行定量分析。