本申请要求于2016年7月18日提交的美国临时申请no.62/363,825的权益，其全部的公开内容通过引用并入本文。
背景技术：
在具有高灵敏度和特异性的细胞测定中，在低于皮克水平的一些情况下检测低表达靶标标志物(包括蛋白质和核酸)的能力仍然是未满足的需求。随着可用于分析的细胞和组织的样品尺寸变得越来越小，这种方法变得更加重要。此外，在单次测定中同时检测多种低表达靶标的能力将是进一步的益处。
原位杂交(ish)是用于检测生物样品中的核酸的强大的标记技术。一般方法通常涉及使用与固定组织或细胞样品中的目的靶核酸互补的标记的dna、rna或修饰的核酸探针。标记的探针与样品中的靶标dna或rna序列杂交，从而提供关于一个或多个遗传基因座(例如，用于基因组dna靶标)或一个或多个表达基因(例如，用于rna靶标)的时间和空间信息。
可以根据用于修饰探针的标记的类型以及因此用于鉴定靶标的检测方法将原位杂交技术彼此区分。对于显色原位杂交(cish)测定，使用过氧化物酶或碱性磷酸酶反应(如ihc染色中常规使用的反应和标记)在靶标位置处产生显色信号。随后使用明视场显微镜观察信号。cish可用于测定(例如)基因扩增、基因缺失、染色体易位和染色体数目。cish尤其适用于福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)的组织、中期染色体分散、固定细胞和血液或骨髓涂片。
对于荧光原位杂交(fish)测定，荧光标记用于检测过程，并且使用荧光显微术或相关光谱技术检测信号。使用具有光谱上不同的荧光特性的多个荧光标记使得能够在单个样品内同时检测和共定位多个核酸靶标。因此，对于dna靶标，fish可用于(例如)检测目的基因组基因座的存在、拷贝数和位置，并鉴定基因突变体和染色体缺陷。对于rna靶标，fish可用于(例如)在时间和空间上评估基因表达，从而提供对生理过程和疾病发病机理的见解。
原位杂交技术可另外与免疫组织化学(ihc)染色技术组合使用，以同时标记在组织样品中或在另一合适表面上的靶核酸和表达靶标蛋白。
然而，尽管上述方法是有用的，但是仍然需要开发改进的杂交测定试剂、方法和试剂盒，其在单次测定中更灵敏、更具特异性、能够检测更多种核酸靶标。
技术实现要素：
本公开通过在一个方面中提供了在各种杂交测定中发现有用的杂交试剂组合物来解决了这些和其他需要。具体而言，根据本发明的该方面，所述杂交试剂组合物包含：
与桥接抗原偶联的寡核苷酸探针；和
可检测的抗体；
其中所述可检测的抗体对所述桥接抗原具有高亲和力特异性。
在一些实施方案中，桥接抗原是肽或小分子半抗原。
在一些实施方案中，桥接抗原包含多个抗原决定簇。在具体实施方案中，多个抗原决定簇中的每个抗原决定簇是相同的。在其他具体实施方案中，多个抗原决定簇包含线性重复结构。更具体而言，线性重复结构是线性重复肽结构。
在其他具体实施方案中，多个抗原决定簇包括至少三个抗原决定簇，或者桥接抗原包括支化结构。
在一些实施方案中，桥接抗原是包含非天然残基的肽。具体而言，非天然残基可以是非天然立体异构体或β-氨基酸。
在一些实施方案中，利用化学偶联反应通过缀合部分将寡核苷酸探针和桥接抗原偶联。在具体实施方案中，通过高效缀合部分偶联寡核苷酸探针和桥接抗原。在这些实施方案的一些中，高效缀合部分是席夫碱，例如腙或肟。在一些实施方案中，通过点击反应形成高效缀合部分。在一些实施方案中，缀合部分包含可切割的接头。
在实施方案中，可检测的抗体包含可检测的标记。在一些实施方案中，可检测的标记是荧光团、酶、上转换纳米颗粒、量子点或可检测的半抗原。在具体实施方案中，可检测的标记是荧光团。在其他具体实施方案中，酶是过氧化物酶，例如辣根过氧化物酶或大豆过氧化物酶；碱性磷酸酶；或是葡萄糖氧化酶。
根据一些实施方案，可检测的抗体对于桥接抗原是特异性的，解离常数为至多100nm、至多30nm、至多10nm、至多3nm、至多1nm、至多0.3nm、至多0.1nm、至多0.03nm、至多0.01nm、至多0.003nm，甚至更低。
一些组合物实施方案包含多个桥接抗原偶联的寡核苷酸探针和多个可检测的抗体，包括含有三个、五个、十个甚至更多个试剂对的组合物。
在另一方面，本公开提供了免疫试剂，包含：
与桥接抗原偶联的寡核苷酸探针。
在具体实施方案中，杂交试剂包括上述杂交试剂组合物的杂交试剂的一个或多个特征。
根据另一方面，本公开提供了包含多个任意上述杂交试剂的多重杂交试剂组合物。在具体实施方案中，所述组合物包含至少三种、至少五种、至少十种、甚至更多种杂交试剂。
在另一方面，本公开提供了用于杂交测定的方法，包括：
提供包含第一靶核酸的第一样品；
使所述第一靶核酸与第一杂交试剂反应，其中所述第一杂交试剂是与所述第一靶核酸互补的任何上述杂交试剂；
使所述第一杂交试剂与第一可检测的抗体反应，其中所述第一可检测的抗体对所述第一杂交试剂的桥接抗原具有高亲和力特异性；以及
检测与所述第一杂交试剂的桥接抗原相关的第一可检测的抗体。
在具体实施方案中，第一可检测的抗体包含可检测的标记。更具体地，可检测的标记可以是荧光团、酶、上转换纳米颗粒、量子点或可检测的半抗原。在一些实施方案中，可检测的标记是荧光团，并且在一些实施方案中，酶是过氧化物酶、碱性磷酸酶或葡萄糖氧化酶。在具体实施方案中，过氧化物酶是辣根过氧化物酶或大豆过氧化物酶。
在一些实施方案中，第一靶核酸在组织切片内。在这些实施方案中，检测步骤可以是荧光检测步骤或酶检测步骤。
在一些实施方案中，第一靶核酸可以在细胞中或细胞上。在这些实施方案中，第一靶核酸可以在细胞的细胞质中或细胞核中。
在一些实施方案中，检测步骤是荧光检测步骤，并且在具体实施方案中，该方法还可以包括分选结合第一可检测的抗体的细胞的步骤。
在一些实施方案中，该方法还包括：
使所述第一样品上的第二靶核酸与第二杂交试剂反应，其中所述第二杂交试剂是与所述第二靶核酸互补的任何上述杂交试剂；
使所述第二杂交试剂与第二可检测的抗体反应，其中所述第二可检测抗体对所述第二杂交试剂的桥接抗原具有高亲和力特异性；以及
检测与所述第二杂交试剂的桥接抗原相关的所述第二可检测的抗体。
更具体的方法实施方案还包括检测样品中的至少三种靶核酸、样品中的至少五种靶核酸、或甚至是样品中的至少十种靶核酸。
一些方法实施方案还包括以下步骤：
使第二样品上的第二靶核酸与第二杂交试剂反应，其中所述第二杂交试剂是与所述第二靶核酸互补的任何上述杂交试剂；
使所述第二杂交试剂与第二可检测的抗体反应，其中所述第二可检测的抗体对所述第二杂交试剂的桥接抗原具有高亲和力特异性；以及
检测与所述第二杂交试剂的桥接抗原相关的所述第二可检测的抗体；其中所述第一样品和所述第二样品是组织样品的连续切片。
其他方法实施方案包括以下步骤：
提供包含第一靶核酸的样品；
使所述第一靶核酸与第一杂交试剂反应，其中所述第一杂交试剂是与所述第一靶核酸互补的任何上述杂交试剂；
使所述第一杂交试剂与第一反应性抗体反应，其中所述第一反应性抗体以高亲和力结合所述第一杂交试剂的桥接抗原；以及
使所述第一反应性抗体与第一可检测的试剂反应，其中所述第一可检测的试剂与所述第一靶核酸附近的样品结合。
在一些实施方案中，这些方法还包括以下步骤：
从样品中解离出第一反应性抗体。
在一些实施方案中，这些方法还包括以下步骤：
使所述样品上的第二靶核酸与第二杂交试剂反应，其中所述第二杂交试剂是与所述第二靶核酸互补的任何上述杂交试剂；
使所述第二杂交试剂与第二反应性抗体反应，其中所述第二反应性抗体以高亲和力结合所述第二杂交试剂的桥接抗原；以及
使所述第二反应性抗体与第二可检测的试剂反应，其中所述第二可检测的试剂与所述第二靶核酸附近的样品结合。
在一些实施方案中，这些方法包括以下步骤：
检测样品上的第一可检测的试剂和第二可检测的试剂。
根据另一方面，本发明提供了用于杂交测定的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含任何上述杂交试剂、对于杂交试剂的桥接抗原具有高亲和力特异性的可检测的抗体以及试剂盒的使用说明书。在具体实施方案中，试剂盒包含至少三种、至少五种、或甚至至少十种的任意上述杂交试剂；至少三种、至少五种、甚至至少十种对于所述杂交试剂的桥接抗原具有高亲和力特异性的可检测的抗原；以及试剂盒的使用说明书。
具体实施方式
抗原偶联的杂交试剂
在一个方面，本公开提供了包含寡核苷酸探针和桥接抗原的高效杂交试剂，其中所述寡核苷酸探针和桥接抗原偶联，并且其中所述桥接抗原可被高亲和性可检测的抗体识别。
本发明的杂交试剂可用于杂交测定，以在测定中鉴定和结合目的靶核酸，其中用于制备杂交试剂的寡核苷酸探针的互补性决定了靶结合的特异性。特别地，本发明的杂交试剂的寡核苷酸探针可以针对细胞内或无细胞系统中的目的靶核酸，包括脱氧核糖核酸(dna)、核糖核酸(rna)和它们的任何天然或合成变体，但不限于此。在一些情况下，可以在亚细胞器内发现靶核酸，例如在细胞核内或在线粒体内。靶核酸可以替代地在目的表面上呈现，例如在核酸印迹或其他类型的二维培养基上。靶核酸在某些情况下可以是不纯的形式、部分纯化形式或纯化形式。通常，靶核酸可以在任意合适的表面上或在任意合适的表面内，或者甚至可以在溶液中游离，只要其可用于与杂交试剂特异性相互作用即可。
本发明杂交试剂的桥接抗原被选择为可被二抗识别，理想地以高亲和力识别。因此，桥接抗原的结构仅仅受限于能够在合适的动物中引发免疫应答的分子，或者可以用于通过另一种方式产生合适的二抗的分子。
在一些实施方案中，分开制备桥接抗原和寡核苷酸探针，并通过化学偶联反应使它们彼此连接。在这些实施方案中，桥接抗原被设计成含有至少一个能够将桥接抗原与杂交试剂的寡核苷酸探针化学偶联的基团。如下面更详细描述的，在具体实施方案中可以选择偶联基团，使得桥接抗原以高特异性和高效率与寡核苷酸探针缀合。此外，桥接抗原与寡核苷酸探针的偶联不应当显著影响桥接抗原被可检测的抗体所识别的能力。还期望的是桥接抗原和偶联基团本身不具有干扰吸光度或荧光，以避免任何背景信号。此外，桥接抗原和偶联基团应该以高纯度、理想地以低成本获得。
在一些实施方案中，本公开的桥接抗原是合成桥接抗原。在一些实施方案中，桥接抗原是天然产物。在具体实施方案中，桥接抗原是肽。
如本领域普通技术人员已知和理解的，合成肽或者从天然来源分离的肽已被广泛用于通过各种手段产生特异性的高亲和力抗体。肽可能的结构变异范围几乎是无限的，因此使得其理想地适用于本发明杂交试剂中的桥接抗原。此外，合成肽可以被设计为包括反应性基团，以促进它们与寡核苷酸探针的偶联，例如通过在固相肽合成期间或合成后包括在c或n-末端或内部并入的、在肽序列内具有所需反应活性的氨基酸残基或其他连接部分。肽桥接抗原可以是任何大小的并且可以含有任何合适的氨基酸或天然和人造的其他残基。它们可以是线性的或圆形的。在这些实施方案中，肽桥接抗体仅受限于其与目的抗体缀合并可被可检测的抗体识别的能力。
在一些实施方案中，桥接抗原是包含非天然残基的肽。例如，桥接抗原可以包含非天然立体异构体，如d-氨基酸。在一些实施方式中，非天然残基可以是非天然氨基酸，如β-氨基酸等。在一些实施方案中，如本领域普通技术人员将理解的，桥接抗原的残基可以使用非肽结合进行偶联。
包括在本发明杂交试剂中的有用的其他合适的桥接抗原包括非肽小分子抗原。与肽桥接抗原一样，这样的抗原仅受其与寡核苷酸探针偶联的能力的限制，并且其可以被可检测的抗体所识别。在本文中也称为“半抗原”的示例性非肽小分子抗原包括但不限于以下分子，例如硝基苯基、二硝基苯基、三硝基苯基、地高辛、生物素、5-溴脱氧尿苷、3-硝基酪氨酸、小分子药物和任何其他类似的化学标签。
为了增加每个杂交试剂的结合位点的数目，在一些情况下单独的桥接抗原包含多个抗原决定簇或表位可能是有利的。桥接抗原中抗原决定簇的多重性可能增加能够结合杂交试剂的二抗的数目，从而增加使用杂交试剂的检测的灵敏度。在一些实施方案中，多个抗原决定簇可以包含相同抗原决定簇的多个拷贝，而在一些实施方案中，多个抗原决定簇可以包含不同的抗原决定簇。在一些实施方案中，多个抗原决定簇可以包含线性重复结构。更具体而言，线性重复结构可以是线性重复肽结构。在一些实施方案中，多个抗原决定簇可以包含至少两个抗原决定簇、至少三个抗原决定簇、至少四个抗原决定簇、至少六个抗原决定簇或甚至更多抗原决定簇。
在一些实施方案中，桥接抗原可以包含支化结构。例如，如本领域普通技术人员将理解的，支化结构可以包含树枝状聚合物结构等，例如其他聚合的构建体。
此外，应当理解，包含多个抗原决定簇的桥接抗原可以在抗原决定簇之间(例如在肽抗原决定簇之间)包含一个或多个聚乙二醇接头等。
在一些实施方案中，肽抗原决定簇的每抗原决定簇包含至少4个、至少6个、至少8个、至少10个、至少15个、至少20个、甚至更多个氨基酸残基。
当寡核苷酸探针和桥接抗原由单独的分子实体制备时，应当理解，取决于所需的结果，可以以各种各样的方式实现寡核苷酸探针和桥接抗原的偶联。如果桥接抗原与寡核苷酸探针的偶联位置和程度的控制不重要，则可以使用非特异性化学交联剂来实现偶联。然而，通常期望桥接抗原以受控和特异性的方式偶联至寡核苷酸探针，并且偶联方法和试剂的选择可影响偶联的位置、程度和效率。例如，尽管在核酸中没有发现天然存在的反应性硫醇和氨基，但是在寡核苷酸合成期间反应性硫醇和氨基可以包含在寡核苷酸探针内的不同位置，以便为硫醇反应性桥接抗原或氨基反应性桥接抗原的连接提供特定位置。
在一些杂交试剂的实施方案中，通过化学偶联反应借由缀合部分偶联寡核苷酸探针和桥接抗原。在具体实施方案中，通过高效缀合部分偶联寡核苷酸探针和桥接抗原。因为杂交试剂优选以相对较低摩尔浓度的起始材料合成，并且因为这些起始材料可能是昂贵的并且可以以相对小的化学量获得，所以非常希望缀合部分的形成是有效的并且在较低摩尔浓度的反应物中其形成完成或接近完成。具体而言，希望缀合部分能够将寡核苷酸探针和桥接抗原以快速动力学和/或高缔合常数偶联，因此，关联反应在其完成方面尽可能有效。
如下面更详细地描述的，通常通过用互补缀合试剂单独修饰杂交试剂的每个组分，从而形成本发明杂交试剂的高效缀合部分。互补缀合试剂另外包括其他反应性部分，例如硫醇反应性或氨基反应性部分，其允许缀合试剂连接至相关的杂交试剂组分，例如连接至寡核苷酸探针和连接至桥接抗原。已经通过相应的互补缀合试剂修饰寡核苷酸探针和桥接抗原之后，修饰的组分上的互补缀合特征以高效且特异的方式彼此缀合，从而形成缀合部分。
根据情况，本发明杂交试剂的高效缀合部分可以是共价或非共价缀合部分。在具体的实施方案中，高效缀合部分是共价缀合部分，例如腙、肟，或其他合适的席夫碱部分。这种缀合部分的非限制性实例可以在例如美国专利no.7,102,024中找到，其全部内容通过引用并入本文用于所有目的。这些缀合部分可以通过连接至杂交试剂(例如，用氨基修饰的合成寡核苷酸探针)的一种成分的缀合试剂上的伯氨基与连接至免疫试剂的另一种成分的缀合试剂上的互补羰基(例如，桥接抗原)的反应而形成。
例如，腙缀合部分可以通过肼基或被保护的肼基与羰基部分的反应形成。示例性的肼基包括脂肪族、芳香族或杂芳族肼、氨基脲、卡巴肼、酰肼、氨基硫脲、硫代卡巴肼、碳酸二肼或羧酸肼基团。参见美国专利no.7,102,024。氧化缀合部分可以通过氧基氨基或被保护的氧基氨基与羰基部分的反应形成。示例性的氧氨基如下所述。肼基和氧基氨基可以通过形成肼基或氧基氨基的盐从而被保护，所述盐包括但不限于无机酸盐，例如但不限于盐酸盐和硫酸盐，以及有机酸的盐，例如但不限于限制于乙酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、丁酸盐、戊酸盐和富马酸盐，或者肼基和氧基氨基可以被本领域技术人员已知的任何氨基或肼基保护基团所保护(参见例如greene等(1999)protectivegroupsinorganicsynthesis(3rded.)(j.wileysons,inc.))。用于产生席夫碱缀合部分的羰基部分是能够与一个或多个上述肼基或氧氨基部分形成腙或肟键的任何含羰基基团。优选的羰基部分包括醛和酮，特别是芳族醛和酮。在本公开优选的实施方案中，通过在存在苯胺催化的情况下，含氧基氨基的组分和含芳族醛的组分发生反应，从而形成高效缀合部分(dirksen等(2006)angew.chem.45:7581-7584(doi:10.1002/anie.200602877))。
或者，可以通过“点击”反应形成本发明免疫试剂的高效缀合部分，例如叠氮取代的组分与炔取代的组分的铜催化的反应形成三唑缀合部分。参见kolb等(2001)angew.chem.int.ed.engl.40：2004；evans(2007)aus.j.chem.60：384。该反应的无铜变体，例如应变促进的叠氮炔点击反应也可用于形成高效缀合部分。参见例如baskin等(2007)proc.natlacad.sci.u.s.a.104：16793-97。其他点击反应变体包括四嗪取代的组分与异腈取代的组分(
本领域普通技术人员非常了解点击反应的基本特征。参见kolb等，(2001)angew.chem.int.ed.engl.40：2004。有用的点击反应通常包括但不限于[3+2]环加成，例如huisgen1,3-偶极环加成，特别是cu(i)催化的逐步变体，硫醇-烯点击反应，狄尔斯-阿尔德反应和逆电子需求的狄尔斯-阿尔德反应，异腈类(异氰化物)和四嗪类之间的[4+1]环加成，亲核取代，特别是环氧和氮丙啶化合物等小应变环，脲的羰基化学样形成，以及一些碳-碳双键的加成反应。可以使用任何上述反应，其对本发明的杂交试剂中产生共价高效缀合部分没有限制作用。
在一些实施方案中，本发明杂交试剂的缀合部分包含可切割的接头。可用于包括在本发明高效缀合部分中的示例性可切割接头是本领域已知的。参见例如leriche等(2012)bioorg.med.chem.20：571-582(doi：10.1016/j.bmc.2011.07.048)。在高效缀合部分中包含可切割接头允许在本发明杂交试剂中选择性切割来自寡核苷酸探针的桥接抗原。这种选择性切割在一些杂交测定方法中可能是有利的，例如需要从样品表面释放桥接抗原及其相关的二抗。
在其他实施方案中，高效缀合部分是非共价缀合部分。非共价缀合部分的非限制性实例包括寡核苷酸杂交对或蛋白-配体结合对。在具体实施方案中，蛋白-配体结合对是抗生物素蛋白-生物素对、链霉抗生物素蛋白-生物素对或其他蛋白-生物素结合对(通常参见avidin-biotintechnology,meth.enzymol.(1990)第184卷，academicpress；avidin-biotininteractions：methodsandapplications(2008)mcmahon,ed.,humana；molecular
在一些实施方案中，高效缀合部分在偶联寡核苷酸探针和桥接抗原时的效率为至少50％、80％、90％、93％、95％、97％、98％、99％或甚至更有效。在更具体的实施方案中，高效缀合部分在反应物浓度不超过0.5mg/ml下的效率为至少50％、80％、90％、93％、95％、97％、98％、99％或甚至更有效。在一些实施方案中，在不超过0.5mg/ml、不超过0.2mg/ml、不超过0.1mg/ml、不超过0.05mg/ml、不超过0.02mg/ml、不超过0.01mg/ml或者甚至更低的反应物浓度下实现了上述效率。
在另一方面，本公开提供了包含多种上述杂交试剂的杂交试剂组合物，也称为杂交试剂组。在实施方案中，组合物包括至少3种、5种、10种、20种、30种、50种、100种或甚至更多种的杂交试剂。在一些实施方案中，所包括的杂交试剂的寡核苷酸探针与编码某些细胞标志物的基因或由这些基因表达的rna的至少一个片段互补，因此能够与标志物基因或标志物基因的表达物杂交并对其进行检测。在具体实施方案中，细胞标志物至少为er和pr。在其他具体实施方案中，细胞标志物至少是her2、er和pr或至少为her2、er和ki67。在其他具体实施方案中，细胞标志物至少为her2、er、pr和ki67。在其他具体实施方案中，细胞标志物至少为ki67、egfr和ck5。在还一些其他具体实施方案中，细胞标志物至少为ki67、egfr、ck5和ck6，或至少为ck5、ck6和ki-67。在其他具体实施方案中，细胞标志物至少为ck5、egfr、p40和ki-67，或至少为iga、补体3c(c3c)、胶原ivα链5(col4a5)和igg。在一些实施方案中，所包括的免疫试剂的桥接抗原是肽。
在一些实施方案中，本公开的免疫试剂组合物对免疫细胞上的细胞标志物具有特异性，所述细胞标志物例如为任意组合的cd3、cd4、cd8、cd20、cd68和/或foxp3，以及上面列出的任何细胞标记物。在一些实施方案中，免疫试剂组合物对于与检查点途径(checkpointpathway)有关的标记物(例如ctla-4、cd152、pd-1、pd-l1等)具有特异性。
包含与桥接抗原偶联的一抗的抗原偶联免疫试剂已在先前于2016年2月6日提交的美国专利申请no.15/017,626和pct国际申请no.pct/us16/16913中公开，其中出于所有目的，这两个专利的全部公开内容通过引用并入本文。如本领域普通技术人员所理解的，在制备和使用桥接抗原连接的免疫试剂的那些公开内容中示例的方法可以容易地适用于本发明杂交试剂的合成和使用。
可检测的抗体
如上所述，本发明的杂交剂的桥接抗原可通过可检测的抗体识别。为了增加使用本发明杂交试剂的杂交测定中的灵敏度和降低背景，通常期望使每个可检测的抗体对其相应的桥接抗原的亲和力和/或特异性最大化。如本领域普通技术人员所理解的，通常使用平衡参数、解离常数或“kd”评估抗体对抗原的亲和力。对于给定抗体浓度，解离常数大致对应于抗原的浓度，其中抗体的一半与抗原结合，抗体的另一半不与抗原结合。因此，较低的解离常数对应于抗体对抗原的较高亲和力。
解离常数也与抗体和抗原的解离和结合的动力学速率常数的比例有关。因此，解离常数可以通过平衡结合测量结果或动力学测量结果来估计。这些方法是本领域公知的。例如，使用基于biacore表面等离子体共振的仪器(gehealthcare，littlechalfont，buckinghamshire，uk)、octet生物层干涉测量系统(pallfortebiocorp，menlopark，ca))等获得的传感图的动力学分析来常规测定抗体-抗原结合参数。参见例如美国专利申请公开no.2013/0331297，其描述了一系列抗体克隆及其相应的肽抗原结合配偶体的解离常数的测定。
典型的抗体具有在从微摩尔到高纳摩尔范围内(即10-6m至10-8m))的平衡解离常数。高亲和力抗体通常具有在较低的纳摩尔至高皮摩尔范围内(即10-8m至10-10m)的平衡解离常数。非常高亲和力的抗体通常具有在皮摩尔范围内(即10-10m至10-12m)的平衡解离常数。抗肽或其他大分子的抗体对它们的抗原通常具有比这些抗体抗小分子半抗原更高的亲和力(较低的kds)，其可能表现出微摩尔范围内的解离常数甚至更高。
可以优化本发明的杂交试剂组合物的二抗以增加其对抗原偶联的寡核苷酸探针的亲和力。例如，美国专利申请公开no.2013/0331297公开了用于鉴定具有高亲和力的抗体克隆的方法，该抗体克隆可被适当地修改以产生在本发明杂交试剂组合物中使用的可检测的抗体。在这些方法中，将编码合成肽的短dna片段与编码目的抗体文库的基因库的重链融合，并转化酵母细胞以产生酵母展示抗体文库。用高速荧光激活细胞分选仪(facs)筛选酵母细胞，以解离具有高特异性的高亲和力抗体克隆。与其他酵母展示系统如aga2相比，该系统具有附加的优点，即转化的酵母细胞将足够量的抗体分泌到培养基中，以便直接测定单个酵母克隆的培养基，从而确定表达的抗体的特异性和亲和力，而不需要用于鉴定具有所需特异性和亲和力的候选克隆的额外的克隆和抗体纯化步骤。
上述酵母展示文库系统利用了由免疫的兔子产生的抗体文库来产生具有高特异性和亲和力的兔单克隆抗体，从而利用兔免疫系统的优异的能力来产生针对小的半抗原或肽的抗体，同时具有酵母展示的效率，以分离具有优异的亲和性和特异性的抗体克隆。使用这种方法，产生一组针对小分子、肽和蛋白质的兔单克隆抗体，其抗体亲和力在<0.01至0.8nm的范围内。这些亲和力超过了使用传统杂交瘤技术产生的啮齿动物的大多数单克隆抗体的亲和力。该方法还克服了兔杂交瘤技术融合效率低、稳定性差的固有问题。
虽然上述酵母展示文库系统是用于优化在本发明杂交试剂组合物中使用的二抗的结合亲和力的一种方法，但是应当理解，可以使用任何合适的方法来优化亲和力而不存在任何限制。在一些情况下，合适的高亲和力抗体可以在没有优化的情况下可用。
因此，在一些实施方案中，可检测的抗体对于桥接抗原是特异性的，其解离常数为至多100nm、至多30nm、至多10nm、至多3nm、至多1nm、至多0.3nm、至多0.1nm、至多0.03nm、至多0.01nm、至多0.003nm、甚至更低。在更具体的实施方案中，可检测的抗体对桥接抗原是特异性的，其解离常数为至多1nm、至多0.3nm、至多0.1nm、至多0.03nm、至多0.01nm、至多0.003nm、甚至更低。在甚至更具体的实施方案中，可检测的抗体对于桥接抗原是特异性的，其解离常数为至多100pm、至多30pm、至多10pm、至多3pm、甚至更低。
本发明的杂交试剂组合物的抗体优选是可检测的抗体，并且在一些实施方案中，其因此包含可检测的标记。如本领域普通技术人员将理解的，可检测的抗体的可检测的标记应当能够适当地附着于抗体，并且应当在不显著损害抗体与桥接抗原的相互作用的情况下进行附着。
在一些实施方案中，可检测的标记可以是可以被直接检测的，使得其可以被检测而不需要任何另外的组分。例如，直接可检测的标记可以是荧光染料、生物荧光蛋白(例如藻红蛋白、别藻蓝蛋白、大黄嘌呤素叶绿素蛋白复合物(“percp”)、绿色荧光蛋白(“gfp”))或者它们的衍生物(例如，红色荧光蛋白、青色荧光蛋白或蓝色荧光蛋白)、荧光素酶(例如萤火虫萤光素酶、海肾荧光素酶、基因工程修饰的荧光素酶或扣甲萤光素酶)或珊瑚衍生的青色和红色荧光蛋白(以及衍生自珊瑚的红色荧光蛋白的变体，例如黄色、橙色和远红色变体)、发光物质(包括化学发光物质、电化学发光物质或生物发光物质)，磷光性物质、放射性物质、纳米粒子、sers纳米粒子、量子点或其他荧光结晶纳米粒子、衍射粒子、拉曼粒子、金属粒子(包括螯合金属)、磁性颗粒、微球、rfid标签、微条码粒子或这些标签的组合。
在其他实施方案中，可检测的标记可以被间接检测，使得其可能需要使用一种或多种另外的组分进行检测。例如，可间接检测的标记可以是影响合适的底物中的颜色变化的酶，以及可以被携带标记的另一物质所特异性识别的其他分子，或者是可以与携带标记的物质相互反应的其他分子。合适的间接可检测的标记的非限制性实例包括酶，例如过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。在具体实施方案中，过氧化物酶是辣根过氧化物酶或大豆过氧化物酶。间接可检测的标记的其他实例包括半抗原，例如小分子或肽。非限制性示例性半抗原包括硝基苯基、二硝基苯基、地高辛、生物素、myc标签、flag标签、ha标签、s标签、strep标签、his标签、v5标签、reash标签、flash标签、生物素标签、sfp标签或其他化学或肽标签。
在具体实施方案中，可检测的标记是荧光染料。合适的荧光染料的非限制性实例可以在lifetechnologies/molecularprobes(eugene，or)和thermoscientificpierceproteinresearchproducts(rockford，il))的目录中找到，其全部内容通过引用并入本文。示例性染料包括荧光素、罗丹明和其他呫吨染料衍生物、花青染料及其衍生物、萘染料及其衍生物、香豆素染料及其衍生物、
在一些实施方案中，可检测的标记可以不直接连接到二抗上，而是可以连接到聚合物或其他合适的载体中间体，该中间体允许比通常被结合的数量更多的可检测的标记被连接到二抗。
在具体实施方案中，可检测的标记是寡核苷酸条形码标签，例如pct国际专利公开no.wo2012/071428a2中公开的条形码标签，其公开内容通过引用整体并入本文。这样的可检测的标记在涉及分离和/或分选靶标样品的杂交测定中是特别有利的，例如在基于流式细胞术的多重测定法中等等。这些标记在样品中靶核酸水平低并且需要极高的检测灵敏度的杂交测定中也是有利的。
在一些实施方案中，本公开的可检测的抗体可以包含多个可检测的标记。在这些实施方案中，与给定二抗相关联的多个可检测的标记可以是相同标记的多个拷贝，或者可以是能够产生合适的可检测信号的不同标记的组合。
在一些杂交试剂组合物的实施方案中，为了增加组合物的信号输出，将一个或多个可检测的标记连接至桥接抗原自身可能是有利的。有用地连接到桥接抗原上的可检测的标记可以是任何上述可检测的标记。理想地，这种可检测标记的可检测性应当与二抗的可检测标记重叠，使得来自寡核苷酸探针-桥接抗原和二抗对的信号将是加成的。此外，理想地，将可检测的标记连接到桥接抗原不应当显著影响二抗与桥接抗原的结合。同样理想地，二抗与桥接抗原的结合不会显著影响可检测的标记的可检测性。
在优选的实施方案中，桥接抗原的可检测的标记是荧光团。在更优选的实施方案中，桥接抗原的可检测的标记和二抗的可检测的标记均为荧光团。在其他优选的实施方案中，桥接抗原的可检测的标记和二抗的可检测的标记都可以通过相同波长的荧光检测。在另外优选的实施方案中，桥接抗原的可检测的标记和二抗的可检测的标记是相同的。
杂交试剂组合物对
如上所述，在一些方面中，本公开提供了杂交试剂组合物，其包含与桥接抗原偶联的寡核苷酸探针和对桥接抗原具有特异性的可检测的抗体。在这些组合物中，由于二抗对桥接抗原的高亲和力，可检测的抗体和缀合抗原的寡核苷酸探针是配对的。应当理解，当组合物的单独组分在水溶液中混合在一起时，例如当试剂在杂交测定中一起使用时，将形成配对组合物。
上文详细描述了包含寡核苷酸探针和偶联桥接抗原的杂交试剂，以及适用于本发明杂交试剂对的可检测的抗体。如本领域普通技术人员将理解的，包含这些组分的组合物可用于杂交测定的实践，所述杂交测定包括cish、fish等，单独的cish、fish与它们与其他诊断测定的组合，如ihc、细胞计数、流式细胞术(例如荧光激活细胞分选)、显微成像、预靶向成像和其他类型的体内肿瘤和组织成像、高内涵筛选(hcs)、免疫细胞化学(icc)、免疫磁性细胞消耗、免疫磁性细胞捕获、夹心测定、一般亲和测定、酶免疫测定(eia)、酶联免疫测定(elisa)、elispot、质谱流式细胞技术(cytof)、阵列(包括微球阵列、多重微球阵列、微阵列、抗体阵列、细胞阵列)、溶液相捕获、侧向层析测定、化学发光检测、红外检测、印迹法(包括western印迹、southwestern印迹、斑点印迹、组织印迹等)或者它们的组合。
多重杂交试剂对
根据另一方面，本公开提供了杂交试剂组合物，其包含与多个桥接抗原偶联的多种寡核苷酸探针和多种可检测的抗体。这些组合物中的每个桥接抗原偶联至不同的寡核苷酸探针，并且至少一种可检测的抗体以高亲和力结合每个桥接抗原。这些组合物中的多种抗原偶联的寡核苷酸探针和可检测的抗体可以是前面部分中描述的任何杂交试剂组合物对。
在具体实施方案中，组合物包含至少三种杂交试剂组合物对。在更具体的实施方案中，组合物包含至少五种杂交试剂组合物对。在更具体的实施方案中，组合物包含至少十种杂交试剂组合物对。在甚至更具体的实施方案中，组合物包含至少20、30、50、100或甚至更多种杂交试剂组合物对。
杂交试剂组
上述杂交试剂可以在预定义的组中组合以产生诊断组，该诊断中用于鉴定特定的基因组基因座或染色体模式或监测某些目的组织，特别是目的患病组织(例如肿瘤组织中)的遗传标志物的特异性组合的表达。这样的组在诊断测定中用于鉴定这样的患病组织，并且还可用作伴随诊断，其中在特定治疗方案的进程中，诊断组用于监测患病组织中的核酸标志物随时间的变化。这种伴随诊断提供对治疗方案的有效性的及时和可靠的评估，并且可以进一步允许针对特定患者优化治疗剂量和频率。如本领域已知的，使用当前原位杂交技术的靶组织的监测可能受限于每个组织切片的寡核苷酸探针的数量，或者可能需要分别地或依次用不同的寡核苷酸探针染色组织切片。与之相比，本文公开的杂交试剂组允许高水平的复用，使得可以在单个组织切片或其他样品中，利用大量寡核苷酸探针同时进行目的组织或其他样品的染色。
根据该方面，因此本发明提供了这样的杂交试剂组合物，其包含本公开的至少三种杂交试剂。在具体实施方案中，杂交试剂组合物包含如上文详细描述的本发明的至少5种、至少10种、至少15种、至少20种、至少30种、甚至更多种杂交试剂。
特别令人瞩目的是使用本发明的杂交试剂组在患者的组织样品中进行组织分析，该患者接受免疫治疗方案(例如在自身免疫性疾病和癌症患者的治疗中)的治疗。阻止检查点途径的最新进展，例如使用针对细胞毒性t淋巴细胞相关抗原-4(ctla-4、cd152)(例如，伊匹单抗)的抗体或靶向编程凋亡受体或其配体的抗体(pd-1或pd-l1)(例如，派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、pidilizumab等)已被证明是特别有效的。参见例如adams等(2015)naturerev.drugdiscov.14：603-22；mahoney等(2015)naturerev.drugdiscov.14：561-84；shin等(2015)curr.opin.immunol.33：23-35。
其他最近批准的抗癌剂靶向在肿瘤和其他疾病中上调或扩增的其他细胞表面蛋白或基因产物(参见例如，针对淋巴瘤细胞中cd20的利妥昔单抗、针对乳腺癌细胞中her2/neu的曲妥单抗、针对各种肿瘤细胞中egfr的西妥昔单抗、针对各种癌细胞和眼中vegf的贝伐珠单抗、以及针对骨中破骨细胞的地诺单抗)。因此，用这些试剂来对待治疗患者的组织样本进行的分析在临床医学中目前也得到了极大关注。
同样地，在用抗癌剂治疗之前或治疗期间从患者中获得的组织样品也可受益于分子谱图分析。例如，可以有利地通过使用本发明的免疫试剂组对组织(特别是患病组织)进行成像，从而监测用以下药物治疗的患者：伊马替尼、来那度诺、培美曲塞、硼替佐米、亮丙瑞林、醋酸阿比他酮、伊曲他滨、卡培他滨、埃罗替尼、依维莫司、西罗莫司、尼罗替尼、舒尼替尼、索拉非尼等。
本领域还报道了用于组织分子谱分析的方法和系统，包括免疫调节剂的分析，以及使用这些谱图来评估和监测疾病治疗。参见例如美国专利nos.8,700,335b2；8,768,629b2；8,831,890b2；8,880,350b2；8,914,239b2；9,053,224b2；9,058,418b2；9,064,045b2；9,092,392b2；；pct国际专利公开no.wo2015/116868。有利地使用合适的本发明杂交试剂的组进行此类方法。
示例性的杂交试剂组鉴定肿瘤细胞、免疫细胞以及各种疾病相关的遗传标志物的组合的表达，所述标志物包括以下标志物：
4-1bb、afp、alk1、淀粉样蛋白a、淀粉样蛋白p、雄激素受体、膜联蛋白a1、asma、bca225、bcl-1、bcl-2、bcl-6、berep4、β-连环蛋白、β-hcg、bg-8、bob-1、ca19-9、ca125、降血钙素、钙调蛋白结合蛋白、钙结合蛋白-1、钙视网膜蛋白、cam5.2、cd1a、cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd10、cd15、cd19、cd20、cd21、cd22、cd23、cd25、cd30、cd31、cd33、cd34、cd38、cd42b、cd43、cd45lca、cd45ro、cd56、cd57、cd61、cd68、cd79a、cd99、cd117、cd138、cd163、cdx2、cea、嗜铬粒蛋白a、cmv、c-kit、c-met、c-myc、iv型胶原、补体3c(c3c)、cox-2、cxcr5、ck1、ck5、ck6、ck7、ck8、ck14、ck18、ck17、ck19、ck20、ck903、ckae1、ckae1/ae3、d2-40、结蛋白、dog-1、e-钙粘着蛋白、egfr、ema、er、ercc1、因子viii-ra、因子xiiia、fascin、foxp1、foxp3、凝集素-3、gata-3、gcdfp-15、gcet1、gfap、血型糖蛋白a、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、粒酶b、hbme-1、幽门螺杆菌、血红蛋白a、heppar1、her2、hhv-8、hmb-45、hsvl/ll、icos、ifnγ、iga、igd、igg、igm、il17、il4、抑制素、inos、κig轻链、ki67、lag-3、λig轻链、溶菌酶、乳糖珠蛋白a、mart-1/melana、肥大细胞胰蛋白酶、mlh1、moc-31、mpo、msa、msh2、msh6、muc1、muc2、mum1、myod1、肌细胞生成素、肌红蛋白、天冬氨酸蛋白a、巢蛋白、nse、oct-2、ox40、ox40l、p16、p21、p27、p40、p53、p63、p504s、pax-5、pax-8、pd-1、pd-l1、phh3、pin-4、plap、pms2、卡氏肺孢子虫、pr、psa、psap、rcc、s-100、sma、smm、平滑肌特异性蛋白、sox10、sox11、表面活性剂载脂蛋白a、突触素蛋白、tag72、tdt、血栓调节蛋白、甲状腺球蛋白、tia-1、tim3、tracp、ttf-1、酪氨酸酶、尿溶蛋白、vegfr-2、绒毛蛋白、波形蛋白和wt-1。
优选地，所述试剂组鉴定一种或多种以下标志物的表达：cd4、cd8、cd20、cd68、pd-1、pd-l1、foxp3、sox10、粒酶b、cd3、cd163、il17、il4、ifnγ、cxcr5、foxp1、lag-3、tim3、cd34、ox40、ox40l、icos和4-1bb。
试剂组以试剂盒形式或独立提供的一组不同杂交试剂提供，用于下文详细描述的原位杂交方法中。特别地，试剂组以多重方法使用，其中样品与多个杂交试剂反应以用于同时检测。杂交试剂是任意上述杂交试剂，特别是这样的杂交试剂，其包括桥接抗原和与任意上述靶标遗传标志物互补的寡核苷酸探针，其中所述寡核苷酸探针和桥接抗原偶联，并且其中所述桥接抗原被高亲和力的可检测的抗体识别。
在具体实施方案中，试剂组鉴定遗传标志物的以下示例性组合的表达：
cd4、cd8、cd68和pd-l1；
cd4、cd8、foxp3和cd68(用于任何实体瘤)；
cd8、cd68、pd-l1加肿瘤相关标记(用于头颈部和胰腺肿瘤)；
sox10、cd8、pd-1和pd-l1(用于黑素瘤)；
cd4、cd8、cd20和细胞角蛋白(用于乳腺癌til)；
cd8、cd34、foxp3和pd-l1(用于黑素瘤免疫学)
cd8、cd34、pd-l1和foxp1(用于癌症免疫学)；
cd3、pd1、lag-3和tim3(用于t细胞耗竭)；
cd4和foxp3(用于treg)；
cd4和il17(用于th17)；
cd8和粒酶b(用于活化的cd8)；
cd4和cxcr5(用于tfh)；
cd4和il4(用于th2)；
cd4和ifng(用于th1)；
cd4、cd8、cd3和cd20(用于一般淋巴细胞)；
cd4、cd8、cd68和cd20(用于淋巴细胞和巨噬细胞)；
cd4、foxp3、cd8和cd20(用于treg和淋巴细胞)；
cd4、foxp3、cd8和粒酶b(用于treg和actctl)；
cd68(用于巨噬细胞)；
cd68和cd163(用于m2巨噬细胞)；
cd20(用于b细胞)；和
ox40、ox40l、icos和41bb(用于其他目的分子)。
原位杂交方法
在另一方面中，本公开提供了原位杂交方法，包括使杂交试剂与靶核酸反应，使可检测的抗体与杂交试剂反应，其中可检测的抗体以高亲和力结合杂交试剂的桥接抗原，并检测结合的可检测的抗体。这些方法中的杂交试剂和可检测的抗体可使用任何上述杂交试剂和任何可检测的抗体或任意合适的组合。
在一些实施方案中，检测方法是原位杂交方法。如上所述，原位杂交是广泛使用的技术，该技术频繁应用于诊断异常细胞，如肿瘤细胞。具体的遗传标志物的表达是特定肿瘤细胞(例如乳腺癌细胞)的特征。原位杂交测定也经常用于了解染色体标志物和差异表达的核酸标志物在生物组织的不同部位中的分布和定位。
在具体实施方案中，靶核酸存在于组织切片内。临床病理学领域的技术人员对组织切片内核酸的检测非常了解。甚至已经使用这些方法来鉴定单分子/单细胞水平下的完整细胞和组织中mrna的总拷贝数。参见例如raj等.(2008)naturemethods5:877；larson等.(2009)trendscellbiol.19:630；www.singlemoleculefish.com。应当理解，通常在固定过程后的固体组织样品可以被切片以便在样品的表面上暴露一种或多种目的靶核酸。连续组织切片的分析(即，在原始组织样品中彼此相邻或接近相邻的切片)能够使原始组织样本的三维模型重现，或增加靶核酸复用的能力，如下文将更详细描述的那样。在优选的实施方案中，第一靶核酸是肿瘤样品的组织切片内的靶核酸。
在其他具体实施方案中，通过该方法检测的核酸在细胞内或细胞上。例如，细胞计数领域的技术人员非常了解这种检测。在一些实施方案中，核酸可以在细胞的表面上。在其他实施方案中，核酸可以在细胞的细胞质中。在其他实施方案中，核酸可以在细胞的细胞核中。在一些实施方案中，核酸可以在细胞中的多于一个位置处。
根据上述方法分析的组织可以是任何合适的组织样品。例如，在一些实施例中，组织可以是结缔组织、肌肉组织、神经组织或上皮组织。同样，所分析的组织可以从任何目的器官获得。合适的组织的非限制性实例包括乳腺、结肠、卵巢、皮肤、胰腺、前列腺、肝脏、肾脏、心脏、淋巴系统、胃、脑、肺和血液。
在一些实施方案中，检测步骤是荧光检测步骤。上面详细描述了合适的荧光检测标记。
在一些实施方案中，检测方法还包括分选结合可检测的二抗的细胞的步骤。细胞分选是流式细胞技术领域中众所周知的技术。本领域提供了示例性的流式细胞术检测方法，例如，在practicalflowcytometry,4thed.,shapiro,wiley-liss,2003；handbookofflowcytometrymethods,robinson,ed.,wiley-liss,1993；和flowcytometryinclinicaldiagnosis,4thed.,careyetal.,eds,ascppress,2007中有所描述。在pct国际公开no.wo2013/188756和flor等chembiochem.15：267-75中描述了在定量多重免疫学测定中，特别是在定量流式细胞术测定中使用腙连接的抗体-寡核苷酸缀合物。
在一些实施方案中，杂交测定的方法包括在多重测定中使其他杂交试剂与另外的靶核酸反应，其中所述其他杂交试剂是与其他靶核酸互补的任何上述杂交试剂，使其他杂交试剂与其他可检测的抗体反应，其中所述其他可检测的抗体以高亲和力结合其他杂交试剂的桥接抗原，并检测结合的可检测的其他抗体。应当理解，如本领域普通技术人员将理解的，为了获得期望的结果，可以以任何合适的方式改变多重方法中的其他杂交试剂和抗体的反应顺序。在一些实施方案中，所有不同杂交试剂可以同时加入到含有多种靶核酸的靶样品中。在其他实施方案中，可以以任何顺序依次添加不同的杂交试剂。与二抗类似，可以以任何顺序同时或依次添加杂交试剂。在多重测定中，所述方法可以在单个测定中检测2、3、5、10、20、30、50、100或甚至更多种不同的靶核酸。如上面详细描述的，本发明的杂交试剂用于这种更高水平的多重杂交测定中的能力是本发明杂交试剂的主要优点。特别地，这些杂交试剂使得杂交测定具有精确的灵敏度、选择性和极低水平的背景信号。
在一些实施方案中，本发明的杂交测定方法包括对固定的组织样品的相邻或接近相邻切片的分析，以便增加对于给定组织样品可能的可检测的核酸的复用水平，或者重建样品的三维图像。例如，在一些实施方案中，所述方法还包括使第二杂交试剂与第二样品上的第二靶核酸反应的步骤。在这些方法中的一些方法中，第一样品和第二样品可以是组织样品的连续切片(即在样品中彼此相邻或几乎相邻的切片)，第二杂交试剂是上述与第二核酸互补的任何杂交试剂。所述方法还包括使第二可检测的抗体与第二杂交试剂反应的步骤，其中第二可检测的抗体对第二杂交试剂的桥接抗原具有高亲和力特异性，以及检测与第二杂交试剂的桥接抗原相关的第二可检测的抗体的步骤。
应当理解，鉴于目前的硬件和软件限制，给定组织样品的连续切片的杂交测定提供了显著增加的核酸检测复用。例如，尽管在此描述的杂交试剂和方法原则上由于桥接抗原和二抗的无限变化而允许无限多次复用，但是这种测定仍然受到当前可以在单个组织切片上利用可用的检测装置同时鉴别的荧光染料的数量的限制。然而，相同组织样品的连续切片可以用不同组的寡核苷酸探针进行染色，以通过在不同切片上重复使用相同的可检测的标记试剂组(例如荧光标记)，从而识别不同组的靶核酸。可检测的标记可以连接至用于标记第一样品切片的相同组的二抗，在这种情况下，将用与第一组寡核苷酸探针相同的一组桥接抗原标记第二组寡核苷酸探针。可选地和任选地，可检测的标记可以连接至用于标记第一样品切片的不同组二抗，在这种情况下，将用不同于第一组寡核苷酸探针的桥接抗原标记第二组寡核苷酸探针。
还将理解，给定组织样本的连续切片的杂交测定使得能够例如通过断层摄影技术而在第三维度中分析靶组织核酸，从而提供关于样品组织的整体结构的进一步信息。在一些实施方案中，第一样品和第二样品可以不是样品的连续切片，而是可以在原始组织内的空间中分离，从而提供关于第三维度中靶核酸的相对空间定位的更多信息。本领域普通技术人员将理解连续图像在重建三维组织结构中的应用。
在一些实施方案中，在每个样品上检测多种靶核酸。在具体实施方案中，在每个样品上检测至少两种靶核酸、至少三种靶核酸、至少五种靶核酸、至少十种靶核酸、至少15种靶核酸、至少25种靶核酸或甚至更多种靶核酸。在一些实施方案中，在至少三个样品、至少四个样品、至少五个样品、至少十个样品、至少15个样品、至少25个样品或甚至更多的样品上检测一种或多种靶核酸。
在另一方面，本公开提供了杂交测定方法，其中样品中的多种靶核酸通过利用包含桥接抗原的寡核苷酸探针进行初始处理，随后用对该桥接抗原具有特异性的反应性抗体进行连续处理，从而被标记。特别地，包含第一靶核酸和第二靶核酸的样品与第一靶核酸互补的第一杂交试剂和与第二靶核酸互补的第二杂交试剂反应，其中第一杂交试剂和第二杂交试剂是任何上述杂交试剂。第一杂交试剂与第一反应性抗体反应，其中第一反应性抗体以高亲和力结合第一杂交试剂的桥接抗原。然后通过使第一反应性抗体与第一可检测的试剂反应来突出第一核酸在样品中的位置，其中第一可检测的试剂因此与第一核酸附近的样品结合。然后，第一反应性抗体从样品中选择性解离，第二杂交试剂与第二反应性抗体反应，其中第二反应性抗体以高亲和力结合第二杂交试剂的桥接抗原。然后通过使第二反应性抗体与第二可检测的试剂反应来突出第二核酸在样品中的位置，其中第二可检测的试剂因此与第二核酸附近的样品结合。然后检测第一可检测的试剂和第二可检测的试剂，从而鉴定样品上第一靶核酸和第二靶核酸的位置。
在这些方法的具体实施方案中，第一反应性抗体和第二反应性抗体各自包含酶活性，更具体地包含过氧化物酶活性，例如辣根过氧化物酶活性。在其他具体实施方案中，第一可检测的试剂或第二可检测的试剂包含酪胺，或第一可检测的试剂和第二可检测的试剂各自包含酪胺。在其他具体实施方案中，第一可检测的试剂或第二可检测的试剂包含荧光团或发色团，或者第一可检测的试剂和第二可检测的试剂各自包含荧光团或发色团。
在优选的实施方案中，通过选择性处理将第一反应性抗体从样品中解离。具体而言，选择性处理可以从样品中解离出第一反应性抗体，而不使样品中的寡核苷酸探针解离。更具体而言，选择性处理可以包括用可溶性桥接抗原处理。这种处理可涉及使用相对高浓度的可溶性桥接抗原，例如至少1μm、至少10μm、至少100μm、至少1mm、至少10mm或甚至更高浓度的可溶性桥接抗原，如本领域普通技术人员将理解的那样。
还应当理解，在上述方法中，可以根据需要重复以下步骤多次，以便根据需要检测样品上尽可能多的靶核酸的位置：将样品中的反应性抗体解离，使其他杂交试剂与样品上的其他靶核酸反应，使其他反应性抗体与其他杂交试剂反应，并使其他反应性抗体与其他的可检测的试剂反应，从而使得其他可检测的试剂结合其他靶核酸附近的样品。在一些实施方案中，重复这些步骤，以便检测样品上至少三种靶核酸、至少四种靶核酸、至少五种靶核酸、至少十种靶核酸或甚至更多靶核酸的位置。
还应当理解，在这些测定方法中使用的步骤的顺序可以取决于所使用的特定反应条件，并且在一些情况下，额外的反应步骤也可能是完成测定所必需的。例如，如果使用非选择性方法(例如，加热、变性等)从样品中解离反应性抗体，则可能需要在测定中包括其他反应步骤。具体而言，如果解离条件也从样品中除去寡核苷酸探针，则在与其他反应性抗体和其他可检测的试剂反应之前，在该方法中可以包括与其他杂交试剂的进一步反应。换言之，新的杂交试剂与新的靶核酸的反应将被包括在用于每个靶核酸的方法中。然而，在优选的实施方案中，当反应性抗体被选择性解离时，可以在初始反应步骤中加入用于与所有所需靶核酸反应的所有所需杂交试剂，并且在随后的循环中仅加入反应性抗体。使用选择性处理从样品中解离反应性抗体使得严格处理(harshtreatment)对样品的损伤最小化，从而改善测定结果。
本公开的杂交试剂可有效地用于各种原位杂交检测方法，包括但不限于显色原位杂交(cish)、荧光原位杂交(fish)等，无论是单独还是其组合，并任选地与其他诊断测定组合，其他诊断测定例如为显微成像、预靶向成像和其他类型的体内肿瘤和组织成像、高内涵筛选(hcs)、免疫细胞化学(icc)、免疫磁性细胞消耗、免疫磁性细胞捕获、夹心测定、一般亲和测定、酶免疫测定(eia)、酶联免疫测定(elisa)、elispot、质谱流式细胞技术(cytof)、阵列(包括微球阵列、多重微球阵列、微阵列、抗体阵列、细胞阵列)、溶液相捕获、侧向层析测定、化学发光检测、红外检测、印迹法(包括western印迹、southwestern印迹、斑点印迹、组织印迹等)或者它们的组合。这些测定中各自均可以受益于使用本发明杂交试剂实现的高水平复用。
上述方法可用于研究和临床环境，但不限于此。它们可以用于诊断目的，包括预测性筛查和其他类型的预后测定，例如在诊断实验室环境或护理点测试中。本发明复用杂交技术也非常适用于高通量筛选。
在美国专利申请no.15/017,626和pct国际申请no.pct/us16/16913中示例了具有桥接抗原标记的一抗和可检测的抗桥接抗原二抗的组织切片的免疫组织化学染色，包括多重免疫组织化学染色。如本领域普通技术人员所理解的，这些技术可以适用于使用本公开的杂交试剂组合物的原位杂交测定。
制备方法
在另一方面中，本公开提供了制备抗原偶联杂交试剂(例如上述杂交试剂)的新方法。在一些实施方案中，所述方法包括使用化学偶联反应将寡核苷酸探针与桥接抗原偶联的步骤。在具体实施方案中，通过高效缀合部分偶联寡核苷酸探针和桥接抗原。在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：用第一缀合试剂修饰寡核苷酸探针，用第二缀合试剂修饰桥接抗原，以及使经修饰的寡核苷酸探针与经修饰的桥接抗原反应以产生抗原偶联的杂交试剂。在具体实施方案中，第一缀合试剂和第二缀合试剂以高效率彼此缔合。
高效率的含义是在缀合反应条件下完成寡核苷酸探针转化成抗原偶联的寡核苷酸探针的效率至少为50％、70％、90％、95％或99％。在一些实施方案中，在不超过0.5mg/ml、不超过0.2mg/ml、不超过0.1mg/ml、不超过0.05mg/ml、不超过0.02mg/ml、不超过0.01mg/ml，甚至更低的蛋白质浓度的条件下实现这些效率。
在制备方法中采用的有用寡核苷酸探针和桥接抗原包括上述的任何寡核苷酸探针和桥接抗原。根据期望的结果选择第一缀合试剂和第二缀合试剂。特别地，能够与氨基或硫醇基团进行特异性和选择性反应的高效缀合试剂在氨基或硫醇基修饰的寡核苷酸探针和含有氨基或硫醇基的桥接抗原的修饰中是特别有用的。此外，选择能够以高效率进行彼此缔合的第一缀合试剂和第二缀合试剂，从而在一些上述抗原偶联杂交试剂中产生高效缀合部分。
如上所述，所得到的缀合部分可以是共价部分或非共价部分，并且相应地选择用于制备经修饰的寡核苷酸探针和经修饰的桥接抗原的第一和第二缀合试剂。例如，在非共价缀合部分的情况下，第一缀合试剂优选包含选择性反应性基团，以将试剂连接到寡核苷酸的特定反应性残基和缀合对的第一组分。同样地，第二缀合试剂优选包括选择性反应性基团，以将试剂连接到桥接抗原的特定反应性残基和缀合对的第二组分。缀合对的第一和第二组分能够以高效率彼此非共价结合，从而产生抗原偶联的杂交试剂。
如前所述，非共价缀合部分的实例包括寡核苷酸杂交对和蛋白质-配体结合对。在寡核苷酸杂交对的情况下，例如，寡核苷酸探针将与包含杂交对的一个成员的第一缀合试剂反应，桥接抗原将与包含杂交对的第二成员的第二缀合试剂反应。因此，经修饰的寡核苷酸探针和经修饰的桥接抗原可以彼此混合，并且杂交对的两个成员的缔合产生高效缀合部分。
同样地，当蛋白-配体结合对用于产生抗原偶联杂交试剂的非共价缀合部分时，寡核苷酸与包含蛋白-配体对中的一个或另一个的第一缀合试剂反应并且桥接抗原与包含蛋白-配体对的互补成员的第二缀合试剂反应。然后将如此修饰的寡核苷酸和桥接抗原彼此混合以产生高效缀合部分。
如上所述，高效共价缀合部分的实例包括腙、肟、其他席夫碱以及任意各种点击反应的产物。用于形成高效缀合部分的示例性肼基、氧基氨基和羰基缀合试剂在美国专利no.7,102,024中有说明，并且它们可适用于本发明的反应方法。如其中所述，肼部分可以是脂肪族、芳香族或杂芳族肼、氨基脲、卡巴肼、酰肼、氨基硫脲、硫代卡巴肼、碳酸二肼或羧酸肼基团。羰基部分可以是能够与一个或多个上述肼或氧氨基部分形成肼或肟键的任何含羰基基团。优选的羰基部分包括醛和酮。在本发明的方法中用作缀合试剂的这些试剂中的一些的活化剂可以商购获得，例如来自solulink，inc.(sandiego，ca)和jenabiosciencegmbh(jena，germany)。在一些实施方案中，在寡核苷酸或桥接抗原合成期间，例如在固相合成反应期间，可将试剂掺入寡核苷酸或桥接抗原中。
在美国专利nos.6,686,461；7173125；和7,999,098中描述了将肼、氧基氨基和羰基类单体引入用于固定化和其他缀合反应的寡核苷酸中的方法。在美国专利no.6,800,728中描述了用于生物分子的缀合和固定的肼基和羰基的双功能交联试剂。在pct国际公开no.wo2012/071428中描述了在各种检测测定和其他应用中使用高效双芳基-腙接头来形成寡核苷酸缀合物。以上参考文献的全部内容各自通过引用并入本文。
在一些实施方案中，使用新的缀合试剂和条件制备本公开的杂交试剂。例如，可以以如下方案1所示制备可用于制备抗原偶联杂交试剂的硫醇反应性马来酰亚胺氧基氨基(moa)缀合试剂：
可以以如下方案2所示制备氨基反应性氧基氨基偶联试剂(aoa)：
如合成化学领域的普通技术人员将理解的，可以使用上述反应方案的变体制备可替代的硫醇反应性和氨基反应性缀合试剂。这些替代试剂应被认为在本文公开的制备方法的范围内。
使用上述含有含氧氨基的试剂中的一种或另一种进行修饰的寡核苷酸和桥接抗原可有效地与本身用含羰基试剂(例如芳族醛，如甲酰基苯甲酸酯基)进行修饰的互补寡核苷酸或桥接抗原进行反应。方案3和4中显示了这种缀合反应的可替代实例，其中r1和r2基团独立地表示寡核苷酸探针或桥接抗原。
应当理解，寡核苷酸探针和桥接抗原上的形成缀合部分的基团的不同成员的相对取向通常被认为是不重要的，只要这些基团能够彼此反应以形成高效缀合部分即可。换言之，在方案3和4的实施例中，r1基团可以是寡核苷酸探针，r2基团可以是桥接抗原，或者r1基团可以是桥接抗原，r2基团可以是寡核苷酸探针。对于所有上述缀合对，无论是共价还是非共价，通常也是如此。
上述缀合方法提供了优于传统交联方法的几个优点，例如使用双官能交联剂的方法。特别地，反应是特异的、有效的和稳定的。特异的是指副反应(例如共结合反应)不会发生或发生在极低的水平。有效是指即使在低试剂浓度下，反应也会完成或接近完成，从而产生化学计量或接近化学计量的量的产物。所形成的缀合部分的稳定是指得到的杂交试剂可以用于各种目的，而不用担心缀合产物在使用过程中会离解。在一些情况下，上述缀合方法的进一步的优点是可以通过光谱监测缀合反应的进程，因为在一些反应中，当反应发生时形成发色团。
腙连接的阿霉素/单克隆抗体缀合物的合成和稳定性在kaneko等(1991)bioconj.chem.2：133-41中有所描述。一系列芳族酰肼、肼和氨基硫脲的合成和蛋白质修饰性质在美国专利nos.5,206,370；5,420,285；和5,753,520中有所描述。在美国专利no.8,541,555中描述了缀合延伸的肼化合物和荧光肼化合物的产生。
美国专利申请no.15/017,626和pct国际申请no.pct/us16/16913举例说明了桥接抗原标记的一抗的制备。如本领域普通技术人员所理解的，类似的方法可用于制备本发明的杂交试剂。
诊断试剂盒
在另一方面中，本公开提供用于诊断或研究目的的杂交测定中的试剂盒。诊断试剂盒包括本公开的一种或多种杂交试剂，以及用于杂交测定的说明书。在一些实施方案中，试剂盒还包含二抗，例如对于杂交试剂的桥接抗原具有高亲和力特异性的二抗。此外，应当理解，本发明试剂盒中包含的杂交试剂通常将包含针对特定遗传标志物的寡核苷酸探针，使得试剂盒可用于杂交测定以鉴定特定基因组基因座或染色体模式或监测组织样品中、细胞悬浮液中、其他表面上或其他培养基中的一种或多种遗传标志物的表达。
在另外的实施方案中，试剂盒可以包含其他组分，例如各种组合物的缓冲液，以使得该试剂盒能够使用用于染色细胞或组织；和细胞复染色剂，以使样品形态可视化。试剂盒可以以各种形式提供并且包括部分或全部上述组分，或者可以包括此处未列出的附加组分。
通过参考美国专利申请no.15/017,626和pct国际申请no.pct/us16/16913将理解本发明的其他方面。
本文提及的所有专利、专利出版物和其他公开的参考文献通过引用整体并入本文作为参考，就如同各自已经通过引用单独地和专门地并入本文那样。
虽然已经提供了具体的实施例，但是上述描述是示例性的而不是限制性的。先前描述的实施方案中的任何一个或多个特征可以以任何方式与本发明中的任何其他实施方案的一个或多个特征组合。此外，本发明的许多变化对于本领域技术人员在阅读说明书后将变得显而易见。因此，本发明的范围应通过参考所附权利要求及其等同方式的全部范围来确定。