免疫学测定方法和测定试剂与流程

本发明涉及一种免疫学测定方法，以及免疫学测定试剂，所述免疫学测定方法在被测定物质的免疫学方法的测定中，能够抑制异嗜性抗体和类风湿因子等干扰物质(以下称作干扰物质)的干扰作用，并准确测定抗原或抗体浓度。

背景技术：

利用抗原和抗体间的抗原抗体反应的免疫学测定方法，可以简便而迅速地测定生物体中的蛋白质等免疫活性物质，因此近年来被广泛用于各种疾病的诊断。作为这种免疫学测定方法，有放射免疫测定法(ria)、酶免疫测定法(eia)、荧光免疫测定法(fia)、免疫比浊法(tia)、乳胶凝集法(la)、免疫层析法等各种方法，它们已得到实用化。

但是，在作为免疫学测定方法的测定对象的样本中，有时会含有对抗原抗体反应产生干扰的干扰物质等。当这些抗原抗体反应中含有干扰物质时，会对测定产生影响，故无法准确测定；尤其在临床检查领域，将无法进行准确的诊断，因此，到目前为止已提出有减轻或抑制干扰物质影响的方法。

例如，为了解决混杂有类风湿因子而导致的干扰作用的问题，已提出有预先用与类风湿因子的结合位点结合的动物来源抗体对样本进行预处理，以降低类风湿因子干扰作用的免疫学测定方法(专利文献1)，以及通过将反应液的ph值保持在4.0～6.0来抑制类风湿因子干扰作用的免疫学测定方法(专利文献2)等。

另外，为了减轻或抑制干扰物质的干扰作用，已提出有使用通过酶反应除去了用于免疫学测定的抗体的fc部分的f(ab’)2的方法(专利文献3)。但是，这种免疫学测定方法只能在测定抗原时使用，而且需要酶反应和纯化等复杂步骤来制作f(ab’)2，存在成本上升和生产批次间差异的问题。

另外，还有人提出了利用聚合或凝集的抗体分子来抑制异嗜性抗体的干扰作用的方法(专利文献4)，但是，完全抑制异嗜性抗体的干扰作用需要大量的聚合或凝集的抗体分子，存在成本上升的问题。

这些文献记载的抑制干扰物质的干扰作用的方法虽然可以确实改善干扰物质的影响，但如果在待测定的试样中含有高浓度的干扰物质，则其干扰作用的抑制效果会不足。

已提出有利用亚硫酸盐的方法，该方法即使在待测定的试样中含有高浓度的干扰物质，也能抑制干扰物质的干扰作用(专利文献5)。亚硫酸盐具有以下优点：价格非常低廉，即使以能够充分抑制高浓度干扰物质的影响的浓度使用，也不会增加成本，而且不易影响到抗原抗体反应。

但是，由于亚硫酸盐会被测定试剂中的溶解氧或空气中的氧气逐渐氧化为硫酸盐，因此它对干扰物质的干扰作用的抑制效果会随时间推移而下降。即存在以下问题：为了在自动分析装置等中使用，亚硫酸盐的浓度会因在开封状态下保存在试剂库等中而随时间推移地减少，从而无法充分抑制干扰物质的影响。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开平7-012818号公报

专利文献2：日本特开平8-146000号公报

专利文献3：日本特开昭54-119292号公报

专利文献4：日本特开平4-221762号公报

专利文献5：日本特开2001-074739号公报

技术实现要素：

发明所要解决的问题

本发明人发现，通过将含有亚硫酸盐的测定试剂的ph值设为7.0以下，能够改善亚硫酸盐在空气气氛中的稳定性，长期维持对干扰物质的干扰作用的抑制效果，并且能够充分抑制浓度非常高的异嗜性抗体的干扰作用。

但是，通过将含有亚硫酸盐的测定试剂的ph值设为7.0以下，当测定溶血的试样时会受到血红蛋白的影响，导致无法准确测定溶血试样的问题。

尤其是在基于免疫凝集反应法的免疫比浊法(tia法)和乳胶凝集法(lia法)等不进行b/f分离(结合态/游离态分离)的免疫学测定方法中，血红蛋白的影响是个大问题。

因此，本发明着眼于上述现状，旨在提供一种免疫学测定方法，以及用于该免疫学测定方法的测定试剂，所述免疫学测定方法即使在测定的试样中含有高浓度的干扰物质的情况下也能够长期充分地抑制其干扰作用，并且不受血红蛋白的影响而能够准确进行测定。

解决问题的技术方案

本发明人为了解决上述课题而进行了潜心研究，结果发现，将含有亚硫酸盐的测定试剂的ph值设为7.4以下，进一步使其含有抗坏血酸或其盐、硫醇化合物等还原性物质，由此可以得到对干扰物质的长期抑制效果，能够抑制血红蛋白的影响，从而完成本发明。

即，本发明包括以下内容：

(1)一种免疫学测定方法，其是使用免疫学测定试剂，在亚硫酸盐存在下，进行抗原抗体反应的免疫学测定方法，其特征在于，免疫学测定试剂含有亚硫酸盐和还原性物质。

(2)根据(1)所述的免疫学测定方法，其中，所述还原性物质的浓度为1mm至300mm。

(3)根据(1)或(2)所述的免疫学测定方法，其中，所述亚硫酸盐为50mm至600mm。

(4)根据(1)～(3)中任一项所述的免疫学测定方法，其中，含有所述亚硫酸盐和所述还原性物质的免疫学测定试剂的ph值为5.6至7.4的范围。

(5)根据(1)～(4)中任一项所述的免疫学测定方法，其中，所述还原性物质为选自抗坏血酸或其盐，或者硫醇化合物中的1种以上的还原性物质。

(6)根据(5)所述的免疫学测定方法，其中，所述硫醇化合物为选自以下物质中的1种以上的硫醇化合物：2-巯基乙胺、2-二甲氨基乙硫醇、2-巯基乙醇、3-巯基丙醇、二硫苏糖醇、半胱氨酸、n-乙酰半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、苯硫酚。

(7)根据(1)～(6)中任一项所述的免疫学测定方法，其对测定对象物进行定量或定性测定，所述免疫学测定方法包括以下步骤：将第一试剂和第二试剂混合，其中，所述第一试剂包含所述免疫学测定试剂；所述第二试剂包含与测定对象物反应的抗体或抗原，或者包含承载有与测定对象物反应的抗体或抗原的载体。

(8)根据(1)～(7)中任一项所述的免疫学测定方法，其中，所述免疫学测定方法为乳胶凝集法。

(9)一种免疫学测定试剂，其是用于免疫学测定方法的试剂，所述免疫学测定方法在亚硫酸盐存在下进行抗原抗体反应，其特征在于，所述试剂含有亚硫酸盐和还原性物质。

(10)根据(9)所述的免疫学测定试剂，其中，所述还原性物质的浓度为1mm至300mm。

(11)根据(9)或(10)所述的免疫学测定试剂，其中，所述亚硫酸盐为50mm至600mm。

(12)根据(9)～(11)中任一项所述的免疫学测定试剂，其中，含有所述亚硫酸盐和所述还原性物质的试剂的ph值为5.6至7.4的范围。

(13)根据(9)～(12)中任一项所述的免疫学测定试剂，其中，所述还原性物质为选自抗坏血酸或其盐，或者硫醇化合物中的1种以上的还原性物质。

(14)根据(13)所述的免疫学测定试剂，其中，所述硫醇化合物为选自以下物质中的1种以上的硫醇化合物：2-巯基乙胺、2-二甲氨基乙硫醇、2-巯基乙醇、3-巯基丙醇、二硫苏糖醇、半胱氨酸、n-乙酰半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、苯硫酚。

(15)根据(9)～(14)中任一项所述的免疫学测定试剂，其中，免疫学测定方法为乳胶凝集法。

(16)一种免疫学测定试剂盒，其含有第一试剂和第二试剂，其中，所述第一试剂包含(9)～(15)中任一项所述的免疫学测定试剂；所述第二试剂包含与测定对象物反应的抗体或抗原，或者包含承载有与测定对象物反应的抗体或抗原的载体。

本说明书包含了作为本申请的优先权基础的日本专利申请号2016-205056号的公开内容。

发明效果

本发明提供的免疫学测定试剂，稳定性优异，通过使含有亚硫酸盐且ph值为7.4以下的免疫学测定试剂中再含有抗坏血酸或其盐，或者硫醇化合物等还原性物质，即使在测定对象试样中含有高浓度的对抗原抗体反应有干扰的物质，也能够不受干扰物质影响而进行免疫学测定。另外，本发明还提供一种稳定性优异的免疫学测定试剂，即使测定对象试样中含有血红蛋白，也能够以良好精度进行免疫学测定。

而且，对于通过该免疫学测定而得到的结果，也可期待为高可靠性。

附图说明

图1表示第一试剂的ph值为7.4时，血红蛋白吸收光谱随时间的变化。

图2表示第一试剂的ph值为6.7时，血红蛋白吸收光谱随时间的变化。

图3表示第一试剂的ph值为6.7且加入了10mm抗坏血酸钠时，血红蛋白吸收光谱随时间的变化。

图4表示第一试剂的ph值为6.7且加入了10mm的2-巯基乙胺时，血红蛋白吸收光谱随时间的变化。

图5表示第一试剂的ph值为6.7且加入了10mm的2-二甲氨基乙硫醇时，血红蛋白吸收光谱随时间的变化。

图6表示第一试剂的ph值为6.7且加入了5mm的二硫苏糖醇时，血红蛋白吸收光谱随时间的变化。

图7表示第一试剂的ph值为6.7且加入了10mm的2-巯基乙醇时，血红蛋白吸收光谱随时间的变化。

图8表示第一试剂的ph值为6.7且加入了10mm的半胱氨酸时，血红蛋白吸收光谱随时间的变化。

图9表示第一试剂的ph值为6.7且加入了10mm的还原型谷胱甘肽时，血红蛋白吸收光谱随时间的变化。

图10表示第一试剂的ph值为6.7且加入10mm抗坏血酸钠，并除去亚硫酸钠时，血红蛋白吸收光谱随时间的变化。

图11表示第一试剂的ph值为6.7且加入了0.01mm抗坏血酸钠时，血红蛋白吸收光谱随时间的变化。

图12表示第一试剂的ph值为6.7且加入了0.1mm抗坏血酸钠时，血红蛋白吸收光谱随时间的变化。

图13表示第一试剂的ph值为6.7且加入了0.1mm的2-巯基乙胺时，血红蛋白吸收光谱随时间的变化。

图14表示第一试剂的ph值为6.7且加入了1mm的2-巯基乙胺时，血红蛋白吸收光谱随时间的变化。

具体实施方式

下面，对本发明的优选实施方式进行说明。

本发明的一个实施方式是一种免疫学测定方法，其是在亚硫酸盐存在下，使用免疫学测定试剂，进行抗原抗体反应的免疫学测定方法，所述免疫学测定试剂含有亚硫酸盐和还原性物质。

本发明中，“还原性物质”是指容易释放氢离子(质子)的物质。

另外，本发明中，“免疫学测定方法”是使用与作为测定对象的测定对象物特异性结合的物质(例如抗体或抗原)，判定(检测、定性测定)测定对象物是否存在，以及当测定对象物存在时测定(定量)其存在量的方法。例如可举出：基于夹心法、竞争法原理的ria法和elisa法、基于免疫凝集反应法的免疫比浊法(tia法)和乳胶凝集法(lia法)等。

本发明的“免疫学测定试剂”是用于进行抗原抗体反应的免疫学测定方法的试剂，含有亚硫酸盐和还原性物质。另外，本发明的免疫学测定试剂还可以用作含有测定对象物质的测定试样的预处理试剂。

本发明的“预处理试剂”是在利用免疫学测定方法测定含有测定对象物质的测定试样之前，用于处理测定试样的试剂，其含有亚硫酸盐和还原性物质。用预处理试剂处理的测定试样，可以直接作为公知的免疫学测定方法的测定试样。

本发明使用的亚硫酸盐可以从公知的亚硫酸盐中适当选择。作为亚硫酸盐，例如可举出：亚硫酸钠、亚硫酸钾、亚硫酸钙、亚硫酸铵、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢铵等。

本发明中，当免疫学测定试剂或预处理试剂中含有亚硫酸盐时，免疫学测定试剂或预处理试剂中的亚硫酸盐浓度为50mm以上，优选50mm至600mm，更优选100～600mm，进一步优选250mm至500mm。如果亚硫酸盐的浓度低于50mm，则难以充分抑制干扰物质对免疫反应的影响；即使超过600mm，也无法有效抑制干扰物质的影响，还会因溶液粘度上升而对测定产生不利影响。

另外，本发明使用的还原性物质也可以从公知的还原性物质中适当选择。作为还原性物质，例如可举出抗坏血酸或其盐、硫醇化合物等。

抗坏血酸或其盐可以从公知物质中适当选择，例如可举出：抗坏血酸、抗坏血酸钠、抗坏血酸钾、抗坏血酸钙等。

硫醇化合物也可以从公知物质中适当选择，例如可举出：2-巯基乙胺、2-二甲氨基乙硫醇、2-巯基乙醇、3-巯基丙醇、二硫苏糖醇、半胱氨酸、n-乙酰半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、苯硫酚等。

本发明中，当免疫学测定试剂或预处理试剂中含有还原性物质时，免疫学测定试剂或预处理试剂中的还原性物质浓度为1mm以上，优选1～300mm，更优选1～100mm，进一步优选1～50mm。还原性物质的浓度为1mm以上，可以有效避免血红蛋白的影响，但如果超过300mm，则会对测定造成不利影响，可能无法进行准确测定。

本发明含有亚硫酸盐和还原性物质的免疫学测定试剂或预处理试剂的ph值优选为7.4以下，更优选为ph5.6至ph7.4的范围，进一步优选为ph6.7至ph6.9的范围。当ph值低于5.6时，容易发生蛋白质等变性，容易影响准确测定；当ph值超过7.4时，则对干扰物质影响的抑制效果容易随时间推移而下降。

本发明中，可以根据需要加入公知的蛋白质保护剂来提高测定对象物质的稳定性。作为这种蛋白质保护剂，可以举出：白蛋白和明胶等蛋白质和合成聚合物材料、表面活性剂等。

利用本发明含有亚硫酸盐和还原性物质的免疫学测定试剂或预处理试剂抑制干扰物质影响的试样，可以直接用公知的免疫学测定方法进行测定。作为免疫学测定方法，例如可举出：基于夹心法、竞争法原理的ria法和elisa法、基于免疫凝集反应法的免疫比浊法(tia法)和乳胶凝集法(lia法)等。

在这些免疫学测定方法中，尤其优选免疫比浊法和乳胶凝集法，其测定原理为：让测定试样中的被测定物质即抗原(或抗体)与测定试剂中的抗体(或抗原)反应，检测生成的免疫凝集物。

本发明的免疫学测定试剂可以用于免疫比浊法和乳胶凝集法，可由第一试剂和第二试剂这两种试剂组成，其中，第一试剂含有缓冲液，第二试剂使缓冲液中含有抗体或抗原，或者承载抗体或抗原的载体(优选乳胶粒子)。另外，这两种试剂也可以作为免疫学测定试剂盒来提供。

作为可以用于免疫比浊法和乳胶凝集法的免疫学测定试剂的缓冲液，只要是能够保持ph值恒定就没有特别限制，且可以从公知的缓冲液中适当选择。例如可举出：磷酸缓冲液、tris缓冲液、good's缓冲液等。

本发明含有亚硫酸盐和还原性物质的免疫学测定试剂，也可以作为由上述两种试剂组成的免疫比浊法和乳胶凝集法等免疫学测定方法的第一试剂。即，可以在使用本发明的干扰物质影响抑制方法的第一试剂中混合测定试样，然后在该混合液中混合含有抗体(或抗原)或承载抗体(或抗原)的胶乳粒子等的第二试剂进行测定。

另外，也可以在将使用本发明的干扰物质影响抑制方法的处理试剂和测定试样混合后，将该混合液作为elisa法和乳胶凝集法等免疫学测定方法的测定试样进行测定。

本发明中，作为载体所承载的抗体或抗原没有特别限制，可以从公知的抗体或抗原中适当选择。作为载体所承载的抗体或抗原，例如可举出：针对c反应蛋白(crp)、转铁蛋白等血浆蛋白的抗体；针对促甲状腺激素(tsh)、甲状腺素、胰岛素、人胎盘催乳素等激素的抗体；针对癌胚抗原(cea)、β2-微球蛋白、α-甲胎蛋白(afp)等肿瘤相关物质的抗体；针对hbs抗原、hbe抗原等病毒性肝炎抗原的抗体以及针对hbs抗体、hbe抗体等病毒性肝炎抗体的抗原；针对疱疹、麻疹、风疹等病毒、各种生物体成分的抗体或抗原；针对苯巴比妥、对乙酰氨基酚、环孢菌素等各种药物的抗体等。

本发明中，作为承载抗体或抗原的载体，没有特别限制，可以从公知的载体中适当选择。作为承载抗体或抗原的载体，可举出：聚苯乙烯板、聚苯乙烯珠、乳胶粒子、金属胶体粒子、二氧化硅胶体粒子等。

作为本发明可以使用的上述抗体，其来源的动物种类没有特别限制，例如可举出来自兔子、山羊、小鼠、大鼠、马、绵羊等动物的抗体，也可以使用从对测定对象物免疫的动物血清中得到的多克隆抗体、将对测定对象物免疫的动物脾脏与骨髓瘤细胞进行细胞融合而得到的单克隆抗体中的任一种抗体。

本发明中，测定试样没有特别限制，例如可举出：血液、血清、血浆、尿液、淋巴液、穿刺液、髓液、汗液、唾液、胃液、肺清洗液、粪便等。其中，特别优选为血清、血浆。通过本发明，当血清、血浆等测定试样发生溶血时，可以避免血红蛋白的影响而进行准确的测定。

另外，本发明中，测定对象物质也没有特别限制，例如可举出：c反应蛋白(crp)、转铁蛋白等血浆蛋白；促甲状腺激素(tsh)、甲状腺素、胰岛素、人胎盘催乳素等激素；癌胚抗原(cea)、β2-微球蛋白、α-甲胎蛋白(afp)等肿瘤相关物质；hbs抗原、hbe抗原等病毒性肝炎抗原以及hbs抗体、hbe抗体等病毒性肝炎抗体；针对疱疹、麻疹、风疹等病毒、各种生物体成分的抗体或抗原；苯巴比妥、对乙酰氨基酚、环孢菌素等各种药物等。

[实施例]

下面基于实施例对本发明进行具体说明，但本发明并不受这些实施例限制。

实施例1亚硫酸盐浓度对干扰反应抑制效果的影响

通过加入亚硫酸钠，对亚硫酸盐浓度对干扰反应的抑制的影响进行了评价。另外，还在促进亚硫酸盐氧化的条件(填充试剂容器的一半，在4℃振荡3周)下保存并评价稳定性。

(1)试剂

制备50mm含有0mm、50mm、100mm、250mm、350mm、500mm或600mm的亚硫酸钠的hepes缓冲液(ph7.4)，作为第一试剂。然后，将制备的第一试剂填充到试剂容器的一半，在4℃振荡3周，促进空气中的氧对亚硫酸盐的氧化。

另外，制备50mm含有承载抗kl-6抗体的聚苯乙烯乳胶液的hepes缓冲液(ph7.4)，作为第二试剂。

上述承载抗kl-6的乳胶液，可以利用公知的方法制备。即通过如下方式制备：将抗kl-6抗体和聚苯乙烯乳胶混合，在聚苯乙烯乳胶表面承载抗kl-6抗体。

(2)测定试样

通过在混合血清中加入干扰物检查rfplus(干渉チェックrfプラス)(希森美康(sysmex)株式会社)，使类风湿因子(rf)浓度为0、100、200、300、400、500或1000iu/ml，来制备rf试样。

(3)评价方法

在2.0μl的上述rf试样中混合120μl第一试剂，在37℃孵育5分钟后，向该混合液中混合40μl第二试剂，在37℃进行反应，测定混合第二试剂后约5分钟的660nm处的吸光度变化。另外，一系列的测定使用日立7180型自动分析设备(株式会社日立高新技术)进行。

为了定量kl-6的浓度，根据测定kl-6的标准物质而得到的标准曲线，计算血清样本中的kl-6浓度。将制备之后的结果示于表1，将促进亚硫酸盐的氧化的情况的结果示于表2。

[表1]

＊：将未添加rf(oiu/ml)作为100％时的值

[表2]

＊:将未添加rf(oiu/ml)作为100％时的值

由表1可知，在50mm以上的亚硫酸盐浓度下观察到rf的干扰反应的抑制效果，即使在50mm的亚硫酸盐浓度下，也可以将rf的干扰反应抑制到未添加亚硫酸盐时(0mm)的约1/2。另外可知，干扰反应的抑制效果随着亚硫酸盐浓度而提升，在250mm至500mm的亚硫酸盐浓度下抑制效果达到最高，在600mm的亚硫酸盐浓度下会下降。亚硫酸盐浓度优选为50mm以上，更优选为100mm至600mm，最优选为250～500mm。

另外，由表1和表2可知，当亚硫酸盐浓度为50mm时，亚硫酸盐的氧化会导致干扰反应的抑制效果下降。亚硫酸盐的氧化对干扰反应抑制效果的影响随着亚硫酸盐浓度而减轻，在250mm至500mm的亚硫酸盐浓度下影响最小，稳定性提高，但当亚硫酸浓度为600mm时，亚硫酸盐的氧化会导致干扰反应的抑制效果下降。

实施例2ph值对亚硫酸盐抑制干扰反应的影响

将亚硫酸钠设为250mm，评价ph值对抑制干扰物质的干扰反应的影响。

(1)试剂

制备含有250mm亚硫酸钠的50mmpipes缓冲液(ph值为6.4或6.8)或50mmhepes缓冲液(ph值为7.4、7.8或8.2)，作为第一试剂。第二试剂与实施例1相同。

(2)测定试样

通过在混合血清中加入干扰物检查rfplus(希森美康(sysmex)株式会社)，使类风湿因子浓度变为0、100、200、300、400或500iu/ml，来制备rf试样，除了rf试样以外，也将正常样本(异嗜性抗体和rf阴性的人血清试样)和异常样本(异嗜性抗体和rf阳性的人血清试样)作为测定试样。

(3)评价方法

与实施例1同样地测定试样。将rf试样的结果示于表3，将人血清试样的结果示于表4。

[表3]

＊:将未添加rf(oiu/ml)作为100％时的值

[表4]

＊:将ph6.8作为100％时的值

由表3可知，当ph值为7.8以上时，ph值越高，亚硫酸盐对rf干扰反应的抑制效果越明显下降，测定值的正误差扩大。但是，当ph值为7.4以下时，亚硫酸盐对rf干扰反应的抑制效果则未见较大差异。

另外，由表4可知，在正常样本中，几乎观察不到ph值对亚硫酸盐抑制干扰反应的影响。而在存在干扰物质的异常样本中，ph值越高，亚硫酸盐对干扰反应的抑制效果越明显下降，测定值越升高，但ph值为6.4和6.8时的测定值变动小，干扰反应得到有效抑制。

实施例3含有亚硫酸盐的试剂的ph值对血红蛋白影响的影响

将亚硫酸钠设为250mm，评价血红蛋白(hb)的影响，以及ph值对抑制类风湿因子的干扰反应的影响。

(1)试剂

制备含有250mm亚硫酸钠的50mmpipes缓冲液(ph6.7)或50mmhepes缓冲液(ph7.4)，作为第一试剂。第二试剂与实施例1相同。

(2)测定试样

通过在混合血清中加入干扰物检查rfplus(希森美康(sysmex)株式会社)，使类风湿因子浓度为0、100、200、300、400、500或1000iu/ml，来制备rf试样。另外，通过在混合血清中加入干扰物检查aplus溶血血红蛋白(希森美康(sysmex)株式会社)，使血红蛋白浓度为0、100、200、300、400、500、600、800或1000mg/dl，来制备hb试样。

(3)评价方法

与实施例1同样地测定试样。将结果示于表5。

[表5]

＊：将未添加hb(0mg/dl)或未添加

rf(oiu/ml)作为100％时的值

由表5可知，当含有亚硫酸盐的试剂的ph值为7.4时，观察到rf引起的干扰反应，而当ph值为6.7时，rf引起的干扰反应则得到了抑制。与此相对，当ph值为7.4时，未观察到血红蛋白对测定值的影响，而当ph值为6.7时，则观察到随着血红蛋白浓度的正向影响。

实施例4血红蛋白影响的原因的确认

将亚硫酸钠浓度设为250mm，评价ph值对血红蛋白吸收光谱的影响。

(1)试剂

第一试剂与实施例3相同。制备从实施例1的组成中除去承载抗kl-6抗体的乳胶的试剂，作为第二试剂。

(2)测定试样

通过在混合血清中加入干扰物检查aplus溶血血红蛋白(希森美康(sysmex)株式会社)，使血红蛋白浓度为500mg/dl，来制备hb试样。

(3)评价方法

在10μl的hb试样中加入600μl第一试剂，在该混合物中加入第二试剂后，使用shimadzuuv-2600(株式会社岛津制作所)在800nm至400nm波长下测定吸收光谱。测定完吸收光谱后，在37℃加温混合液，在加温开始5分钟后，在800nm至400nm波长下测定吸收光谱，然后每隔5分钟在800nm至400nm波长下测定吸收光谱。将结果示于图1和图2。

由图1可知，含有亚硫酸盐的第一试剂的ph值为7.4时，未观察到血红蛋白吸收光谱随时间的变化。而由图2可知，含有亚硫酸盐的第一试剂的ph值为6.7时，血红蛋白吸收光谱随时间而变化。这表示，血红蛋白吸收光谱随时间的变化，会影响免疫比浊法和乳胶凝集法等不进行b/f分离的免疫学测定方法的测定值，对测定值产生影响的原因是血红蛋白。

实施例5还原性物质对血红蛋白影响的效果

将亚硫酸钠设为250mm，ph值设为6.7，评价还原性物质抗坏血酸钠(aa)、2-巯基乙胺(2-mea)、2-二甲氨基乙硫醇(2-daet)，以及二硫苏糖醇(dtt)的效果。

(1)试剂

制备含有250mm亚硫酸钠和10mm还原性物质(dtt为5mm)的50mmpipes缓冲液(ph6.7)，作为第一试剂。另外，也制备不添加还原性物质的试剂，作为比较例。此外，对于抗坏血酸钠和2-巯基乙胺，还制备了除去亚硫酸钠的试剂。

第二试剂与实施例1相同。

(2)测定试样

与实施例3同样地制备。

(3)评价方法

与实施例1同样地测定试样。将结果示于表6和表7。

[表6]

＊：将未添加rf(oiu/ml)作为100％时的值

[表7]

＊:将未添加hb(omg/dl)作为100％时的值

由表6可知，即使在含有亚硫酸钠的第一试剂中加入抗坏血酸钠、2-巯基乙胺、2-二甲氨基乙硫醇或二硫苏糖醇，也和比较例一样，未观察到rf引起的干扰反应。与此相对，当不含有亚硫酸钠，单独使用抗坏血酸钠或2-巯基乙胺时，则会观察到rf引起的干扰反应。

由表7可知，比较例明显受到了血红蛋白的影响，而通过加入抗坏血酸钠、2-巯基乙胺、2-二甲氨基乙硫醇或二硫苏糖醇等还原性物质，血红蛋白的影响得到了抑制。单独加入抗坏血酸钠时，观察到血红蛋白的影响，但出人意料的是，通过与同样在单独加入时观察到血红蛋白影响的亚硫酸盐(比较例)相结合，能够抑制血红蛋白的影响。

实施例6还原性物质添加效果的确认

将亚硫酸钠浓度设为250mm，ph值设为6.7，评价还原性物质抗坏血酸钠(aa)、2-巯基乙胺(2-mea)、2-二甲氨基乙硫醇(2-daet)、二硫苏糖醇(dtt)、2-巯基乙醇(2-me)、半胱氨酸或还原型谷胱甘肽对血红蛋白吸收光谱的效果。

(试剂)

除了实施例5以外，也制备分别加入10mm2-巯基乙醇、半胱氨酸或还原型谷胱甘肽的试剂，作为第一试剂。第二试剂与实施例4相同。

(2)测定试样

与实施例4同样地制备。

(3)评价方法

与实施例4同样地测定血红蛋白吸收光谱随时间的变化。将结果示于图3至图10。

由图3至图9可知，除了亚硫酸钠以外，在第一试剂中还含有抗坏血酸钠、2-巯基乙胺、2-二甲氨基乙硫醇、二硫苏糖醇、2-巯基乙醇、半胱氨酸或还原型谷胱甘肽等还原性物质时，血红蛋白吸收光谱会稳定下来，不会随时间而变化。与此相对，当除去亚硫酸钠而单独添加抗坏血酸钠时(图10)，会观察到血红蛋白吸收光谱随时间的变化。

实施例7ph值对添加亚硫酸盐和2-巯基乙胺的组成的影响

将亚硫酸钠设为250mm，将2-巯基乙胺设为10mm，评价ph值对类风湿因子的干扰反应和血红蛋白影响的影响。

(1)试剂

制备含有250mm亚硫酸钠、10mm2-巯基乙胺的50mmpipes缓冲液(ph值为6.0、6.2、6.7或6.9)或50mmhepes缓冲液(ph值为7.4或8.0)，作为第一试剂。第二试剂与实施例1相同。

(2)测定试样

通过在混合血清中加入干扰物检查rfplus(希森美康(sysmex)株式会社)，使类风湿因子浓度为0、250或500iu/ml，来制备rf试样。另外，通过在混合血清中加入干扰物检查aplus溶血血红蛋白(希森美康(sysmex)株式会社)，使血红蛋白浓度为0、250或500mg/dl，来制备hb试样。

(3)评价方法

与实施例1同样地测定试样。将结果示于表8和表9。

[表8]

＊：将未添加rf(oiu/ml)作为100％时的值

[表9]

＊：将未添加hb(0mg/dl)作为100％时的值

由表8可知，当ph值为6.0至7.4时，类风湿因子的干扰反应得到抑制，而当ph值为8.0时，则随着rf浓度观察到类风湿因子的干扰反应，亚硫酸盐对干扰反应的抑制效果下降。

另外，由表9可知，通过在亚硫酸盐中加入2-巯基乙胺，在ph值为6.0至8.0的范围内血红蛋白的影响得到了抑制。在亚硫酸盐中混合2-巯基乙胺而形成的免疫学测定试剂的ph值优选为7.4以下。

实施例8ph值对添加亚硫酸盐和抗坏血酸盐的组成的影响

将亚硫酸钠设为250mm，将抗坏血酸钠设为10mm，评价ph值对类风湿因子的干扰反应和血红蛋白影响的影响。另外，还在抑制亚硫酸盐和抗坏血酸盐的氧化的条件(将试剂容器填充满并在4℃静置)和促进氧化的条件(将试剂容器填充一半并在4℃振荡3周)保存，并评价亚硫酸盐和抗坏血酸盐的氧化的影响。

(1)试剂

制备含有250mm亚硫酸钠、10mm抗坏血酸钠的50mmpipes缓冲液(ph值为5.6、6.0、6.2、6.4、6.7或6.9)或50mmhepes缓冲液(ph值为7.2或7.4)，作为第一试剂。第二试剂与实施例1相同。

(2)测定试样

通过在混合血清中加入干扰物检查rfplus(希森美康(sysmex)株式会社)，使类风湿因子浓度为0、100、200、300、400或500iu/ml，来制备rf试样。另外，通过在混合血清中加入干扰物检查aplus溶血血红蛋白(希森美康(sysmex)株式会社)，使血红蛋白浓度为0、100、200、300、400或500mg/dl，来制备hb试样。

(3)评价方法

与实施例1同样地测定试样。将结果示于表10和表11。

[表10]

[表11]

由表10可知，在ph值为5.6至7.4的范围内，类风湿因子的干扰反应得到抑制，而当ph值为7.2以上时抑制效果下降。但是，在ph值为5.6至7.4的范围内，即使在促进亚硫酸盐和抗坏血酸盐的氧化的保存条件下，也没有观察到类风湿因子的干扰反应的抑制效果下降。

另外，由表11可知，未观察到ph值对血红蛋白影响的影响，并且也没有观察到保存条件所造成的差异。在亚硫酸盐中混合抗坏血酸盐而形成的免疫学测定试剂的ph值优选为7.4以下，更优选为5.6至7.4，进一步优选为5.6至6.9。

实施例9硫醇化合物的浓度的影响

将亚硫酸钠设为250mm，ph值设为6.7，评价2-巯基乙胺浓度对类风湿因子的干扰反应和血红蛋白影响的影响。

(1)试剂

制备含有250mm亚硫酸钠、0(比较例)、10、50或100mm2-巯基乙胺的50mmpipes缓冲液(ph值为6、7)，作为第一试剂。此外，关于加入了10mm和50mm的2-巯基乙胺的试剂，再制备除去亚硫酸钠的试剂。第二试剂与实施例1相同。

(2)测定试样

与实施例8同样地制备。

(3)评价方法

与实施例1同样地测定试样。将结果示于表12和表13。

[表12]

＊：将未添加rf(oiu/ml)作为100％时的值

[表13]

＊：将未添加hb(0mg/dl)作为100％时的值

由表12可知，当在亚硫酸盐中混合2-巯基乙胺时，未观察到2-巯基乙胺的浓度对类风湿因子的干扰反应的抑制的影响。与此相对，关于未添加亚硫酸盐而单独添加了2-巯基乙胺的试剂，则观察到浓度引起的差异，在10mm浓度下观察到类风湿因子引起的干扰反应。

由表13可知，在未混合2-巯基乙胺的比较例中，观察到血红蛋白的影响；而当在亚硫酸盐中混合2-巯基乙胺时，则未观察到血红蛋白的影响，也未观察到2-巯基乙胺的浓度的影响。

实施例10抗坏血酸浓度

将亚硫酸钠设为250mm，ph值设为6.7，评价抗坏血酸浓度对血红蛋白影响的影响。

(1)试剂

制备含有250mm亚硫酸钠、1、2、5、10、30、50、100或300mm抗坏血酸钠的50mmpipes缓冲液(ph6.7)，作为第一试剂。第二试剂与实施例1相同。

(2)测定试样

与实施例8的hb试样同样地制备。

(3)评价方法

与实施例1同样地测定试样，评价抗坏血酸钠浓度对血红蛋白(hb)影响的影响。将结果示于表14。

[表14]

＊:将未添加溶血血红蛋自(0mg/ml)作为100％时的值

由表14可知，通过添加1mm以上的抗坏血酸钠，可以完全抑制因未添加抗坏血酸而观察到的血红蛋白的影响。另外可知，即使在添加了300mm的情况下，也能进行准确的测定。

实施例11还原性物质添加浓度下限的确认

将亚硫酸钠浓度设为250mm，ph值设为6.7，通过对血红蛋白吸收光谱随时间变化的效果，来评价还原性物质抗坏血酸钠或2-巯基乙胺(2-mea)的添加浓度的下限。

(试剂)

将抗坏血酸钠浓度设为0.01mm或0.1mm，将2-巯基乙胺浓度设为0.1mm或1.0mm，与实施例5同样地制备第一试剂。第二试剂与实施例4相同。

(2)测定试样

与实施例4同样地制备。

(3)评价方法

与实施例4同样地测定血红蛋白吸收光谱随时间的变化。将结果示于图11至图14。

由图13至图14可知，当添加1mm的2-巯基乙胺时，血红蛋白吸收光谱随时间变化得到抑制。另外，由图12可知，当添加0.1mm的抗坏血酸钠时，可以观察到血红蛋白吸收光谱随时间的若干变化，但与相同浓度的2-巯基乙胺相比，随时间变化小，因此认为通过添加与2-巯基乙胺相同的1mm，血红蛋白吸收光谱随时间变化得到抑制。

实施例12含有亚硫酸盐和抗坏血酸盐的试剂的稳定性的评价

在4℃将加入了亚硫酸钠和抗坏血酸的第一试剂保存12个月后，将制备后的第一试剂作为对照，测定含有干扰物质的人血清样本，评价干扰反应的抑制效果的稳定性。

(1)试剂

制备含有250mm亚硫酸钠、10mm抗坏血酸钠的50mmpipes缓冲液(ph值为6.7)，作为第一试剂。另外，也制备从上述组成中除去抗坏血酸钠的第一试剂。第二试剂与实施例1相同。

(2)测定试样

将含有异嗜性抗体(hara、haga、hama或haha)和/或类风湿因子的人血清样本作为试样。

(3)评价方法

与实施例1同样地测定试样。将结果示于表15。

[表15]

由表15可知，使用在4℃保存了12个月的第一试剂得出的含有异嗜性抗体和/或类风湿因子的血清样本的测定值，与使用制备后的第一试剂得出的测定值相同，即使在4℃保存12个月，也未观察到干扰反应的抑制效果下降，长时间保持稳定。另外，也未观察到抗坏血酸钠的存在与否所引起的稳定性的差异，但当未含有抗坏血酸时，如实施例5等所示，会受到血红蛋白的影响。

实施例13使用mmp-3测定试剂的效果

另外，将测定对象物质换成mmp-3，确认了本发明的效果。

(1)试剂

制备含有250mm亚硫酸钠、10mm抗坏血酸钠的50mmpipes缓冲液(ph6.7)，作为第一试剂。另外，也制备从上述组成中除去抗坏血酸钠的第一试剂，以及将上述除去了抗坏血酸钠的第一试剂的pipes缓冲液(ph6.7)作为hepes缓冲液(ph7.4)的试剂。

制备50mm含有承载抗mmp-3抗体的聚苯乙烯乳胶液的hepes缓冲液(ph7.4)，作为第二试剂。

上述承载抗mmp-3的乳胶液，可以利用公知的方法制备。即通过如下方式制备：将抗mmp-3抗体和聚苯乙烯乳胶混合，在聚苯乙烯乳胶表面承载抗mmp-3抗体。

(2)测定试样

与异嗜性抗体或类风湿因子阳性的人血清样本，以及实施例8同样地制备hb试样。

(3)评价方法

在2.4μl试样中混合120μl第一试剂，在37℃孵育5分钟后，向该混合液中混合40μl第二试剂，在37℃进行反应，测定混合第二试剂后约5分钟的主波长570nm和副波长800nm这两个波长下的吸光度变化。另外，一系列的测定使用日立7180型自动分析设备(株式会社日立高新技术)进行。

为了定量mmp-3的浓度，根据测定mmp-3的标准物质而得到的标准曲线，计算试样中的mmp-3浓度。将结果示于表16和表17。

[表16]

[表17]

＊:将未添加hb(0mg/dl)作为100％时的值

由表16可知，无论有无抗坏血酸钠，通过将第一试剂的ph值设为6.7，可以抑制干扰物质造成的干扰反应；而将第一试剂的ph值设为7.4时，则在含有高浓度干扰物质的血清(血清1、血清2、血清12和血清14)中，无法充分抑制干扰物质造成的干扰反应，mmp-3测定值升高。

由表17可知，在mmp-3中，当将第一试剂的ph值设为6.7，未添加抗坏血酸盐时，则会观察到血红蛋白的影响；而通过添加抗坏血酸盐，能够抑制血红蛋白的影响。

工业实用性

如上所述，通过本发明，可以提供一种免疫学测定方法和免疫学测定试剂，所述免疫学测定方法即使在测定的试样中含有高浓度的异嗜性抗体和类风湿因子等干扰物质的情况下，也能够长期充分地抑制由这些干扰物质引起的干扰作用，并且不受血红蛋白的影响，从而准确地对测定对象物进行测定。

本说明书所引用的全部刊物、专利以及专利申请通过直接引用而编入本说明书。