用于生肉和加工肉类产品的肉种鉴定的LC/MS/MS分析的制作方法

本申请要求2016年9月8日提交的美国临时申请第62/384,925号的优先权，其全部内容以引用的方式并入本文中。本案涉及肉类样品中的污染的分析和鉴定。
背景技术：
：食品标准局(fsa)(英国的独立政府部门)在2013年1月宣布已在由若干连锁超市出售的牛肉产品中鉴定出马和/或猪的脱氧核糖核酸(dna)分子。跨越和超出欧洲的随访测试已显示此类污染广泛发生。其它肉种存在于假设纯的特定肉类产品样品中已引起普遍关注。污染可能是肉类产品中存在非所需量的猪肉、牛肉、羔羊肉、鸡肉、鸭肉和/或马肉中的一或多种的结果。但是，大部分现有测试方法基于使用聚合酶链反应(pcr)来检测肉类中的物种特异性dna，其为费时的且不检测或鉴定蛋白质。这是一个问题，因为dna可以在标准肉类加工和食品制造期间容易地破坏或去除。结果是马肉组织或其它污染物仍未在食物样品中被发现，尽管强有力地存在污染性蛋白质。替代性的基于蛋白质的方法，酶联免疫吸附分析(elisa)可用于补充dna测试。但是，elisa方法仅检测蛋白质的一部分且不检测多种蛋白质标记物。已提出若干检测潜在肉类污染的方法。2016年6月21日公布且以引用的方式并入本文中的美国专利第9,373,486号传授用于检测肉类污染的mrm引发的检测和测序(midas)工作流。分析化学(anal.chem.)20158710315-10322(其内容以引用的方式并入本文中)描述基于mrm的技术，所述技术聚焦于检测肌血球素源性肽以检测包括马肉、牛肉、猪肉和羔羊肉的未申报肉类的存在。如此参考文献中所指示，由于例如缺乏信号质量、不同物种之间的非独特性等问题，并非所有来自给定动物的肽均适用作标记物。所属领域中需要可靠地检测肉类样品中猪肉、牛肉、羔羊肉、鸡肉、鸭肉和/或马肉的肉类污染的存在的简化方式。技术实现要素：根据本传授内容的各种实施例，描述不需要化学标记而在一或多种样品中鉴定一或多种不同肉种的存在的方法。在各种实施例中，方法包含使用母离子-子离子跃迁监测(pditm)在样品中鉴定一或多种不同肉种的存在。在各种实施例中，方法可用于在肉类样品中鉴定猪肉、牛肉、羔羊肉、鸡肉、鸭肉和/或马肉中的一或多个的存在。对于每一物种唯一的胰蛋白酶肽可以使用本文中描述的液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)和母离子-子离子跃迁来观测。术语“母离子-子离子跃迁监测”或“pditm”是指例如使用质谱的测量，从而选择第一质量分离器的传输质荷比(m/z)范围(通常称为质谱的第一尺寸且可被描述为q1)以将分子态离子(通常称为“母离子”或“前体离子”)传输至离子碎裂器(例如碰撞室、光致解离区等)，以产生碎片离子(通常称为“子离子”)，且选择第二质量分离器的传输m/z范围(通常称为质谱的第二尺寸且可被描述为q3)以将一或多个子离子传输至测量子离子信号的检测器。监测的母离子和子离子质量的组合可称为监测的“母离子-子离子跃迁”或前体-子离子跃迁。在检测器处所监测的给定母离子-子离子组合的子离子信号可以称为“母离子-子离子跃迁信号”。在本传授内容的各种实施例中，母离子为衍生自对于动物物种唯一的蛋白质的肽序列且监测的母离子-子离子跃迁对于所述动物是唯一的。举例来说，母离子-子离子跃迁监测的一个实施例是多反应监测(mrm)(也称为选择性反应监测)。在mrm的各种实施例中，指定母离子-子离子跃迁的监测包含使用第一质量分离器(例如停放在所关注母离子m/z上的第一四极杆)来传输所关注母离子并且使用第二质量分离器(例如停放在所关注子离子m/z上的第二四极杆)来传输一或多个所关注子离子。在各种实施例中，pditm可由使用第一质量分离器(例如停放在所关注母离子m/z上的四极杆)传输母离子和在包括一或多个所关注子离子的m/z值的m/z范围内扫描第二质量分离器来进行。举例来说，可以使用串联质谱仪(ms/ms)仪器或更一般而言，多维质谱仪(msn)仪器来进行pditm，例如mrm。合适的质量分析仪系统的实例包括但不限于包含以下中的一或多个的那些质量分析仪系统：三重四极杆、四极杆-线性离子阱、四极杆飞行时间(tof)和tof-tof。在一些实施例中，描述检测牛肉样品被选自由猪肉、羔羊肉、鸡肉和鸭肉组成的群组的一或多种肉类污染的方法。方法包含：将蛋白水解酶添加至样品以将样品中除了牛肉以外的任何一或多种肉类的至少一部分溶解为多种肽；和使用液相色谱串联质谱(lc-ms/ms)来分析所述多种肽以确定是否存在除了牛肉以外的一或多种肉类，其通过监测具有与选自下文提及的表1、2、4和5的特定氨基酸序列相关的指定m/z值的至少一个母离子-子离子对跃迁。在一些实施例中，公开检测样品中的猪肉的方法。方法包含：将蛋白水解酶添加至样品以将样品中的任何猪肉的至少一部分溶解为多种肽；和使用液相色谱串联质谱(lc-ms/ms)来分析所述多种肽以确定是否存在猪肉，其通过监测具有与选自表1的特定氨基酸序列相关的指定m/z值的至少一个母离子-子离子对跃迁。在一些实施例中，描述检测样品中的牛肉的方法。方法包含：将蛋白水解酶添加至样品以将样品中的任何牛肉的至少一部分溶解为多种肽；和使用液相色谱串联质谱(lc-ms/ms)来分析所述多种肽以确定是否存在牛肉，其通过监测具有与选自表2的特定氨基酸序列相关的指定m/z值的至少一个母离子-子离子对跃迁。在一些实施例中，描述检测样品中的羔羊肉的方法。方法包含：将蛋白水解酶添加至样品以将样品中的任何羔羊肉的至少一部分溶解为多种肽；和使用液相色谱串联质谱(lc-ms/ms)来分析所述多种肽以确定是否存在羔羊肉，其通过监测具有与选自表3的特定氨基酸序列相关的指定m/z值的至少一个母离子-子离子对跃迁。在一些实施例中，描述检测样品中的鸡肉的方法。方法包含：将蛋白水解酶添加至样品以将样品中的任何鸡肉的至少一部分溶解为多种肽；和使用液相色谱串联质谱(lc-ms/ms)来分析所述多种肽以确定是否存在鸡肉，其通过监测具有与选自表4的特定氨基酸序列相关的指定m/z值的至少一个母离子-子离子对跃迁。在一些实施例中，描述检测样品中的鸭肉的方法。方法包含：将蛋白水解酶添加至样品以将样品中的任何鸭肉的至少一部分溶解为多种肽；和使用液相色谱串联质谱(lc-ms/ms)来分析所述多种肽以确定是否存在鸭肉，其通过监测具有与选自表5的特定氨基酸序列相关的指定m/z值的至少一个母离子-子离子对跃迁。在一些实施例中，描述检测样品中的马肉的方法。方法包含：将蛋白水解酶添加至样品以将样品中的任何马肉的至少一部分溶解为多种肽；和使用液相色谱串联质谱(lc-ms/ms)来分析所述多种肽以确定是否存在马肉，其通过监测具有与选自表6的特定氨基酸序列相关的指定m/z值的至少一个母离子-子离子对跃迁。在一些实施例中，描述用于检测猪肉、牛肉、羔羊肉、鸡肉、鸭肉和马肉的系统。方法包含：被配置成进行母离子-子离子跃迁监测的串联质谱仪；和与串联质谱仪连通的处理器，其向串联质谱仪发送指令以通过监测选自表1-6的一或多个母离子-子离子跃迁来检测对于猪肉、牛肉、羔羊肉、鸡肉、鸭肉和/或马肉唯一的肽的存在。附图说明熟练技术人员将理解下文描述的图式仅出于说明的目的。这些图式并不意图以任何方式限制本传授内容的范围。图1描绘在lc运行过程中可见的特定类型的肉类的纯样品中检测到的前体离子数目的图示。图2a显示在本传授内容的一个实施例中，5种类型的肉类的蛋白质消化混合物的提取离子色谱图(xic)。图2b显示在本传授内容的一个实施例中，马肉样品的提取xic。图3显示根据本传授内容的各种实施例，猪肉在各种浓度水平下的提取离子色谱图。图4显示根据本传授内容的各种实施例，牛肉在各种浓度水平下的提取离子色谱图。图5显示根据本传授内容的各种实施例，羔羊肉在各种浓度水平下的提取离子色谱图。图6显示根据本传授内容的各种实施例，鸡肉在各种浓度水平下的提取离子色谱图。图7显示根据本传授内容的各种实施例，鸭肉在各种浓度水平下的提取离子色谱图。图8显示根据本传授内容的各种实施例，马肉在各种浓度水平下的提取离子色谱图。图9至14分别显示根据本传授内容的各种实施例，从猪肉、牛肉、羔羊肉、鸡肉、鸭肉和马肉中的每一个产生的校准曲线。图15显示根据本传授内容的各种实施例，快餐样品中的牛肉的提取离子色谱图。图16显示根据本传授内容的各种实施例，快餐样品中的猪肉、羔羊肉、鸡肉和鸭肉的提取离子色谱图。图17说明根据本传授内容的各种实施例，制备样品进行分析的一个例示性过程。在详细地描述本发明的一或多个实施例之前，所属领域的技术人员应了解，本发明的应用不限于以下具体实施方式中所阐述的结构、组分的布置和步骤的布置的细节。本发明能够具有其它实施例并且以各种方式实践或进行。而且，应理解，本文中所使用的措词和术语是出于描述的目的且不应被视为是限制性的。具体实施方式所属领域的技术人员应理解，本文所述的方法和试剂盒为非限制性例示性实施例且申请人的公开内容的范围仅由权利要求书来界定。虽然结合各种实施例来描述本申请人的传授内容，但并不打算将申请人的传授内容限制于此类实施例。相反地，如所属领域的技术人员应了解，申请人的传授内容涵盖各种替代方案、修改和等效物。结合一个例示性实施例所说明或描述的特征可以与其它实施例的特征组合。此类修改和变化打算包括在申请人的公开内容的范围内。根据各种实施例，提供使用质谱，通过检测一或多种特异性针对所关注肉类的氨基酸序列来针对肉类样品中猪肉、牛肉、羔羊肉、鸡肉、鸭肉和/或马肉的存在或数量筛选样品的方法。举例来说，对于特定动物唯一的动物特异性肽可使用液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)来检测。可针对每种肽观测选择的mrm跃迁以使得能够检测和/或定量样品中的肉类类型。方法可利用所属领域中已知的多种质谱技术。举例来说，质谱技术可以是串联质谱(ms/ms)技术和/或液相色谱串联质谱(lc-ms/ms)技术。在一些实施例中，技术包含lc-ms/ms技术和使用三重四极杆仪器和多反应监测(mrm)。在本传授内容中，如关于前体-产物离子对跃迁在本文所用的术语“约”打算意指在+/-一(1)原子质量单位的范围内。根据一些实施例，方法可包含通过检测至少一种特异性针对猪肉的分离肽，例如具有本文中鉴定的氨基酸序列seqidno:1-4的一或多种肽来检测和/或定量样品中的猪肉。举例来说，lc-ms/ms可用于测定样品中猪肉特异性肽的存在和/或数量。在一个例示性实施例中，三重四极杆质谱仪可用于监测选择的多反应监测(mrm)跃迁。在一些实施例中，猪肉特异性肽可具有本文中鉴定的氨基酸序列seqidno:1，且方法可包括监测至少一个具有约453/581或453/480的m/z值的母离子-子离子对跃迁。在其它实施例中，猪肉特异性肽可具有本文中鉴定的氨基酸序列seqidno:2，且方法可包括监测至少一个具有约879/777或879/981的m/z值的母离子-子离子对跃迁。在其它实施例中，猪肉特异性肽可具有本文中鉴定的氨基酸序列seqidno:3，且方法可包括监测至少一个具有约564/784或564/393的m/z值的母离子-子离子对跃迁。在其它实施例中，猪肉特异性肽可具有本文中鉴定的氨基酸序列seqidno:4，且方法可包括监测至少一个具有约534/853或534/782的m/z值的母离子-子离子对跃迁。在一个例示性实施例中，方法可包括监测多个与每一猪肉特异性肽相关的母离子-子离子对跃迁。举例来说，具有氨基酸序列seqidno:1的猪肉特异性肽可通过监测具有约453/581或453/480的m/z值的母离子-子离子对跃迁中的一个或两个来鉴定。在一个实施例中，检测或定量样品中的猪肉的方法可包括检测多种猪肉特异性肽。作为非限制性实例，猪肉可以通过使用具有本文中鉴定的氨基酸序列seqidno:1-4的肽的任何组合或全部来检测和/或定量。如上文所论述，对于每种肽，可监测母离子-子离子对跃迁中的一或多个。下表1显示根据本传授内容，测定为特异性针对猪肉的肽的序列seqidno:1-4，连同其最优mrmq1、q3母离子-子离子跃迁以及括号中的产物离子的片段标识符。根据各种实施例，这些观测的肽和跃迁可用于实现在样品中存在的猪肉的可靠定量。表1根据一些实施例，方法可包含通过检测至少一种特异性针对牛肉的分离肽，例如具有本文中鉴定的氨基酸序列seqidno:5-8的一或多种肽来检测和/或定量样品中的牛肉。举例来说，lc-ms/ms可用于测定样品中牛肉特异性肽的存在和/或数量。在一个例示性实施例中，三重四极杆质谱仪可用于监测选择的多反应监测(mrm)跃迁。在一些实施例中，牛肉特异性肽可具有本文中鉴定的氨基酸序列seqidno:5，且方法可包括监测至少一个具有约462/722或462/575的m/z值的母离子-子离子对跃迁。在其它实施例中，牛肉特异性肽可具有本文中鉴定的氨基酸序列seqidno:6，且方法可包括监测至少一个具有约582/951或582/708的m/z值的母离子-子离子对跃迁。在其它实施例中，牛肉特异性肽可具有本文中鉴定的氨基酸序列seqidno:7，且方法可包括监测至少一个具有约595/974或595/215的m/z值的母离子-子离子对跃迁。在其它实施例中，猪肉特异性肽可具有本文中鉴定的氨基酸序列seqidno:8，且方法可包括监测至少一个具有约583/703或583/759的m/z值的母离子-子离子对跃迁。在一个例示性实施例中，方法可包括监测多个与每一牛肉特异性肽相关的母离子-子离子对跃迁。举例来说，具有氨基酸序列seqidno:5的牛肉特异性肽可通过监测具有约462/722或462/575的m/z值的母离子-子离子对跃迁中的一个或两个来鉴定。在一个实施例中，检测或定量样品中的牛肉的方法可包括检测多种牛肉特异性肽。作为非限制性实例，牛肉可以通过使用具有本文中鉴定的氨基酸序列seqidno:5-8的肽的任何组合或全部来检测和/或定量。如上文所论述，对于每种肽，可监测母离子-子离子对跃迁中的一或多个。下表2显示根据本传授内容，测定为特异性针对牛肉的肽的序列seqidno:5-8，连同其最优mrmq1、q3母离子-子离子跃迁以及括号中的产物离子的片段标识符。根据各种实施例，这些观测的肽和跃迁可用于实现在样品中存在的牛肉的可靠定量。表2根据一些实施例，方法可包含通过检测至少一种特异性针对羔羊肉的分离肽，例如具有本文中鉴定的氨基酸序列seqidno:9-12的一或多种肽来检测和/或定量样品中的羔羊肉。举例来说，lc-ms/ms可用于测定样品中羔羊肉特异性肽的存在和/或数量。在一个例示性实施例中，三重四极杆质谱仪可用于监测选择的多反应监测(mrm)跃迁。在一些实施例中，羔羊肉特异性肽可具有本文中鉴定的氨基酸序列seqidno:9，且方法可包括监测至少一个具有约718/1037或718/745的m/z值的母离子-子离子对跃迁。在其它实施例中，羔羊肉特异性肽可具有本文中鉴定的氨基酸序列seqidno:10，且方法可包括监测至少一个具有约623/523或623/823的m/z值的母离子-子离子对跃迁。在其它实施例中，羔羊肉特异性肽可具有本文中鉴定的氨基酸序列seqidno:11，且方法可包括监测至少一个具有约515/659或515/832的m/z值的母离子-子离子对跃迁。在其它实施例中，羔羊肉特异性肽可具有本文中鉴定的氨基酸序列seqidno:12，且方法可包括监测至少一个具有约431/589或431/862的m/z值的母离子-子离子对跃迁。在一个例示性实施例中，方法可包括监测多个与每一羔羊肉特异性肽相关的母离子-子离子对跃迁。举例来说，具有氨基酸序列seqidno:9的羔羊肉特异性肽可通过监测具有约718/1037或718/745的m/z值的母离子-子离子对跃迁中的一个或两个来鉴定。在一个实施例中，检测或定量样品中的羔羊肉的方法可包括检测多种羔羊肉特异性肽。作为非限制性实例，羔羊肉可以通过使用具有本文中鉴定的氨基酸序列seqidno:9-12的肽的任何组合或全部来检测和/或定量。如上文所论述，对于每种肽，可监测母离子-子离子对跃迁中的一或多个。下表3显示根据本传授内容，测定为特异性针对羔羊肉的肽的序列seqidno:9-12，连同其最优mrmq1、q3母离子-子离子跃迁以及括号中的产物离子的片段标识符。根据各种实施例，这些观测的肽和跃迁可用于实现在样品中存在的羔羊肉的可靠定量。表3根据一些实施例，方法可包含通过检测至少一种特异性针对鸡肉的分离肽，例如具有本文中鉴定的氨基酸序列seqidno:13-16的一或多种肽来检测和/或定量样品中的鸡肉。举例来说，lc-ms/ms可用于测定样品中鸡肉特异性肽的存在和/或数量。在一个例示性实施例中，三重四极杆质谱仪可用于监测选择的多反应监测(mrm)跃迁。在一些实施例中，鸡肉特异性肽可具有本文中鉴定的氨基酸序列seqidno:13，且方法可包括监测至少一个具有约482/213或482/750的m/z值的母离子-子离子对跃迁。在其它实施例中，鸡肉特异性肽可具有本文中鉴定的氨基酸序列seqidno:14，且方法可包括监测至少一个具有约768/923或768/1037的m/z值的母离子-子离子对跃迁。在其它实施例中，鸡肉特异性肽可具有本文中鉴定的氨基酸序列seqidno:15，且方法可包括监测至少一个具有约789/890或789/213的m/z值的母离子-子离子对跃迁。在其它实施例中，鸡肉特异性肽可具有本文中鉴定的氨基酸序列seqidno:16，且方法可包括监测至少一个具有约684/1136或684/1006的m/z值的母离子-子离子对跃迁。在一个例示性实施例中，方法可包括监测多个与每一鸡肉特异性肽相关的母离子-子离子对跃迁。举例来说，具有氨基酸序列seqidno:13的鸡肉特异性肽可通过监测具有约482/213或482/750的m/z值的母离子-子离子对跃迁中的一个或两个来鉴定。在一个实施例中，检测或定量样品中的鸡肉的方法可包括检测多种鸡肉特异性肽。作为非限制性实例，鸡肉可以通过使用具有本文中鉴定的氨基酸序列seqidno:13-16的肽的任何组合或全部来检测和/或定量。如上文所论述，对于每种肽，可监测母离子-子离子对跃迁中的一或多个。下表4显示根据本传授内容，测定为特异性针对鸡肉的肽的序列seqidno:13-16，连同其最优mrmq1、q3母离子-子离子跃迁以及括号中的产物离子的片段标识符。根据各种实施例，这些观测的肽和跃迁可用于实现在样品中存在的鸡肉的可靠定量。表4根据一些实施例，方法可包含通过检测至少一种特异性针对鸭肉的分离肽，例如具有本文中鉴定的氨基酸序列seqidno:17-20的一或多种肽来检测和/或定量样品中的鸭肉。举例来说，lc-ms/ms可用于测定样品中鸭肉特异性肽的存在和/或数量。在一个例示性实施例中，三重四极杆质谱仪可用于监测选择的多反应监测(mrm)跃迁。在一些实施例中，鸭肉特异性肽可具有本文中鉴定的氨基酸序列seqidno:17，且方法可包括监测至少一个具有约677/1122或677/992的m/z值的母离子-子离子对跃迁。在其它实施例中，鸭肉特异性肽可具有本文中鉴定的氨基酸序列seqidno:18，且方法可包括监测至少一个具有约977/946或977/1442的m/z值的母离子-子离子对跃迁。在其它实施例中，鸭肉特异性肽可具有本文中鉴定的氨基酸序列seqidno:19，且方法可包括监测至少一个具有约550/820或550/473的m/z值的母离子-子离子对跃迁。在其它实施例中，鸭肉特异性肽可具有本文中鉴定的氨基酸序列seqidno:20，且方法可包括监测至少一个具有约693/954或693/826的m/z值的母离子-子离子对跃迁。在一个例示性实施例中，方法可包括监测多个与每一鸭肉特异性肽相关的母离子-子离子对跃迁。举例来说，具有氨基酸序列seqidno:17的鸭肉特异性肽可通过监测具有约677/1122或677/992的m/z值的母离子-子离子对跃迁中的一个或两个来鉴定。在一个实施例中，检测或定量样品中的鸭肉的方法可包括检测多种鸭肉特异性肽。作为非限制性实例，鸭肉可以通过使用具有本文中鉴定的氨基酸序列seqidno:17-20的肽的任何组合或全部来检测和/或定量。如上文所论述，对于每种肽，可监测母离子-子离子对跃迁中的一或多个。下表5显示根据本传授内容，测定为特异性针对鸭肉的肽的序列seqidno:17-20，连同其最优mrmq1、q3母离子-子离子跃迁以及括号中的产物离子的片段标识符。根据各种实施例，这些观测的肽和跃迁可用于实现在样品中存在的鸭肉的可靠定量。表5根据一些实施例，方法可包含通过检测至少一种特异性针对马肉的分离肽，例如具有本文中鉴定的氨基酸序列seqidno:21-24的一或多种肽来检测和/或定量样品中的马肉。举例来说，lc-ms/ms可用于测定样品中马肉特异性肽的存在和/或数量。在一个例示性实施例中，三重四极杆质谱仪可用于监测选择的多反应监测(mrm)跃迁。在一些实施例中，马肉特异性肽可具有本文中鉴定的氨基酸序列seqidno:21，且方法可包括监测至少一个具有约508/803或508/902的m/z值的母离子-子离子对跃迁。在其它实施例中，马肉特异性肽可具有本文中鉴定的氨基酸序列seqidno:22，且方法可包括监测至少一个具有约888/1030或888/973的m/z值的母离子-子离子对跃迁。在其它实施例中，马肉特异性肽可具有本文中鉴定的氨基酸序列seqidno:23，且方法可包括监测至少一个具有约818/948或818/847的m/z值的母离子-子离子对跃迁。在其它实施例中，鸭肉特异性肽可具有本文中鉴定的氨基酸序列seqidno:24，且方法可包括监测至少一个具有约583/646或583/759的m/z值的母离子-子离子对跃迁。在一个例示性实施例中，方法可包括监测多个与每一马肉特异性肽相关的母离子-子离子对跃迁。举例来说，具有氨基酸序列seqidno:21的马肉特异性肽可通过监测具有约508/803或508/902的m/z值的母离子-子离子对跃迁中的一个或两个来鉴定。在一个实施例中，检测或定量样品中的马肉的方法可包括检测多种马肉特异性肽。作为非限制性实例，马肉可以通过使用具有本文中鉴定的氨基酸序列seqidno:21-24的肽的任何组合或全部来检测和/或定量。如上文所论述，对于每种肽，可监测母离子-子离子对跃迁中的一或多个。下表6显示根据本传授内容，测定为特异性针对马肉的肽的序列seqidno:21-24，连同其最优mrmq1、q3母离子-子离子跃迁以及括号中的产物离子的片段标识符。根据各种实施例，这些观测的肽和跃迁可用于实现在样品中存在的马肉的可靠定量。表6尽管上述实施例例示使用三重四极杆串联质谱仪，但应了解，本传授内容的范围内包括使用其它串联质谱仪类型系统，其可包括但不限于四极杆-飞行时间(tof)、四极杆-阱(trap)和tof-tof系统。在一些实施例中，以上动物物种中的两个或更多个可以通过经由lc-ms/ms检测特异性针对每种类型的肉类，如上文所述的那些的一或多种肽来检测和/或定量，其中对于每种肽，可监测mrm跃迁中的一个或两个，如上文所述的那些。在一个实施例中，举例来说，猪肉蛋白质可通过监测特异性针对猪肉的肽中的一种的mrm跃迁(例如监测具有氨基酸序列seq.idno.1的肽的453/581和453/480的mrm跃迁以及监测具有氨基酸序列seq.idno.2的肽的879/777和879/981的mrm跃迁)和特异性针对牛肉的一种肽的mrm跃迁(例如监测具有氨基酸序列seq.idno.5的肽的462/722和462/575的mrm跃迁)而检测于样品中。在一些实施例中，使用一或多种肽和针对本文所述的一或多种肽中的每一种的一或多个跃迁中的每一个来检测和监测所有动物肉种。在一些实施例中，可通过使用针对一或多种肽中的每一种的一或多个跃迁中的每一个来监测上文所述的一或多种肽以测定肉类样品被猪肉、牛肉、羔羊肉、鸡肉、鸭肉和/或马肉中的一或多种的污染。举例来说，在一个实施例中，牛肉样品可被猪肉、羔羊肉、鸡肉、鸭肉和/或马肉中的一或多种污染且通过使用本传授内容中提及的一或多种肽和/或跃迁来监测特异性针对猪肉、羔羊肉、鸡肉、鸭肉和/或马肉的肽，可进行污染的测定。在其它实施例中，可使用本传授内容检查羔羊肉样品被猪肉、牛肉、鸡肉、鸭肉和/或马肉的污染。如应理解，特定类型的肉类被另一类型的肉类污染的检测可由检测一或多种肽和针对本文所述的一或多种肽中的每一种的一或多个跃迁中的每一个的存在来进行。根据一些实施例，提供用于猪肉、牛肉、羔羊肉、鸡肉、鸭肉和/或马肉中的至少一种的样品的质谱测试的试剂盒。试剂盒可包括一或多种特异性针对猪肉、牛肉、羔羊肉、鸡肉、鸭肉和/或马肉的分离肽。举例来说，试剂盒可包括一或多种具有氨基酸序列seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3或seqidno:4的经分离猪肉特异性肽。在一个方面中，试剂盒可包括一或多种具有氨基酸序列seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7或seqidno:8的经分离牛肉特异性肽。在一个实施例中，试剂盒可包括一或多种经分离羔羊肉特异性肽，如具有氨基酸序列seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11或seqidno:12的那些肽。或者或另外，试剂盒可包括一或多种特异性针对鸡肉的分离肽，如具有氨基酸序列seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15或seqidno:16的那些肽。在一个实施例中，试剂盒可包括一或多种具有氨基酸序列seqidno:17、seqidno:18、seqidno:19、seqidno:20的鸭肉特异性肽。试剂盒还可包括一或多种具有氨基酸序列seqidno:21、seqidno:22、seqidno:23或seqidno:24的马肉特异性肽。在一些实施例中，试剂盒可包含至少一种特异性针对猪肉、牛肉、羔羊肉、鸡肉、鸭肉和/或马肉中的每一个的分离肽。举例来说，试剂盒可包含对应于本文中鉴定的seqidno:1-24的分离肽中的每一个中的一个。或者，试剂盒可包含选自对应于seqidno.1-4的组的一种肽、对应于seqidno.5-8的组的一种肽、对应于seqidno.9-12的组的一种肽、对应于seqidno.13-16的组的一种肽和对应于seqidno.17-20的组的一种肽。另外，试剂盒可包含选自对应于seqidno.21-24的组的一种肽。在一些实施例中，肽可以被同位素标记(例如使用15n、13c)。根据一些实施例，提供用于猪肉、牛肉、羔羊肉、鸡肉、鸭肉和/或马肉中的至少一种的样品的质谱测试的试剂盒。试剂盒可包括例如至少一种蛋白水解酶，用于使猪肉、牛肉、羔羊肉、鸡肉、鸭肉和/或马肉中的一或多种碎裂为多种肽。举例来说，蛋白水解酶可有效地使肉类样品碎裂为多种肽，其中至少一种具有氨基酸序列seqidno.1-24。试剂盒还可包括至少一种试剂，用于使用质谱仪定量具有氨基酸序列seqidno:1-24的多种肽中的至少一种。各种方法和试剂可有效地制备用于质谱分析的样品和/或使肉类样品碎裂为多种肽。举例来说，在一个例示性实施例中，蛋白水解酶可以是可将肉类样品溶解为多种肽的胰蛋白酶。在一些实施例中，试剂盒可包括lc柱，蛋白水解酶(如胰蛋白酶)固定于所述lc柱上。试剂盒还可包含消化组分，包括缓冲剂酶、烷化剂、还原剂、和任选地其它试剂和/或组分。在一些实施例中，试剂盒可以包含例如均质分析以使得使用者仅需要添加样品。在一些实施例中，试剂盒可以包含校准或归一化试剂或标准物。举例来说，试剂盒可包含至少一种特异性针对猪肉、牛肉、羔羊肉、鸡肉、鸭肉和/或马肉中的每一个的肽以校准动物特异性肽的定量。作为非限制性实例，试剂盒可含有已知浓度的动物特异性肽中的每一种的溶液，以使得可构建校准曲线。在一些实施例中，试剂盒可含有所关注动物(例如猪肉、牛肉、羔羊肉、鸡肉、鸭肉和/或马肉)中的至少一个的肽，用于校准动物特异性肽或肉类本身的定量。举例来说，试剂盒可包括已知量的猪肉、牛肉、羔羊肉、鸡肉、鸭肉和/或马肉中的每一个。或者或另外，校准可通过用至少一种与所关注肽具有相同氨基酸序列的同位素富集肽来加标样品而进行。因此，试剂盒可包括一或多种对应于seqidno.1-24中的每一个的同位素富集肽。根据一些实施例，不同跃迁可用于测量分析结果和设定基准，其取决于各种因素。因此，试剂盒可包含适用于实现样品与一或多种对照试剂之间的比较测量的不同跃迁值和/或建议设定。试剂盒可包括与动物特异性肽中的每一种的q1和q3跃迁值相关的信息。举例来说，在一个实施例中，试剂盒可包含本文中鉴定的seqidno:1-24的分离肽中的每一种，并且进一步可包含使用质谱仪定量肽中的至少一种的说明书。可以或应该用于进行分析的关于仪器设定的信息也可以包括于试剂盒中。关于样品制备、操作条件、体积量、温度设定等的信息可以包括于试剂盒中。根据一些实施例，不同跃迁可用于测量分析结果和设定基准，其取决于各种因素。因此，试剂盒可包含适用于进行样品与一或多种对照试剂之间的比较测量的不同跃迁值和/或建议设定。试剂盒可包括用于测量特定跃迁值对，例如q1/q3跃迁对，或一或多个不同跃迁对的值的说明书。试剂盒可以包装于含有一或多个试剂容器和适当说明书的气封箱中。电子媒体也可以包含于试剂盒内且可以储存和/或提供关于一或多个分析、测量值、跃迁对、操作说明书、用于进行操作的软件、其组合等的电子信息。根据一些方面，提供可以控制进程和/或进行本文所述的计算的软件。举例来说，软件可以向质谱仪提供指令以显示一或多个特定前体-产物离子对跃迁。软件可包括用于产生校准数据的模块，例如基于配备有试剂盒的校准标准物的质谱分析，和用于接收和分析质谱数据(例如lc-ms/ms数据)以鉴定以上肽和mrm跃迁中的一或多个的模组。在鉴定一或多种特异性针对以上动物中的一种的肽后，软件可利用校准数据来定量那些肽和相关肉种。在若干实施例中，可描述用于检测猪肉、牛肉、羔羊肉、鸡肉、鸭肉和马肉的系统。系统包含被配置成进行母离子-子离子跃迁监测的串联质谱仪；和与串联质谱仪连通的处理器，其向串联质谱仪发送指令以检测对于猪肉、牛肉、羔羊肉、鸡肉、鸭肉和/或马肉唯一的肽的存在。肽可以是肽seqidno1-24中的任一种且检测可以通过监测选自表1-6中提及的跃迁的一或多个母离子-子离子跃迁来进行。实例参考以下实例和所得数据可以更充分地理解申请人的传授内容。从本说明书和本文所公开的本发明传授内容的实践来考虑，本发明传授内容的其它实施例对所属领域的技术人员来说将为显而易见的。这些实例仅打算视为示范性的。图17显示根据本传授内容的一些实施例，制备肉类样品的例示性流程图。制备溶液提取缓冲液-将三(2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇，0.61g)、脲(36.04g)和硫脲(7.61g)溶解于hplc级水中且补足至100ml的体积以制备含有50mmtris、6m脲和1m硫脲的提取缓冲液。碳酸氢铵缓冲液-碳酸氢铵(158g)用hplc水补足至20ml的体积以制备100mm溶液。还原剂-三-(2-羧乙基)-膦(tcep)(15.02mg)用100mm碳酸氢铵缓冲液补足至0.6ml溶液以制备含有100mmtcep的溶液。半胱氨酸阻断试剂-甲烷-硫代磺酸甲酯(mmts)(10μl，>98％，约10.6m)通过添加大致520μl的100mm碳酸氢铵补足至530μl溶液以制备含有200mmmmts的溶液。胰蛋白酶溶液-冻干的胰蛋白酶粉末(1mg)添加至1.0ml的1mmhcl溶液且涡旋以溶解胰蛋白酶，以制备1μg/μl胰蛋白酶溶液。以每管50μl将胰蛋白酶溶液等分至0.6ml管中。系统适用性测试混合物-1nmol牛血清白蛋白(bsa)胰蛋白酶消化标准物溶解于2ml含5％乙腈、0.1％甲酸的水中以制备0.5pmol/μlbsa消化储备液。20μlbsa消化储备液与180μl含5％乙腈、0.1％甲酸的水混合以产生含有50fmol/μl的测试样品。肉类产品制备程序根据包含于表7中的组成制备测试标准样品。表7肉类样品称重称取10克/种的生肉或加工肉类产品(猪肉、牛肉、羔羊肉、鸡肉、鸭肉和马肉)，尽可能地避免包括脂肪。将肉切成小块(小于0.5cm×0.5cm×0.5cm)且将肉在-20℃或更低温度下冷冻1小时。将每一冷冻肉类样品研磨成细粉或糊浆，确保肉类充分均质化。将1g的每种研磨肉类样品(猪肉、牛肉、羔羊肉、鸡肉、鸭肉和未知样品)称重且转移至个别15ml聚丙烯离心管中。如果样品含有大量脂肪，那么可以进行任选的脂肪去除步骤，其涉及添加5ml己烷至每个管且使用3d-平台或涡流混合器充分混合15min。样品在4000×g下离心10分钟且接着丢弃5ml上清液且接着在不加热的情况下在平缓氮气流下干燥样品，或将样品置于吹风机开启的通风橱中直至完全干燥。肉类样品的均质化和蛋白质提取将5ml提取缓冲液添加至每个15ml离心管中的肉类样品。将均质机探针插入至蛋白质溶液中且肉类样品在冰浴中在约20,000rpm下均质化5分钟。探针均质机在每次均质化之后用肥皂水和去离子水清洁以避免交叉污染。为了制备基于根据表7的组成的标准样品，测量出每种组成所需的肉类匀浆溶液且置于新的2ml微量离心管中以形成混合物。接着混合匀浆。为了制备未知样品，将每种未知肉类匀浆直接分布至2ml微量离心管中。每种样品的肉类匀浆的总体积通常为3至6ml，意味着在一些情况下，每种样品需要超过一个2ml微量离心管。标准样品和等分的未知样品在14,000×g下离心15分钟。将澄清上清液(针对每一样品)转移至2ml微量离心管中。当组合上清液时，避免吸移顶部脂质泡沫层和管底部的残余物。将0.4ml总提取澄清上清液转移至2ml微量离心管中。其余的蛋白质提取物可储存在-20℃下以供将来使用。添加1.4ml100mm碳酸氢铵以将其稀释4.5倍且充分混合。蛋白质二硫键的还原以及半胱氨酸和其它巯基的阻断将25μl还原试剂添加至每个2ml微量离心管且充分混合。使混合物在60℃下培育60分钟。在室温下冷却样品。接着将25μl半胱氨酸阻断试剂添加至每一样品且充分混合且使其在室温下培育30分钟。蛋白质消化添加12μl胰蛋白酶(1μg/μl)至微量离心管且充分混合且接着在37℃下培育样品过夜，持续4小时或过夜(>12小时)。接着将样品冷却至室温且添加20μl甲酸至每一样品以停止消化。混合物经涡旋以充分混合。肽样品清理为了去除可能污染质谱仪的高浓度盐缓冲液，样品在14,000×g下离心15分钟。收集上清液且向消化样品(上清液)应用固相萃取(spe，60mg垫料尺寸)。详细spe程序列举如下：滤筒活化：1ml甲醇，(两次)滤筒平衡：1ml水，(两次)样品装载：将上清液以每秒1至2滴或更低的速度装载至滤筒上洗涤：1ml含0.1％甲酸的水，(两次)使柱在完成第2次洗涤之后静置3至5分钟。洗脱：0.5ml含50％乙腈、0.1％甲酸的水；接着为0.5ml含70％乙腈、0.1％甲酸的水(速度为每秒1至2滴)。在1.7ml微量离心管中收集洗脱液。用n2气体干燥器或速度真空干燥样品且接着通过添加200μl含5％乙腈、0.1％甲酸的水使样品复水。剧烈涡旋1分钟。将200μl的每一样品转移至3kdamwco过滤器单元中。在14,000×g下离心15分钟且收集滤液。将滤液转移至250μlhplc小瓶中且注入10μl的每一样品以用于lc-ms/ms分析。对于标准样品，需要注入每一样品3次。色谱使用耦接至菲罗门肯泰斯(phenomenexkinetex)c18lc柱(2.6μm，100×4.6mm)的岛津(shimadzu)uplc系统进行色谱。移动相a：含0.1％甲酸的水，移动相b：含0.1％甲酸的乙腈。梯度为2％至90％经16.3分钟。0.500ml/min的流动速率，其它hplc参数包括于下表8中：表8初始设定模块泵b浓度2.0％泵b曲线0最小压力0psi最大压力6000psi自动取样器使用自动取样器是冲洗体积1000μl针行程52mm冲洗速度35μl/s取样速度2.0μl/s吹扫时间25.0min冲洗浸渍时间5s冲洗模式在抽吸之前和之后启用冷却器是冷却器温度10℃控制小瓶针行程52mm烘箱启用烘箱是烘箱温度40℃质谱分析法在装备有呈正电喷雾电离模式的离子源的sciex4500lc/ms/ms系统上分析样品。结果图1为呈lc时间标度的纯肉类样品的复杂性质的描述。存在的每个点表示肽前体在给定时间点产生的质谱。图2a描绘使用本文所述的传授内容，5种类型的肉类(猪肉、牛肉、羔羊肉、鸡肉和鸭肉)的蛋白质消化混合物的提取离子色谱图(xic)。图3显示在含有等量的牛肉、羔羊肉、鸡肉和鸭肉的肉类混合物中使用约453/581的母离子-子离子跃迁，对于具有seqidno:1的肽，根据本传授内容的各种实施例获得的猪肉在各种浓度水平下的提取离子色谱图。图4显示在含有等量的猪肉、羔羊肉、鸡肉和鸭肉的肉类混合物中使用约462/722的母离子-子离子跃迁，对于具有seqidno:5的肽，根据本传授内容的各种实施例获得的牛肉在各种浓度水平下的提取离子色谱图。图5显示在含有等量的猪肉、牛肉、鸡肉和鸭肉的肉类混合物中使用约718/1037的母离子-子离子跃迁，对于具有seqidno:9的肽，根据本传授内容的各种实施例获得的羔羊肉在各种浓度水平下的提取离子色谱图。图6显示在含有等量的猪肉、牛肉、羔羊肉和鸭肉的肉类混合物中使用约482/213的母离子-子离子跃迁，对于具有seqidno:13的肽，根据本传授内容的各种实施例获得的鸡肉在各种浓度水平下的提取离子色谱图。图7显示在含有等量的猪肉、牛肉、羔羊肉和鸡肉的肉类混合物中使用约677/1122的母离子-子离子跃迁，对于具有seqidno:17的肽，根据本传授内容的各种实施例获得的鸭肉在各种浓度水平下的提取离子色谱图。图8显示在含有等量的猪肉、牛肉、羔羊肉和鸡肉的肉类混合物中使用约508/902的母离子-子离子跃迁，对于具有seqidno:21的肽，根据本传授内容的各种实施例获得的马肉在各种浓度水平下的提取离子色谱图。图9-14显示分别从猪肉、牛肉、羔羊肉、鸡肉、鸭肉和马肉中的每一个产生的校准曲线，其获自图3至8中描绘的色谱图，显示获得的峰面积与浓度成比例，指示本文所述的传授内容可以定量方式用于检测肉类污染。实例2购买来自获自快餐店的经过烹饪的汉堡的肉类且根据本传授内容进行分析。图15描绘使用具有确认牛肉存在的seqidno:5(左上方的两个)、seqidno:6(右上方的两个)、seqidno:7(左下方的两个)和seqidno:8(右下方的两个)的肽的牛肉的提取离子色谱图。图16描绘猪肉、羔羊肉、鸡肉和鸭肉的提取离子色谱图，指示相比于背景，汉堡样品中不存在其它肉类的污染。样品制备的替代方法现在描述在分析之前进行肉类样品制备的其它方法。肉类样品使用珠粒均质机进行均质化和蛋白质提取在根据先前描述的方法对肉类样品进行称重、冷冻和研磨之后，将1g的每种研磨肉类产品置于20ml离心管中且添加5个不锈钢滚珠(3mm)。将5ml提取缓冲液添加至每一肉类样品。将样品管置于20ml管接合器上且紧固。管接着在70hz的频率下均质化1分钟。样品管接着置于冰浴中1分钟。使用具有大口径的吸管端(例如5ml吸管端)，将1.8ml肉类匀浆样品等分至标记的2ml微量离心管中。肉类匀浆的总体积通常为3-6ml，且每一样品通常需要超过一个2ml微量离心管。为了制备标准样品，基于前述步骤在新的2ml微量离心管中混合匀浆。未知样品不需要在此步骤中混合。将混合的标准样品在14,000×g下离心15分钟。将澄清上清液(针对每一样品)转移至2ml微量离心管中。转移0.4ml澄清上清液(收集至2ml微量离心管中(针对每一样品)。其余的蛋白质提取物可储存在-20℃下以供将来使用。添加1.4ml的100mm碳酸氢铵以稀释4.5倍。将管上下旋转以充分混合。制备标准和未知样品以如先前所描述地筛选。使用液氮进行均质化和蛋白质提取在根据先前描述的方法对肉类样品进行称重、冷冻和研磨之后，将1g的每种研磨肉类产品置于陶瓷研钵中。添加20ml液氮。小心地用研杵将肉类研磨为细粉。如果液氮停止沸腾，那么再添加20ml液氮。将肉粉转移至15ml离心管中。将5ml提取缓冲液添加至每一肉类样品。摇动混合物5分钟。使用具有大口径的吸管端(例如5ml吸管端)，将1.8ml肉类匀浆样品等分至标记的2ml微量离心管中。肉类匀浆的总体积通常为3-6ml，且每一样品通常需要超过一个2ml微量离心管。为了制备标准样品，基于前述步骤在新的2ml微量离心管中混合匀浆。未知样品不需要在此步骤中混合。将混合的标准样品在14,000×g下离心15分钟。将澄清上清液(针对每一样品)转移至2ml微量离心管中。将0.4ml澄清上清液转移至2ml微量离心管中(针对每一样品)。其余的蛋白质提取物可储存在-20℃下以供将来使用。添加1.4ml的100mm碳酸氢铵以稀释4.5倍。将管上下旋转以充分混合。制备标准和未知样品以如先前所描述地筛选。虽然结合各种实施例描述本传授内容，但是并不打算将本传授内容限制于此类实施例。相反地，如所属领域的技术人员应了解，本传授内容涵盖各种替代方案、修改和等效物。此外，在描述各种实施例中，本说明书可能将方法和/或过程呈现为特定顺序的步骤。然而，在方法或过程不依赖于本文中所阐述的步骤的特定次序的程度上，方法或过程不应限于所描述的步骤的特定顺序。如所属领域的一般技术人员将了解，步骤的其它序列可为可能的。因此，在说明书中阐述的步骤的特定次序不应解释为对权利要求的限制。另外，针对方法和/或过程的权利要求书不应限于以书写的次序执行其步骤，并且所属领域的技术人员可以易于了解的是顺序可以变化并且仍保持在各种实施例的精神和范围内。序列表<110>dh科技发展私人贸易有限公司<120>用于生肉和加工肉类产品的肉种鉴定的lc/ms/ms分析<130>abs-0325pct<150>us62/384925<151>2016-09-08<160>24<170>patentinversion3.5<210>1<211>16<212>prt<213>野猪<400>1serleutyrserseralagluasngluproprovalproleuvalarg151015<210>2<211>9<212>prt<213>野猪<400>2glyglyproleuthralaalatyrarg15<210>3<211>11<212>prt<213>野猪<400>3seralaleualahisalavalglnserserarg1510<210>4<211>9<212>prt<213>野猪<400>4thrleualapheleuphealagluarg15<210>5<211>10<212>prt<213>温带牛<400>5leuvalasngluleuthrgluphealalys1510<210>6<211>8<212>prt<213>温带牛<400>6alagluphevalgluvalthrlys15<210>7<211>10<212>prt<213>温带牛<400>7thrleugluaspglnvalasngluleulys1510<210>8<211>16<212>prt<213>温带牛<400>8valgluleuproserleuileprovalileleuglulysproalalys151015<210>9<211>15<212>prt<213>绵羊<400>9valglyglyasnalaglyalatyrglyalaglualaleugluarg151015<210>10<211>16<212>prt<213>绵羊<400>10hishisglyasngluphethrprovalleuglnalaasppheglnlys151015<210>11<211>13<212>prt<213>绵羊<400>11leuleuglyserleuaspileasphisasnglntyrarg1510<210>12<211>12<212>prt<213>绵羊<400>12leuthrglyglyvalmethistyrglyasnleulys1510<210>13<211>14<212>prt<213>原鸡<400>13leuservalglualaleuasnserleugluglygluphelys1510<210>14<211>8<212>prt<213>原鸡<400>14valleuthrprogluleutyrlys15<210>15<211>11<212>prt<213>原鸡<400>15metthrgluglugluvalglugluleumetlys1510<210>16<211>14<212>prt<213>原鸡<400>16ilevalglusermetglnserthrleuaspalagluvalarg1510<210>17<211>11<212>prt<213>绿头鸭<400>17metthrgluglugluvalaspgluleumetlys1510<210>18<211>21<212>prt<213>绿头鸭<400>18thrleualaleuleuphealaasntyrglyglyalaaspalagluala151015glyglyglyglylys20<210>19<211>21<212>prt<213>绿头鸭<400>19valalaalaalaleuvalglualavalasnhisileaspaspileala151015glyalaleuserlys20<210>20<211>9<212>prt<213>绿头鸭<400>20metpheleualatyrproglnthrlys15<210>21<211>9<212>prt<213>家马<400>21leuvalasnaspleuthrglyglnarg15<210>22<211>19<212>prt<213>家马<400>22thrleualaleuleupheserglyproalaseralaaspalagluala151015glyglylys<210>23<211>14<212>prt<213>家马<400>23valvalgluthrmetglnthrmetleuaspalagluilearg1510<210>24<211>10<212>prt<213>家马<400>24gluphegluileglyasnleuglnserlys1510当前第1页12