用于时间分辨荧光免疫分析检测的系统和方法与流程
本发明在一方面涉及一种适于时间分辨荧光免疫分析检测的系统，该系统包括：容器，该容器具有适于在其中接收样品的样品容积；光源，该光源适于发射脉冲激发光；照射光学器件，该照射光学器件适于收集来自光源的脉冲激发光并将所述脉冲激发光传送到容器中的样品容积；检测装置，该检测装置适于对至少在检测光谱范围内的荧光辐射进行门控检测；检测光学器件，该检测光学器件适于收集来自容器的至少在检测光谱范围内的荧光辐射，并将所述荧光辐射传送到检测装置；以及光学滤光器装置，该光学滤光器装置被配置用于分离激发光和检测光。
根据另一方面，本发明涉及一种用于时间分辨荧光免疫分析检测的方法，该方法包括：用基于镧系元素螯合物的荧光团对样品进行免疫染色；用激发脉冲对样品进行照射；等待激发脉冲终止之后的检测延迟；以及响应于检测期间激发光的脉冲，检测样品发射的荧光辐射。
背景技术：
荧光免疫分析是诊断分析中非常有用且可靠的工具。仅举例来说，检测并可靠地测量心脏标志物(诸如，肌钙蛋白)的浓度对于识别急性心脏病相当有用。因此，期望使得此类测量不仅可在高度专业化的先进实验室环境中采用，并且还可在定点护理处提供此类技术，以获得从采样到提供可用测量结果的短回报时间。此类定点护理设备通常需要易于操作且高度可靠的装置来提供无误的测量结果。此外，无论是在专业化实验室中还是在定点护理处，均期望用于此类测定的装置与标准化或至少常用的用于样品采集、处理和制备的实验室器具兼容。装置本身内部与工业标准的兼容性或至少与用于样品采集、样品处理和样品制备实验室器具的业界标准的兼容性也是非常重要的，以便适合在自动化装置内集成基于荧光免疫分析的测量。如果自动化装置适于测量多个参数，则情况更是如此。
就例如在相关(非常低)浓度下的生物样品中检测某些目标物质的存在所需的灵敏度而言，荧光免疫分析极具挑战性。时间分辨荧光是已经用于免疫分析检测中以抑制短暂的背景荧光并允许高灵敏度的一项强大工具。它依赖于采用具有长荧光寿命的高荧光荧光团以及发射显著短于这些荧光团的荧光寿命的激发脉冲的光源。与稳定测量相比，相对于短激发脉冲延迟了数微秒的时间门控荧光检测表现出改善的信噪比(snr)，因为它降低了在纳秒范围内的典型荧光寿命的背景。荧光寿命长的许多荧光团属于镧系元素。铕是一种镧系元素离子，由于铕具有大斯托克斯位移以及在微秒-(μs)到毫秒-(ms)范围内的长荧光寿命，它已经被用作时间分辨荧光仪器中的标记物。用于时间分辨检测技术的基于镧系元素的荧光团的激发需要脉冲uv光源。例如，铕在uv-a区域中被激发并发射在616nm处具有发射峰的荧光。
然而，如上所述，就检测相关浓度下某些目标物质的存在所需的灵敏度以便提供有用的诊断工具而言，荧光免疫分析极具挑战性。因此，需要在与待检测的光学信号的光谱范围内的噪声和背景辐射水平均相竞争的水平下检测极低光学信号，并且需要有效地激发目标荧光团。因此，氙闪光灯通常用作用于时间分辨荧光免疫分析检测的激发源，因为它们在纳秒范围内的短脉冲中具有强大的发射能力，并且还因为它们具有光谱通用性，这是由相对宽带发射造成的，该相对宽带发射被定制用于特定荧光团，例如，使用光学带通滤光器。然而，使用闪光灯时的主要问题是其数百微秒的长拖尾剩余脉冲余辉，这会促使背景发射并降低snr。已经将氮激光器用作另选的激发光源，但它们体积大、价格昂贵并且需在低重复频率下操作。最近，uvled已经成为用于荧光标记物的时间分辨激发的光源。然而，此类uv-led具有额定功率低等缺点，并且迄今仅成功应用于存在相对较高浓度的荧光团标记物且因此可获得充足信号的应用中，例如，应用于荧光团的荧光寿命的显微成像或直接测量中。
因此，需要与在自动化分析装置中的实施兼容的改进式时间分辨荧光免疫分析检测。
因此，本发明的目的是提供一种可克服上述缺点中的至少一些的用于时间分辨荧光免疫分析检测的改进或至少另选的系统和方法。
技术实现要素：
本发明的第一方面涉及适于时间分辨荧光免疫分析检测的系统，该系统包括：
-容器，该容器具有适于在其中接收样品的样品容积；
-光源，该光源适于发射脉冲激发光；
-照射光学器件，该照射光学器件适于收集来自光源的脉冲激发光并将所述脉冲激发光传送到容器中的样品容积；
-检测装置，该检测装置适于对至少在检测光谱范围内的荧光辐射进行门控检测；
-检测光学器件，该检测光学器件适于收集来自容器的至少在检测光谱范围内的荧光辐射，并将所述荧光辐射传送到检测装置；以及
-光学滤光器装置，该光学滤光器装置被配置用于分离激发光和检测光；其中
-光源为发光二极管，该发光二极管在低于355nm的波长处具有峰值强度发射；
-其中系统还包括控制单元，该控制单元被配置为至少控制检测周期的时序，该检测周期包括由发光二极管发射的激发脉冲、随后用于通过检测装置来检测荧光辐射的检测时间段，其中检测时间段通过检测延迟与激发脉冲分离；以及
-其中激发脉冲的脉冲持续时间为至少50μs。
到目前为止，据本发明人所知，尚未报道过成功将uv-led用作脉冲激发源的时间分辨荧光免疫分析检测的具体实施。这是由于，与例如闪光灯相比，用于uv发射带的发光二极管具有众所周知的低峰功率输出。此类低功率输出需要非常长的脉冲以便获得足够的总脉冲能量，即至少与闪光灯所提供的总脉冲能量相当的总脉冲能量。另一方面，非常长的激发脉冲极大地影响激发效率。本发明令人惊奇的见解是，尽管led发射的峰值功率超低，但总激发脉冲能量与激发效率之间的此类平衡实际上可使用具有低于355nm的峰值强度发射波长的此类led来实现。在另外的步骤中，发明人惊奇地发现，微秒方案中与荧光团的荧光寿命相当的脉冲持续时间可在时间分辨荧光免疫分析检测系统中实现可靠的激发，甚至可实现相比于基于闪光灯的时间分辨荧光免疫分析检测系统得到改善的信噪比。更令人惊奇的是，发明人发现，当使用基于镧系元素的荧光团特别是基于铕(eu-iii)的荧光团时，通过使用在低于355nm的波长处具有峰值强度发射并且具有至少10μs优选至少50μs且优选低于500μs的脉冲持续时间的led，时间分辨荧光免疫分析检测可实现非常好的结果。这一点特别令人惊奇，因为如前所述，众所周知，在该波长范围内的uv-led具有低功率输出。脉冲持续时间的下限由实现足够的总脉冲能量的相关因素决定，而脉冲持续时间的上限则由实现足够的激发效率的相关因素来决定。更优选地，在低于355nm的波长处具有峰值强度发射的uv-led的脉冲持续时间选自介于100μs与400μs之间，从而进一步优化总脉冲能量与激发效率之间的平衡。
最优选地，led激发脉冲中的每一者均具有传送到容器的最小脉冲能量，其中最小脉冲能量为至少2μj、至少5μj或甚至至少10μj。及时传送到样品的此类最小脉冲能量是实现充分激发以便得到荧光免疫分析检测的非常低信号电平的可用信噪比的必要条件。
如上所述，根据一些实施方案的时间分辨荧光免疫分析检测系统包括容器、光源、照射光学器件、检测装置、检测光学器件、光学滤光器装置和控制单元。容器用于在其中接收经免疫染色的样品，其中使用基于镧系元素螯合物作为荧光团来执行免疫染色。优选地，荧光团是基于铕的。在操作中，光源生成脉冲激发光，激发光由照射光学器件收集并传送到已经制备并放置在内部容积或腔体中或容器底部处的样品容积中的已染色样品。响应于激发光脉冲的脉冲激发，免疫染色样品中的荧光标记物分子发射荧光辐射，该荧光辐射在比激发波长(斯托克斯位移)更长的波长处具有特征光谱发射特征，从而允许在光谱上区分激发光和荧光辐射。因此，使用光学滤光器装置诸如二向色性滤光片组使激发光和荧光辐射彼此分离。检测光学器件收集至少在检测光谱范围内的由容器中的样品发射的荧光辐射，并将所述荧光辐射传送到检测装置，该检测装置适于检测至少在检测光谱范围内的荧光辐射。
脉冲激发之后，荧光辐射的发射以特征寿命衰减。大部分背景辐射的特征寿命以比基于镧系元素的螯合物荧光团特别是基于铕的螯合物荧光团的辐射快得多的速率衰减。这允许通过门控检测及时分离背景荧光和源自经免疫染色样品的期望信号荧光辐射。因此，检测的时序由控制单元根据检测周期来控制。控制单元被配置为控制检测周期的时序，该检测周期包括激发阶段、随后通过检测延迟与激发阶段分离的检测时间段。当激发光源(本文是指led)开始发射激发光(即，处于激发脉冲的上升侧)且在由控制单元控制的脉冲持续时间之后终止发射激发光时，激发阶段开始。检测延迟在激发阶段终止时开始，并且在门控检测荧光辐射开始时终止。门控检测荧光辐射开始标志着测量窗口的打开，该测量窗口在通过门控检测的终止所确定的检测时间段已经结束之后关闭。因此，从激发脉冲的脉冲序列中以循环方式获得测量值，并且通常以预先确定的重复频率提供测量值。检测后延迟可指定终止检测时间段(即，关闭测量窗口)与开始新的后续激发脉冲之间的时间跨度。因此，完整检测周期的长度可由后续检测周期中的对应点之间的时间距离来定义。例如，从第一激发脉冲的上升沿到第二后续脉冲的上升沿的时间长度。通常，激发脉冲以周期性方式传送，即以由脉冲持续时间、检测延迟、检测时间段和检测后延迟之和确定的给定频率传送。
有利地，检测周期为约几毫秒，诸如至少1ms、优选至少2ms、或至少3ms、或至少4ms、或至少6ms、或甚至至少8ms。因此，激发脉冲可处于在10hz和1khz之间的范围内、或处于在50hz和500hz之间的范围内、或处于在100hz和400hz之间的范围内的给定频率下被激发。对于给定的检测延迟和检测时间段，较长的检测周期意味着较长的检测后延迟。较长的检测后延迟具有以下优点：在后续激发脉冲被激发之前允许长寿命背景荧光完全衰减，从而进一步改善信噪比。为了实现正确的时序，控制单元根据选择用于检测周期的延迟来相对于激发脉冲触发/同步门控检测。
可以注意到，检测周期的长度的上限以及检测后延迟的长度的上限是为了在给定时间内累积尽可能多的可靠测量值，即，为了在给定时间内执行尽可能多的可行检测周期。例如，此类给定时间可由在系统提供可靠结果之前指定的总测量时间来确定。
尽管涉及荧光免疫分析检测的绝大多数测量均是在由信噪比确定的可检测限度下进行的，但由于高浓度的生物标记物(例如，在来自特定病理状态下的患者的样品中)，可出现非常高信号电平的罕见情况。由于检测装置具有非常高的灵敏度，为了能够收集接近可检测限度的极小荧光辐射信号，此类高浓度标记物可能导致使得检测装置饱和或至少导致检测输出的非线性行为的信号电平。用基于led的激发系统替换基于闪光灯的激发系统的本系统在此具有一个特别的优点，即该系统允许以容易的方式调整激发脉冲能量。因此，在样品中荧光标记物浓度特别高的罕见情况下，可容易地降低led激发脉冲的脉冲能量，以便将检测装置保持在线性状态下。因此，与基于闪光灯的系统相比，使用基于led的激发的系统实现了信号电平的改善动态范围，所述信号电平可由给定系统处理。
有利地，该系统还可包括数据处理器，该数据处理器适于收集并处理从检测单元接收到的表示由检测单元检测的荧光辐射的输出信号。
有利地，根据一些实施方案，该发光二极管具有介于320nm与355nm之间，更有利地介于330nm与350nm之间的峰值发射强度。更有利的是，根据一些实施方案，该发光二极管具有半峰全宽(fwhm)介于10nm与20nm之间的光谱发射。因此，实现了与基于镧系元素的螯合物荧光团特别是与基于铕的螯合物荧光团的良好光谱重叠。
另外根据本系统的一个实施方案，激发脉冲的脉冲持续时间最多至500μs。有利地，根据一些实施方案，激发脉冲的脉冲持续时间最多至400μs。更有利的是，根据一些实施方案，激发脉冲的脉冲持续时间为至少100μs并且最多至300μs。通过如此选择脉冲持续时间，实现了出奇好的信噪比，从而实现上述基于镧系元素螯合物的荧光团的荧光寿命与激发脉冲持续时间之间的平衡，以优化激发效率。如上所述，最优选地，led激发脉冲中的每一者均具有传送到容器的最小脉冲能量，其中最小脉冲能量为至少3μj、至少5μj或甚至至少10μj。及时传送到样品的此类最小脉冲能量是实现充分激发以便得到荧光免疫分析检测的超低信号电平的可用信噪比的必要条件。
另外根据本系统的一个实施方案，检测延迟介于200μs与600μs之间，或者优选地介于300μs与500μs之间。通过如此选择检测延迟，特别是结合上下文中指定的用于检测时间段长度的特定范围，实现了出奇好的snr。从这些范围中选择的检测延迟优化了短寿命背景荧光、根据免疫染色荧光团的寿命考虑衰减而导致的信号电平以及长期背景荧光之间的snr。因此，选择足够长的延迟，使得短寿命背景衰减但不超过荧光团寿命允许的范围以便维持适当的信号电平。
另外根据本系统的一个实施方案，检测时间段介于100μs与500μs之间。如此选择检测时间段的长度允许累积信号，但不会太长以便避免长寿命背景荧光影响snr，因为相比于长寿命背景荧光，基于镧系元素的荧光团出现信号衰减。
另外根据本系统的一个实施方案，容器为孔。该孔类似于微板中已知的孔类型。
有利地，容器是所谓的微板中的孔。更有利的是，微板满足标准ansi/slas1-2004至ansi/slas4-2004，如下所示：ansi/slas1-2004：微板-占有面积尺寸；ansi/slas2-2004：微板-高度尺寸；ansi/slas3-2004：微板-底部外缘尺寸；和/或ansi/slas4-2004：微板-孔位置。更有利的是，微板符合标准ansi/slas6-2012：微板-孔底高度。
如本文所用的术语“微板”是指具有用作小试管的多个“孔”的平板。将微板孔作为用于荧光免疫分析检测的容器的优点是，微板(也称为“微量滴定板”、“微孔平板”或“多孔板”)是分析研究和临床诊断测试中广泛使用的工具，例如用于样品采集、处理和制备。因此，被配置用于使用微板孔作为容器的荧光免疫分析检测系统与用于实验室设备的通用自动化设计兼容，从而有利于在自动化分析装置中的集成/实施。
然而，使荧光免疫分析检测此类适应微板孔对光学构造构成了另外的挑战，例如，由光学通路受孔本身的几何形状限制这一事实带来的挑战，其中所述事实可能由标准或类似的兼容性约束来决定。也可能造成其他的挑战，例如，由进入容器的装置的其他部件的空间要求带来的挑战。
另外根据本系统的一个实施方案，照射光学器件为将发光二极管的图像投射在样品容积中的图像平面上的成像光学器件。因此，照射光学器件被布置成将照射源的图像投射到与样品重叠的图像平面。因此，实现了应对上述对光学构造构成的挑战，并有利于荧光免疫分析检测系统与现有分析装置特别是自动化分析装置的集成和/或兼容。
另外根据本系统的一个实施方案，图像平面与容器/孔中的底平面重合。该构造在干燥的荧光免疫染色样品位于容器/孔底部处的情况下特别有用。干燥的免疫荧光染色样品例如被制备以便避免液体样品中可能发生的荧光团的非荧光衰减途径，从而提高荧光团的量子效率。
有利地，根据本系统的一个实施方案，激发成像光学器件具有大于50mm的像侧焦距以及小于0.4的像侧数值孔径，另选地具有大于60mm的像侧焦距以及小于0.3的像侧数值孔径。从而实现光学设计，允许在激发光学器件和给定样品平面之间的最小距离的机械约束下远程激发样品容积中的样品。
更有利的是，通过在预先确定的像侧数值孔径的机械约束下平衡放大率与收集效率来优化照射光学器件，以便使从发光二极管传送到容器并因此传送到样品的总能量最大化。基于这些考虑以及可将发光二极管描述为平面朗伯发射器的假设，可使用商业射线跟踪软件以便执行优化。
本发明的第二方面涉及用于时间分辨荧光免疫分析检测的方法，该方法包括：
-用基于镧系元素螯合物的荧光团对样品进行免疫染色；
-用激发脉冲对样品进行照射；
-等待激发脉冲终止之后的检测延迟；
-响应于检测期间激发光的脉冲，检测样品发射的荧光辐射；
其中激发脉冲由在低于355nm的波长处具有峰值强度发射的发光二极管提供，其中激发脉冲具有至少50μs的脉冲持续时间。
另外根据本方法的一个实施方案，荧光团为基于铕的螯合物。基于铕的螯合物荧光团的寿命特别适用于具有上文指定的激发脉冲、检测延迟、检测时间段、检测后延迟和/或检测周期特定范围的时间分辨荧光免疫分析检测。此外，基于铕的螯合物荧光团为在uv-a带且特别是在从320nm最多至355nm的uv-a带范围内的激发提供令人满意的荧光响应。
另外根据本方法的一个实施方案，对样品进行照射包括在样品平面中提供干燥状态的经免疫染色样品，并且借助于照射光学器件在样品平面中生成发光二极管的图像。
有利地，根据一些实施方案，激发脉冲具有至少100μs并且/或者最多至400μs或者甚至最多至500μs的持续时间；
有利地，根据一些实施方案，发光二极管在低于350nm优选低于345nm的波长处具有峰值强度发射。
有利地，根据一些实施方案，发光二极管在至少320nm或至少330nm的波长处具有峰值强度发射；
有利地，根据一个实施方案，检测荧光辐射包括：借助于检测光学器件，响应于激发光的脉冲收集样品发射的荧光辐射，以及将收集的荧光辐射传送到检测装置；
如上文相对于用于时间分辨荧光免疫分析检测的系统所讨论的实施方案，通过用于时间分辨荧光免疫分析检测的方法的上述实施方案，实现了相同或类似的优点。
附图说明
结合附图将更详细地描述本发明的优选实施方案，其在下图中示意性地示出：
图1根据本发明一个实施方案的用于时间分辨荧光免疫分析检测的系统；
图2根据图1的实施方案的照射光学器件；
图3至图5(a)在照射光学器件的图像平面中形成的激发光源的图像以及(b)这些图像沿着x方向和y方向的对应横截面归一化强度分布：模拟led(图3)、实验led(图4)和实验氙闪光灯弧(图5)；
图6基于铕的螯合物荧光团(螯合物)、发光二极管(led)和带通滤光闪光灯(dug11)的光谱特征图；
图7作为led电流的函数的图6的led发射的脉冲能量的图；
图8作为时间的函数的从顶部到底部信号的复合图，这些信号表示：来自现场可编程门阵列(fpga)的触发脉冲、来自由fpga控制的脉冲发生器(pg)的触发脉冲、led电路中产生的电流(i)以及led输出功率(o)；
图9氙闪光灯的时间相关功率输出的图；
图10具有两个不同激发脉冲的受激发荧光团分子数的计算曲线的检测周期图；
图11在两个不同激发脉冲的激发脉冲终止之后立即计算的受激发荧光团分子数的图；
图12对不同来源的背景计数的重复测量的图；
图13对三种不同激发模式的背景计数的四种不同来源进行分开描述的图；
图14对包含源自具有已知目标浓度的溶液的样品的15次重复和空白容器的15次重复的荧光响应的图；
图15作为激发脉冲能量(led电流)的函数的信噪比的图；并且
图16作为led电流的函数的来自空白容器和空容器的背景计数的图。
具体实施方式
在下文中，详细讨论了使用在340nm处具有峰值发射的发光二极管进行时间分辨荧光免疫分析检测的系统100的一个实施方案。系统100适合与自动化仪器中的标准化微板容器110一起使用，其中自动化仪器具有针对光学器件和容器110之间的最小距离的机械约束。在下文中，术语“容器”110和“测试杯”或“杯”可互换使用。此外，比较研究的数据被呈现为将基于用根据本发明的一个实施方案的340nm发光二极管激发的系统与使用氙闪光灯的系统进行比较。氙闪光灯是现有技术中常用的类型。激发光学系统被设计成收集由具有方形1×1mm2发射表面的led芯片发射的光中最多至80％的光，其中所述发射表面具有朗伯发射特征。在容器(杯)中形成的led图像的尺寸为5×5mm2，其比用于比较的氙闪光灯的图像大三倍。led在电流370ma、脉冲宽度200μs的条件下操作，并且在这些工作参数下，led传送与氙闪光灯相同的能量。下文研究和讨论了基于铕的螯合物的led激发的时间、光谱和空间特性。
参考图1和图2，现在描述用于时间分辨荧光免疫分析检测的系统100的光学系统。光学系统为反射型荧光系统，并且包括具有由照射光学器件130提供的激发光路和由检测光学器件150提供的检测光路的两个子系统，其中二向色性分束器160分离激发光路和检测光路。
在第一子系统中，照射光学器件130从发光二极管120(led)收集光，其被具有8mm的焦距和0.63的数值孔径(na)的非球面透镜131视为具有1×1mm2面积的朗伯发射器。焦距为60mm的下两个平凸透镜132、133和焦距为67mm的双凸透镜134在相距65mm处形成图像。照射光学器件130的所有透镜131、132、133、134由uv级熔融二氧化硅制成，以确保uv-a区域中的高透射率并使透镜材料的自发荧光最小化。照射光学器件子系统130的放大率为5，并且受物和像侧数值孔径的限制。图像形成在测试杯110的底部，该测试杯由聚苯乙烯制成并且吸收uv。杯底的直径为6.7mm，杯110的周壁高度为10.6mm，因此将中心点的像侧数值孔径(na)限制为0.3或17.5度。照射光学器件子系统130被设计成其最大收集效率可达80％。为了减小系统放大率，第一透镜131需要具有更大的焦距并因此需要具有更小的物侧na，或者最后一个透镜134需要具有更短的焦距并因此需要具有更大的像侧na。第一选项降低了收集效率。测试杯的小接收角和分束器160与测试杯110之间的最小距离的机械要求使得第二选择不可行。因此，需要在放大率和收集效率之间进行折衷。当激发光200由照射光学器件130传送到位于容器110中的荧光染色的样品99时，这导致荧光团响应于激发而发射荧光辐射210。二向色性分束器160分离激发200和检测210光路。发射的荧光210由两个非球面pmma透镜151、152以1:1放大率的布置来收集，并聚焦在光电倍增管140(pmt)的光电阴极上。在光子计数模式中使用具有8×24mm2光电阴极有效面积的pmt。分别布置在激发子系统130和检测子系统150中的两个带通滤光器161、162确保仅发射的荧光210到达检测器140。参考光电二极管98用于监测激发光200的强度。
参考图3至图5，特征在于在照射光学器件的图像平面中形成的激发光源的图像。图3a示出了尺寸为1×1mm2的平面方形led的模拟图像。使用商业射线跟踪软件来获得光源(led)的图像。图像为方形，其中90％的功率环绕在5×5mm2的区域内。图4a示出了尺寸为1×1mm2的平面方形led的实验图像。实验图像在容器的底部生成，并且使用相机获得。led的实验图像是尺寸为5×5mm2的方形，其中由于相机的动态范围受限，无法看到低强度衰减边缘。图5a示出了在容器底部的氙闪光灯弧的实验图像。使用相同的相机获得该图像。图3b、图4b和图5b示出了分别从图3a、图4a和图5a的图像中截取的图像平面中沿着x方向和y方向的对应横截面归一化强度分布。闪光灯弧的图像为2×4mm2，并且因此其覆盖的照射区域为覆盖了71％的杯底区域的四倍对称led图像的1/3。照射光学器件的图像平面被布置在容器的样品容积内。在平面样品的情况下，图像平面优选地被布置成与平面样品(例如，容器110的底部处的干燥样品)所在的容器中的样品平面重合。
现在转向图6至图11，这些图中更详细地描述了免疫染色样品中基于镧系元素的荧光团的激发。在基于时间分辨的荧光光谱学的检测系统中，用激发脉冲形式的激发光对样品进行照射。激发脉冲的光被样品中的荧光团分子吸收，从而使得许多荧光团分子处于激发状态，这些荧光团分子可通过发射具有由荧光团的特征来确定的寿命的荧光辐射来脱离该激发状态。发射的荧光辐射与照射的激发光在光谱上分离，并将其收集并传送到对其进行测量的检测器。基于镧系元素的螯合物的典型寿命在几百微秒(μs)最多至几毫秒(ms)的范围内。
激发系统的光谱特征在图6中示出。被标记为“螯合物”的曲线提供了基于镧系元素的螯合物荧光团的激发光谱610的示例。此处示出的特定荧光团是来自芬兰(finland)radiometerturku的用于肌钙蛋白-i心脏标志物的基于铕的螯合物'a-galtekes'，其在下文中也称为“tni-螯合物”。tni-螯合物的激发光谱610在325nm处具有峰值，该激发光谱具有64nm的半峰全宽(fwhm)。将激发光谱610归一化为其最大值。应当注意到，不同的螯合物可具有略微不同的激发光谱，这些激发光谱具有变化的峰值波长。因此，当使用窄带光源(诸如，led)时，测定的性能会发生变化。被标记为“led”的曲线提供发光二极管的发射光谱620的示例。将发射光谱620同样归一化为其最大值。led发射光谱620以343nm为中心，并且具有10nm的fwhm。在脉冲模式下将led电流从100ma增加到1a时，未观察到峰值波长的视觉位移。对此处采用的特定led发射光谱620的进一步分析表明，对数刻度上的归一化led辐照度在372nm和404nm处分别下降到峰值发射的1％和0.1％。被标记为“ug111mm”的曲线提供了通常与基于氙闪光灯的照射系统结合使用的带通滤光器的透射光谱特征，特别是来自schott的1mm厚(schott在线库)(事实上，我们使用的是2mm厚的滤光器，但这可能不影响，并且也可能因太迟而无法采取任何措施)的dug11滤光器的透射光谱。来自schott的dug11滤光器滤除了闪光灯光谱的110nm窗口。因此，被标记为“ug111mm”的曲线示出了基于宽带氙闪光灯的照射系统的发射光谱630。假设脉冲能量恒定，则led发射光谱620与螯合物激发光谱610的重叠比闪光灯照射光谱630与该螯合物激发光谱的重叠大19％。
图7示出了说明可传送到容器的脉冲能量的图。被标记为720(led)的数据集示出了作为led电流的函数的激发脉冲能量，当使用脉冲持续时间为200μs且占空比为0.05的激发脉冲时，led可将该激发脉冲能量传送到容器。如实线730所示，基于氙闪光灯的照射系统每脉冲向样品传送5μj的脉冲能量。在370ma的电流下，由led传送的激发脉冲能量等于基于xe闪光灯的照射系统的激发脉冲能量。通过过载，led能够在1.5a的电流下传送最多至15μj的脉冲能量，该脉冲能量是数据表中指定的500ma最大注入电流下传送的脉冲能量的三倍。
图8和图9分别示出了由led和氙闪光灯产生的脉冲的时间特性。图8示出了作为时间的函数的信号的复合图，这些信号(从顶部到底部)表示：来自现场可编程门阵列(fpga)的触发脉冲810、来自由fpga控制的脉冲发生器(pg)的触发脉冲820、led电路中产生的led电流脉冲830(i)以及led输出功率脉冲840(o)。可例如使用如图1所示的装置中的光电二极管98来监视led输出功率。led输出功率840由led电流830确定。led输出功率脉冲840是棚车形状，具有上升沿841、具有基本恒定输出功率的平坦区域842和下降沿843。第一上升沿841与最终的下降沿843之间的持续时间被称为脉冲持续时间。led由与检测计数系统同步的led驱动器控制。使用可从thorlabs商购获得的驱动器。fpga用触发脉冲序列控制激发和检测系统。通过脉冲发生器(pg)连接到led驱动器，并且从而开启led。led脉冲持续时间为200μs，其比闪光灯脉冲持续时间200ns长，相差三个数量级，参见图9及下文。led脉冲持续时间必须小于荧光团寿命，同时传送足够的激发能量，以便使得足够数量的荧光团分子进入激发状态以产生可检测的光学信号。对于此处使用的驱动电路，最小脉冲持续时间为约5μs。然而，如果需要，可用特定驱动电路来实现较短的脉冲持续时间。观察到触发脉冲810与led电流脉冲830之间的8μs延迟。led脉冲的下降时间小于3μs。图9示出了氙闪光灯照射系统的时间相关功率输出的图。闪光灯具有200ns的脉冲持续时间和400ns的下降时间(90％-10％)。
参考图10和图11，讨论了脉冲持续时间和荧光寿命对受激发荧光团分子的数量的影响。如上所述，理解该关系的相关性相当重要，因为这有利于识别激发和检测周期的时序的可用范围，特别是有利于确定led激发脉冲的脉冲持续时间的可用范围。如上所述，长得多的led脉冲持续时间影响螯合物的激发效率。led脉冲持续时间与基于镧系元素的螯合物荧光团的荧光寿命相当，在数百微秒的范围内，而闪光灯脉冲则在数百纳秒的范围内。在第一种情况下，受激发分子的数量较少，如下文进一步详细描述的。受激发分子n的总数量遵循以下速率公式：
其中p(t)为激发脉冲峰值功率；k为荧光团的速率常数(与荧光寿命τ成反比)。激发脉冲断开时分子数量n0为
受激发分子的衰减遵循：
对于较长的激发脉冲，在脉冲能量相等的情况下，受激发分子的数量较少。图10示出了当由200ns和200μs的激发脉冲照射(分别对应曲线1100和1000)时，受激发分子n的时间相关数量。n在脉冲期间以与激发峰值功率成比例的系数呈指数增长，并且在脉冲断开时开始随寿命τ(此处为1ms)呈指数衰减。也可由激发脉冲和荧光衰减的卷积来获得该曲线。在这种情况下，脉冲持续时间之间三个数量级的差异对应于受激发分子数量的10％减少量，因此对应于荧光信号的减少量。图11中示出了脉冲持续时间与激发脉冲结束时受激发分子的数量n0减少之间的相关性。示出了分别对应于0.5ms和1ms两种不同荧光寿命值的曲线。在图11中，脉冲持续时间在保持总脉冲能量恒定的约束下变化。激发脉冲越长，激发脉冲结束时受激发分子的数量越少。
在检测延迟1020之后，通过在检测时间段内向检测装置发送激活计数系统的门信号，打开测量窗口1030。通常，当使用基于闪光灯的照射系统时，使用400μs的检测延迟来实现短寿命背景荧光的充分衰减。因此，同样以400μs的检测延迟执行使用led激发的比较测量。400μs的检测延迟1020在激发脉冲1010和标志着测量窗口1030的检测时间段之间。令人惊讶的是，本发明人已经发现，当使用基于led的照射时，检测延迟相对于400μs可减小，因为当用led激发时，背景计数似乎更快地衰减到“可接受”水平。由于检测延迟较短，当测量窗口打开时，来自基于镧系元素的示踪物荧光团的荧光信号衰减较少，因此通过led激发获得的信噪比得到进一步改善。例如，检测延迟可减小至300μs。
下文特别参考图12至图16，给出了用浓度为200ng/l的心脏标志物肌钙蛋白i(tni)样品进行的荧光免疫分析检测的详细示例，其中包括用于荧光免疫分析检测系统的根据上述实施方案的基于led的激发与基于传统氙闪光灯的激发之间的比较。系统的背景包括pmt暗计数以及来自光学单元本身、聚苯乙烯和非特异性结合的自发荧光。由于不存在闪光灯衰减边缘、激发脉冲持续时间较长且背景荧光寿命较短，并且与带更宽的闪光灯光谱(100nm)相比，具有背景激发光谱的窄带uv光(10nm)的光谱匹配性更差，在用led激发时，用无浓度溶液处理的空白杯测量的背景减少了。因此，将信号背景比提高了18％。可以注意到，在该特定构造中，当由基于led的系统在相同的曝光能量(即，相同的总脉冲能量)激发时，荧光信号降低了26％。基于led的系统的长三个数量级的激发脉冲使信号降低了10％。容器中荧光螯合物的不均匀空间分布进一步降低了荧光响应。因此，该系统的snr降低了15％。通常，可通过增大激发光能量来改善snr。对于恒定的激发能量，可通过减小照射面积、使得激发脉冲宽度较短以及(如果可能的话)使得与螯合物激发光谱具有更好的光谱匹配性来改善snr。信号和空白杯的标准偏差在与闪光灯的标准偏差相同的范围内。如在以下实施例中进一步详细描述的，本发明提供了用于在时间分辨荧光免疫分析检测中使用基于led的激发而不是闪光灯激发的可行解决方案。
实施例
在该实施例中，使用基于led的系统来测试其在肌钙蛋白i(tni)心脏标志物的时间分辨荧光免疫分析测量中的能力。用tni免疫分析法制备十五个样品杯和十五个空白杯，以用于实验。tni杯由用链霉抗生物素蛋白涂覆以阻断示踪物抗体的非特异性结合的聚苯乙烯制成。底部的一层捕获抗体用于捕获示踪物与捕获抗体之间的样品中的抗原。铕荧光标记物与示踪物抗体结合，将示踪物抗体放置在靠近侧面的杯中。绝缘层防止捕获抗体与示踪物抗体接触。用tni浓度为200ng/l的10μl参考溶液处理样品杯。在温育期间，将其加热至36℃并持续15分钟，振摇以缩短反应时间。反应之后，洗涤该杯，并将未结合的示踪物抗体冲洗掉。然后，与抗原结合的受标记的示踪物抗体由uv光源激发并且发射光，其中在616nm处具有峰值发射。以相同的方式处理空白杯，但用无tni浓度的溶液处理空白杯。将在空白杯上测量的计数称为背景计数。将基于当前使用的氙闪光灯的光学单元用于进行比较。该单元具有不同的激发光学器件，但检测光路相同。在实验之前将独立闪光灯单元调整并校准至已知标准。调整基于led的光学单元的led电流以传送与闪光灯单元相同的每脉冲能量。因此，在不旋转的情况下，在闪光灯和led上测量相同杯架中的每个杯子。
文献中使用的snr具有不同的定义。我们将snr定义为针对平均背景值校正的信号除以信号和背景变化的总和
其中，
该系统的背景包括pmt暗计数(少于10/25℃)、来自光学单元本身(来自材料和污染物的自发荧光)和来自杯子(聚苯乙烯、链霉抗生物素蛋白涂层、非特异性结合、污染物)的背景。此外，我们将背景与(仅聚苯乙烯)空杯和(用无浓度溶液处理的)空白杯区分开来。如上文所讨论，后者在底部含有具有抗体的化学层，并且理想地冲洗掉所有示踪物抗体。
图12和图13比较了基于led的系统和基于闪光灯的系统的背景。图12示出了对来自光学单元本身的背景进行重复测量得到的数据，利用黑色pom密闭容积夹具以及在125hz下用闪光灯激发和led激发测量的空杯的背景，测量以上数据。图13示出了led125hz、led250hz和闪光灯激发的背景；区分了四个背景来源：pmt暗计数、光学单元、空杯(仅聚苯乙烯)和用无浓度处理的杯子。利用由黑色聚甲醛(pom)制成的特殊光密夹具来测量光学单元本身的背景。夹具具有密闭的容积，并且内部无杯状物。对于在125hz下操作的基于led的光学单元，利用黑色pom测量的单元本身的背景为26±7次计数(包括暗计数)，利用空杯测量的背景为51±4次计数，并且在空白杯上测量时得到的背景为62±9次计数(图12)。图中的点是在用于黑色pom和空杯的一个夹具上执行的重复测量。在图13中，平均值和标准偏差根据利用密闭容积黑色pom和空杯进行的10次重复测量以及用于空白杯的15次重复来计算。基于闪光灯的光学单元表现出来自单元本身的51±5次计数、来自空杯的95±21和用经处理的杯子测量的119±22。就两种光源而言，四种背景来源的比例大致相同，但就125hz和250hz操作而言，led单元中的背景分别减少了52％和39％。这种背景减少部分地归因于，与闪光灯相比，led不存在余辉。氙闪光灯表现出数百微秒的余辉，这增加了背景并降低了信噪比。有助于时间门控测量的背景的长寿命部分的强度同样取决于激发脉冲宽度。脉冲宽度越长，发射非期望光的分子的数量就越少，如果背景寿命短于荧光团寿命，则下降得更快。此外，led发射光谱比基于闪光灯的系统的光谱窄十倍。如果背景的激发光谱是宽带的，则其与宽带闪光灯激发具有更佳的光谱匹配性。
图14示出了tni200ng/l浓度下的15次重复和用无浓度溶液处理的15个空白杯的荧光响应，其中荧光响应由闪光灯系统和led系统使用相等的激发能量来激发。图上的每个点均表示用777个脉冲对一个杯子进行的一次测量。
用具有相同曝光能量的两个光学单元来测量具有浓度为200ng/l的心脏标志物tni的样品杯。如上所述，图14示出了30个杯(15个样品杯和15个空白杯)的数据，表1示出了光源参数和统计数据。将样品暴露于777个脉冲下，其中每个脉冲的脉冲能量为5.1μj，重复频率为250hz(125hz)，其对应于1.27mw(0.64mw)的平均功率。以两个重复频率测试基于led的光学单元。利用使用t-参数施图登特分布计算的样品平均值的置信区间将平均计数给出为
其中α为置信水平。对于95％的α和15个样品，标准偏差置信区间为[0.73s；1.58s]，见表1。应当注意到，15个杯的样品量不足以具有高统计精度，但这并不是本研究的目标。需要约200次重复，才能实现标准偏差的置信水平为95％的置信区间[0.91s；1.08s]。cvs和cvb分别是浓度为200ng/l的杯子和空白杯的变量系数。将其计算为样品标准偏差与其平均值的关系。信号背景比提高了18％，因为采用led激发降低了背景，如上所述。当用led单元激发时，样品杯的荧光响应降低了26％。因此，由于信号降低，snr也降低。光源的三个差异有助于改变信号电平：增大的激发脉冲宽度、不同的空间分布和光谱分布。如上文所讨论，增大的脉冲宽度对应于10％的信号降低。当其他参数恒定时，led激发的光谱重叠率提高19％。如果杯中的螯合物分布不均匀，则照射面积扩大可导致信号进一步降低。根据确切的螯合物分布来看，如果螯合物更多地集中在中心，则照射面积扩大三倍可能是不利的。观察到，闪光灯图像在仪器中未对准，偏离几毫米，这使得其未居中但放置在杯子的边缘上，与对准设置相比，这使得信号降低30％。
表1：样品浓度为200ng/l和无浓度时呈现的激发光和激发效率的参数。在两个重复频率250hz和125hz下，以恒定的脉冲能量使用led。计算15次重复的数据。
保持激发能量恒定，可通过减小杯中的照射面积来改善snr，从而获得更高的荧光信号。减小激发脉冲宽度将增大信号，但最高仅能实现10％的提高。与以340nm为中心的螯合物激发光谱的更佳光谱重叠将进一步改善信号。还可通过增加激发能量来改善snr。图15示出了tni浓度为200ng/l时四个杯子的平均信噪比与led电流(激发脉冲能量)的关系。snr随激发功率的平方根而增大；正方形和菱形分别示出了用于基于闪光灯的单元和基于led的单元的15次重复实验的平均值。图15示出了tni浓度为200ng/l时作为led电流的函数的snr，其中snr以平方根因变量增大(拟合实心曲线)。计算得出四次重复的snr，以圆圈示出。该行为可由系统中的泊松分布信号和噪声来解释，其中分布的标准偏差等于其平均值。用15次重复实验计算得到的值(表1)被分别示出为：正方形用于闪光灯激发，菱形用于250hz下的led单元。研究大量样品可实现更高的统计精度。如果在公式4中仅考虑背景变化，则当信号与检测系统噪声相当时，snr快速增大，然后在其不依赖于激发功率时达到平稳状态。发生这种情况是因为，当示踪物分子与杯壁结合时，背景中很大一部分均来自非特异性结合。在这种情况下，螯合物浓度非常低，并且背景变化出现在平方根曲线中可近似为线性的部分中。信号背景比同样不依赖于激发功率，因为背景随激发功率线性增长。图16示出了作为led电流(led激发)的函数的来自空白杯和空杯的背景计数。空白杯和空杯的背景随着激发功率增长，如图16所示。因此，可通过增大激发功率并且通过调整样品照射的光谱、空间和时间特征来改善snr比。
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