用于微管蛋白β-3链(TUBB3)蛋白的SRM/MRM测定的制作方法

背景技术：

用一些治疗剂对癌症进行治疗，这些治疗剂以多种方式起作用以杀死正在生长和分裂的细胞。一组常见的化学治疗剂已经使用了数十年，无论是单独使用还是组合使用，并已成为临床肿瘤学实践中的传统和常规癌症治疗方法。这些药物通常通过杀死所有快速分裂的细胞而起作用，快速分裂是大多数癌细胞的主要特性之一。然而，这些试剂也杀死正在生长的正常细胞，因此并不被认为是杀死癌细胞的“靶向”方法。近年来，已经开发了大量癌症疗法，其特异性地仅针对癌细胞，其中治疗剂特异性攻击仅由癌细胞而非正常细胞表达的蛋白质。该方法被认为是癌症治疗的“靶向”方法。最近，另一种以“靶向”方式杀死癌细胞的方法是特异性调节免疫系统，以增强癌症患者免疫系统杀死癌细胞的能力。

靶向微管蛋白β-3链(“tubb3”)的治疗剂在早期临床试验中显示出前景。然而，只有癌细胞表达大量tubb3蛋白的患者最有可能从这些tubb3靶向治疗剂的治疗中受益。本文描述的方法提供基于定量蛋白质组学的测定，其递送tubb3信号途径的活化的相关测量，这是因为tubb3通常不在正常组织和/或正常上皮细胞中表达。特别地，该方法提供质谱测定，其定量来自癌症患者的福尔马林固定组织中的tubb3，并且进一步使得能够改善癌症治疗的治疗决策。

提供了衍生自tubb3的亚序列的特定肽。该肽的肽序列和片段化/跃迁离子(transitionion)可用于基于质谱的选择反应监测(srm)测定，其也可称为多反应监测(mrm)测定，并且在本文中称为srm/mrm。描述了该肽用于tubb3蛋白的srm/mrm定量分析的用途。

该srm/mrm测定可用于测量来自tubb3蛋白的特定肽的相对或绝对定量水平，并提供通过质谱测量从生物样品获得的给定蛋白质制剂中tubb3蛋白的量的方法。

更具体地，srm/mrm测定可以直接测量从患者组织样品(例如福尔马林固定的癌症患者组织)中获得的细胞制备的复杂蛋白质裂解物样品中的肽。从福尔马林固定的组织制备蛋白质样品的方法描述于美国专利no.7,473,532中，其内容通过引用整体并入本文。美国专利no.7,473,532中描述的方法可以方便地使用得自expressionpathologyinc.(rockville，md)的liquidtissue试剂和方案进行。

来自癌症患者的组织的最广泛可用形式是福尔马林固定石蜡包埋的组织。手术切除的组织的甲醛/福尔马林固定是迄今为止全世界范围内保存癌组织样品的最常用方法，并且是标准病理学实践的公认惯例。甲醛水溶液称为福尔马林。“100％”福尔马林由在水中的饱和甲醛溶液(约40体积％或37质量％)组成，和少量稳定剂(通常为甲醇)以限制氧化和聚合度。保存组织的最常见方式是将整个组织长时间(8小时至48小时)浸泡在甲醛水溶液，通常称为10％中性缓冲福尔马林中，然后将固定的整个组织包埋在石蜡中，在室温下长期储存。因此，分析福尔马林固定癌组织的分子分析方法可用于分析癌症患者组织。

来自srm/mrm测定的结果可用于关联患者或受试者的特定组织样品(例如，癌症组织样品)中的tubb3蛋白的准确和精确定量水平，所述组织(生物样品)从所述患者和受试者中收集并保存。这不仅提供关于癌症的诊断信息，而且还允许医师或其他医疗专业人员确定对患者的适当治疗。这种提供关于患病组织或其他患者样品中蛋白质表达水平的诊断和治疗重要信息的测定被称为伴随诊断测定(companiondiagnosticassay)。例如，可以设计这样的测定以诊断癌症的阶段或程度并确定患者最可能响应的治疗剂。

技术实现要素：

本发明提供了测定福尔马林固定组织的人生物样品中人tubb3蛋白水平的方法，包括检测并有利地使用质谱定量从人生物样品制备的蛋白质消化物中tubb3片段肽的量；并计算样品中tubb3蛋白的水平；其中tubb3片段肽是seqidno：1，并且其中所述水平是相对水平或绝对水平。可以在检测和/或定量tubb3片段肽的量之前分离(fractionate)蛋白质消化物。所述蛋白质消化物可以含有蛋白酶消化物，而所述组织可以是石蜡包埋组织，例如从肿瘤获得的组织。

可以通过比较一种生物样品中tubb3片段肽的量与其他独立生物样品中相同tubb3片段肽的量来定量tubb3片段肽。还可以通过与已知量的添加内标肽进行比较来定量tubb3片段肽，其中将生物样品中的tubb3片段肽与具有相同氨基酸序列的内标肽进行比较；并且所述内标肽是同位素标记的肽。

检测和/或定量蛋白质消化物中tubb3片段肽的量可用于指示存在修饰的或未修饰的tubb3蛋白以及与受试者体内癌症的关联。检测和/或定量tubb3片段肽的量的结果或tubb3蛋白的水平可以与癌症的诊断阶段/等级/状态相关联。将所述检测和/或定量所述tubb3片段肽的量的结果或所述tubb3蛋白的水平与癌症的诊断阶段/等级/状态相关联可以与以多重形式检测和/或定量其他蛋白质或来自其他蛋白质的肽的量相结合，以提供关于癌症的诊断阶段/等级/状态的额外信息。

在如上所述测量人tubb3的水平后，所述生物样品获自其的患者可以用治疗有效量的治疗剂进行治疗，其中所述治疗剂和/或治疗剂的施用量基于所述tubb3片段肽的量或tubb3蛋白的水平。所述治疗剂可以例如结合tubb3蛋白和/或抑制其生物活性。

还提供了治疗患有癌症的患者的方法，包括定量从患者获得的肿瘤样品制备的蛋白质消化物中特定tubb3片段肽(例如seqidno：1的肽)的水平，并且使用质谱通过选择反应监测计算所述样品中tubb3肽的水平，将所述tubb3片段肽的水平与参考水平进行比较，以及或者(i)当tubb3片段肽的水平低于所述参考水平时，用基于紫杉烷的化疗方案治疗患者；或者(ii)当tubb3片段肽的水平高于所述参考水平时，用不含有效量紫杉烷的治疗方案治疗患者。所述参考水平可以是例如700amol/μg+/-250amol/μg，+/-150amol/μg，+/-100amol/μg，+/-50amol/μg或者+/-25amol/μg的被分析的生物样品蛋白。所述生物样品的蛋白质消化物可以通过liquidtissue方案制备，并且可以包含蛋白酶消化物，例如胰蛋白酶消化物。

所述患有癌症的患者可能患有胃癌，当tubb3水平低于截止值(cutoff)时，所述患者可以用folfiri进行治疗，然后用多西紫杉醇(docetaxel)和顺铂(cisplatin，cddp)进行治疗，或者当tubb3水平高于截止值时，可以用folfiri或5-fu加亚叶酸(folimicacid)(甲酰四氢叶酸(leucovorin))治疗。

所述患有癌症的患者可能患有三阴性乳腺癌，当tubb3水平低于截止值时，可以用act(蒽环类(anthracycline)和环磷酰胺(cytoxan)，随后是是紫杉烷(taxane))进行治疗，或者当tubb3水平高于截止值时，可以用cmf(环磷酰胺、甲氨蝶呤(methotrexate)和5-fu)进行治疗。

在任何这些方法中，质谱可以是串联质谱、离子阱质谱、三重四极杆质谱、maldi-tof质谱、maldi质谱、混合离子阱/四极杆质谱和/或飞行时间质谱。所用的质谱模式可以是选择反应监测(selectedreactionmonitoring，srm)、多重反应监测(multiplereactionmonitoring，mrm)和/或多重选择反应监测(multipleselectedreactionmonitoring，msrm)。

在上述治疗方法中，所述肿瘤样品可以是细胞、细胞集合或实体组织，并且可以是福尔马林固定的实体组织，包括石蜡包埋组织。此外，检测和定量特定tubb3片段肽可以与多重检测和定量来自其他蛋白质的其他肽相组合，使得关于使用哪种药剂进行治疗的治疗决策是基于生物样品中特定tubb3片段肽与其他肽/蛋白质的特定水平。

简要附图说明

图1显示对于tubb3水平高于确定的截止值(＞700amol/μg)的患者，胃癌患者的中位总生存期(overallsurvial，os)显著短于截止值以下的患者(＜700amol/μg)(1566天对比801天，p＝0.0282)。

图2显示对于用folfiru接着用5-fu加亚叶酸(甲酰四氢叶酸)进行治疗的患者，在确定的tubb3截止值(＞700amol/μg)以上和以下的胃癌患者的os差异很小。

图3显示对于用folfiri接着用多西紫杉醇(泰索帝(taxotere))和顺铂(cddp)进行治疗的患者相比用folfiru接着用5-fu加亚叶酸(甲酰四氢叶酸)的患者，在确定的tubb3截止值(＞700amol/μg)以上的胃癌患者的os存在显著差异。

图4显示在700amol/μg的截止tubb3水平以上和以下，用act(蒽环类和环磷酰胺，随后是紫杉烷)治疗的三阴性乳腺癌患者的无复发生存期(relapse-freesurvival，rfs)差异。

图5显示在850amol/μg的截止tubb3水平以上和以下，用act(蒽环类和环磷酰胺，随后是紫杉烷)治疗的三阴性乳腺癌患者的无复发生存期(rfs)差异。

图6显示在930amol/μg的截止tubb3水平以上和以下，用act(蒽环类和环磷酰胺，随后是紫杉烷)治疗的三阴性乳腺癌患者的无复发生存期(rfs)差异。

图7显示了在930amol/μg的截止tubb3水平以上和以下，用act(蒽环类和环磷酰胺，随后是紫杉烷)治疗的三阴性乳腺癌患者的os差异。

具体实施方式

本文所述的测定法测量来自tubb3蛋白的特定未修饰肽的相对或绝对水平。tubb3蛋白的相对定量水平可以通过srm/mrm方法确定，例如，通过比较不同样品中单个tubb3肽的srm/mrm特征峰面积(signaturepeak)(例如，特征峰面积或积分片段离子强度(integratedfragmentionintensity))。另外一种方式，可以比较多个tubb3特征肽的多个srm/mrm特征峰区域，其中每种肽具有其自己的特异性srm/mrm特征峰，以确定一种生物样品中的相对tubb3蛋白含量，并将其与一种或多种另外或不同生物样品中的tubb3蛋白含量进行比较。以这种方式，相对于相同的实验条件下横跨两种或更多种生物样品中相同的一种或多种tubb3肽，确定来自tubb3蛋白的一种或多种特定肽的量，以及由此tubb3蛋白的量。此外，通过srm/mrm方法将该肽的特征峰面积与来自生物样品的相同蛋白质制剂中的来自不同的一种或多种蛋白的另一种或多种不同肽的特征峰面积进行比较，可以确定单个样品中来自tubb3蛋白的一种或多种特定肽的相对定量。以这种方式，来自tubb3蛋白的特定肽的量以及由此tubb3蛋白的量在相同样品中相对于彼此确定。

这些方法产生相对于样品间和样品内的另一种或多种肽的量的来自tubb3蛋白的单一或多种肽的定量，其中通过特征峰面积确定的量是相对于彼此的，而无论来自生物样品的蛋白质制剂中tubb3肽的绝对重量对体积或重量对重量的量。将关于不同样品之间的独立特征峰面积的相对定量数据归一化至每个样品经分析的蛋白量。可以在单个样品中和/或在许多样品中同时对来自多种蛋白质和tubb3蛋白的许多肽进行相对定量，以获得对一种肽/蛋白质相对于其他肽/蛋白质的相对蛋白量的了解。

tubb3蛋白的绝对定量水平可以通过例如srm/mrm方法确定，其中将来自一个生物样品中的tubb3蛋白的单个肽的srm/mrm特征峰面积与掺入的内标的srm/mrm特征峰面积进行比较。在一个实施方案中，所述内标是相同的tubb3肽的合成形式，其含有用一种或更多种重同位素标记的一个或更多个氨基酸残基。可以合成同位素标记的内标，使得质谱分析产生可预测且一致的srm/mrm特征色谱峰，其与天然tubb3肽特征峰不同且有区别，并因此可用作比较物峰。因此，当内标以已知量掺入来自生物样品的蛋白质制剂并通过质谱分析时，将天然肽的srm/mrm特征峰面积与内标肽的srm/mrm特征峰面积进行比较，该数值比较表明来自生物样品的原始蛋白质制剂中存在的天然肽的绝对摩尔浓度和/或绝对重量。根据每个样品经分析的蛋白量显示片段肽的绝对定量数据。可以在单个样品中和/或在许多样品中同时对多种肽并由此多种蛋白进行绝对定量，以深入了解单个生物样品和整个单个样品组中的绝对蛋白量。

srm/mrm测定方法可用于例如直接在患者来源的组织诸如福尔马林固定组织中帮助诊断癌症阶段，并用于帮助确定哪种治疗剂最有利于用于治疗该患者。或者通过手术例如治疗性切除部分或整个肿瘤，或者通过用于确定是否存在疑似疾病的活组织检查程序而从患者体内取出的癌组织经分析以确定特定一种或多种蛋白质以及哪种形式的蛋白质存在于该患者组织中。此外，可以确定一种蛋白质或多种蛋白质的表达水平，并与健康组织中发现的“正常”或参考水平进行比较。在健康组织中发现的蛋白质的正常或参考水平可以源自例如一个或更多个没有癌症的个体的相关组织。另外一种方式，通过分析未受癌症影响的相关组织，可以获得患有癌症的个体的正常或参考水平。

蛋白质水平(例如，tubb3水平)的测定也可用于诊断经采用tubb3水平诊断患有癌症的患者或受试者的癌症阶段。单个tubb3肽的水平定义为通过srm/mrm测定法测定的每经分析蛋白质裂解物总量中的肽摩尔量。因此，关于tubb3的信息可用于通过将tubb3蛋白(或tubb3蛋白的片段肽)的水平与正常组织中观察到的水平相关联来帮助确定癌症的阶段或等级。一旦在癌细胞中确定了tubb3蛋白的定量，就可以将该信息与被开发用于特异性治疗癌症组织的治疗剂(化学性和生物性治疗剂)列表相匹配，所述癌症组织的特征在于测定的一种或多种蛋白质或蛋白质(例如tubb3)的异常表达。

通过测量从患者获得的福尔马林固定肿瘤组织样品中的tubb3水平并将测量水平与预定的截止水平进行比较，也提供了改进的癌症治疗方法。当测量的tubb3水平低于预定截止值时，患者用包括基于紫杉烷的治疗剂的治疗方案进行治疗。当测量的tubb3水平高于截止值时，施用替代治疗方案，如下文更详细描述。有利地，替代治疗方案不含基于紫杉烷的治疗剂。提供了治疗胃癌和三阴性乳腺癌的改进方法。

将来自tubb3蛋白测定的信息与特异性靶向例如tubb3蛋白或表达该蛋白的细胞/组织的治疗剂列表相匹配，定义了所谓的用于治疗疾病的个性化医学方法。本文描述的测定方法通过使用来自患者自身组织的蛋白质分析作为诊断和治疗决策的来源而形成个性化医学方法的基础。

原则上，例如通过用已知特异性蛋白酶(例如胰蛋白酶)消化而制备的任何源自tubb3蛋白的预测肽可用作替代报道分子(surrogatereporter)，以使用基于质谱的srm/mrm测定来确定样品中tubb3蛋白的丰度。然而，出乎意料的是，已发现来自tubb3蛋白的许多潜在肽序列不适合或无效用于基于质谱的srm/mrm测定，其原因不是很清楚。对于衍生自福尔马林固定组织的肽尤其如此。由于无法预测最适合mrm/srm测定的肽，因此有必要在实际的liquidtissue裂解液通过实验鉴定肽，以开发用于tubb3蛋白的可靠且准确的srm/mrm测定。虽然不希望受任何理论的束缚，但据信一些肽可能例如难以通过质谱检测，因为它们不能很好地电离或产生不同于其他蛋白质的片段。肽在分离(例如液相色谱)中也可能不能很好地分辨，或者可能粘附在玻璃或塑料制品上。

tubb3片段肽可以通过多种方法产生，包括使用美国专利7,473,532中提供的liquidtissue方案。所述liquidtissue方案和试剂能够通过蛋白水解消化组织/生物样品中的蛋白质，从福尔马林固定的石蜡包埋组织产生适合于质谱分析的肽样品。在liquidtissue方案中，将组织/生物在缓冲液中加热较长一段时间(例如，从约80℃至约100℃持续约10分钟至约4小时的一段时间)以逆转或释放蛋白质交联。使用的缓冲液是中性缓冲液(例如，基于tris的缓冲液，或含有去污剂的缓冲液)。热处理后，用一种或多种蛋白酶包括但不限于胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和内切蛋白酶lys-c来处理组织/生物样品足够的时间，从而破坏所述生物样品的组织和细胞结构并液化所述样品(例如，在37℃至65℃的温度下30分钟至24小时的一段时间)。加热和蛋白水解的结果是液体、可溶、可稀释的生物分子裂解物。

通过由从福尔马林固定癌组织获得的细胞制备的复杂liquidtissue裂解物中的所有蛋白质的蛋白酶消化，以下描述的tubb3肽衍生自tubb3蛋白。除非另有说明，否则在每种情况下蛋白酶都是胰蛋白酶。然后通过质谱分析liquidtissue裂解物，以通过质谱检测和分析确定源自tubb3蛋白的那些肽。用于质谱分析的特定优选肽子集的鉴定基于：1)通过实验确定来自蛋白质的哪一种或多种肽在liquidtissue裂解物的质谱分析中离子化，以及2)在制备liquidtissue裂解物中使用的方案和实验条件下肽存活的能力。

使用liquidtissue试剂和方案制备直接从福尔马林(甲醛)固定组织获得的细胞的蛋白质裂解物，其需要通过组织显微切割将细胞收集到样品管中，然后在liquidtissue缓冲液中加热细胞一段较长的时间。一旦福尔马林诱导的交联受到负面影响，然后使用蛋白酶例如胰蛋白酶(尽管可以使用其他蛋白酶)以可预测的方式将组织/细胞消化完毕。通过用蛋白酶消化完整多肽，将每种蛋白质裂解物转化为肽集合。分析每种liquidtissue裂解物(例如，通过离子阱质谱)以对肽进行多个全局蛋白质组学调查，其中数据呈现为可以通过质谱能从每种蛋白质裂解物中存在的所有细胞蛋白质鉴定的多种肽的鉴定。使用离子阱质谱仪或另一种形式的质谱仪，其能够进行全局分析以从单一复杂蛋白质/肽裂解物中鉴定尽可能多的肽。然而，离子阱质谱仪可以有利地用于进行肽的全局分析。尽管可以在任何类型的质谱仪，包括maldi、离子阱或三重四极杆质谱仪上开发和执行srm/mrm测定，但有利地是将三重四极杆仪器平台用于srm/mrm测定。这种类型的质谱仪是用于分析非常复杂的蛋白质裂解物中的单个分离的靶肽的合适仪器，所述蛋白质裂解物可以由来自细胞内包含的所有蛋白质的数十万至数百万个单个肽组成。

一旦在所采用条件下在单个裂解物的单次ms分析中鉴定出尽可能多的肽，则对该肽列表进行整理并用于确定在该裂解物中检测到的蛋白质。对多个liquidtissue裂解物重复该过程，并将非常大的肽列表整理成单个数据集。可以认为该类型的数据集代表了可以在经分析的生物样品类型中检测到的肽(在蛋白酶消化后)，特别是在生物样品的liquidtissue裂解物中，因此包括特定蛋白质例如tubb3蛋白的一种或多种肽。

在一个实施方案中，鉴定为可用于测定tubb3蛋白的绝对或相对量的tubb3胰蛋白酶解肽是seqidno：1的肽。在由福尔马林固定石蜡包埋的组织制备的liquidtissue裂解物中通过质谱检测该肽。该肽可用于人生物样品中，包括直接在福尔马林固定的患者组织中tubb3蛋白的定量srm/mrm测定。

seqidno：1isvyyneasshk

从多种不同的人体器官包括肺、结肠和乳腺的福尔马林固定组织的多个liquidtissue裂解物中检测到该tubb3胰蛋白酶解肽。该肽可用于福尔马林固定组织中tubb3蛋白的定量srm/mrm测定。进一步的数据分析表明没有观察到来自任何特定器官位点的任何特定肽的偏好。因此，seqidno：1的肽适用于在来自任何生物样品或来自体内任何器官部位的任何福尔马林固定组织的liquidtissue裂解物上进行tubb3蛋白的srm/mrm测定。

为了最有效地实施seqidno：1的肽的srm/mrm测定，期望在分析中利用除肽序列之外的信息。该附加信息可用于指导和指示质谱仪(例如三重四极杆质谱仪)以执行特定目标肽的正确的聚焦分析，从而可以有效地进行测定。

关于特定tubb3肽的额外信息可包括肽的单同位素质量、其前体电荷状态、前体m/z值、m/z跃迁离子(transitionion)和每种跃迁离子的离子类型中的一种或更多种。下表显示了可用于开发针对tubb3蛋白的使用seqidno：1的肽的srm/mrm测定的其他肽信息。

下述方法用于：1)鉴定来自tubb3蛋白的候选肽，其可用于针对tubb3蛋白的基于质谱的srb/mrm测定，2)开发针对来自tubb3蛋白的靶肽的单独的srm/mrm测定或多个测定以便进行关联，和3)将定量测定应用于癌症诊断和/或最佳疗法的选择。

测定方法

1.针对tubb3蛋白的srm/mrm候选片段肽的鉴定

a.使用一种或多种蛋白酶(可能包括或不包括胰蛋白酶)以消化蛋白质从福尔马林固定的生物样品中制备liquidtissue蛋白裂解物

b.在离子阱串联质谱仪上分析liquidtissue裂解液中的所有蛋白质片段，并鉴定来自tubb3蛋白的所有片段肽，其中单个片段肽不含任何肽修饰，如磷酸化或糖基化

c.在离子阱串联质谱仪上分析liquidtissue裂解液中的所有蛋白质片段，并鉴定来自tubb3蛋白的携带肽修饰例如磷酸化或糖基化残基的所有片段肽

d.可能可以测量通过特定消化方法从整个全长tubb3蛋白产生的所有肽，但是用于开发srm/mrm测定的优选肽是通过质谱直接在由福尔马林固定的生物样品制备的复杂liquidtissue蛋白裂解物中鉴定的那些肽

e.在患者组织中被特异性修饰(磷酸化，糖基化等)，并且当分析来自福尔马林固定的生物样品的liquidtissue裂解物时，在质谱仪中电离并因此被检测的肽被鉴定为用于测定tubb3蛋白的肽修饰的候选肽

2.来自tubb3蛋白的片段肽的质谱测定

a.针对liquidtissue裂解液中鉴定的单个片段肽的三重四极杆质谱仪上的srm/mrm测定被应用于来自tubb3蛋白的肽

i.确定片段肽的最佳保留时间，以获得最佳色谱条件，包括但不限于凝胶电泳、液相色谱、毛细管电泳、纳米反相液相色谱、高效液相色谱或反相高效液相色谱

ii.确定肽的单同位素质量、每种肽的前体电荷状态、每种肽的前体m/z值、每种肽的m/z跃迁离子，以及每种片段肽的每种跃迁离子的离子类型，以为了开发针对每种肽的srm/mrm测定

iii.然后可以使用来自(i)和(ii)的信息在三重四极杆质谱仪上进行srm/mrm测定，其中每个肽具有特征性且独特的srm/mrm特征峰，其精确定义了在三重四极杆质谱仪上进行的独特srm/mrm测定

b.执行srm/mrm分析，从而检测到的tubb3蛋白片段肽的量，作为srm/mrm质谱分析的独特srm/mrm特征峰面积的函数，可以指示特定蛋白质裂解物中的蛋白质的相对和绝对量

i.相对定量可以通过以下实现：

1.通过将来自一个福尔马林固定的生物样品的tissuelysate裂解物中检测到的给定tubb3肽的srm/mrm特征峰面积与来自至少第二、第三、第四或更多福尔马林固定的生物样品的至少第二、第三、第四或更多tissuelysate裂解物中的相同tubb3片段肽的相同srm/mrm特征峰面积进行比较来确定tubb3蛋白存在的增加或减少

2.通过将来自一个福尔马林固定的生物样品的tissuelysate裂解物中检测到的给定tubb3肽的srm/mrm特征峰面积与来自其他独立生物来源的其他样品中来自其他蛋白质的片段肽的srm/mrm特征峰区域进行比较来确定tubb3蛋白存在的增加或减少，其中2个样品之间肽片段的srm/mrm特征峰面积比较归一化至每个样品中经分析的蛋白质的量

3.通过将来自福尔马林固定的生物样品的相同tissuelysate裂解物中的给定tubb3肽的srm/mrm特征峰面积与衍生自不同蛋白质的其他片段肽的srm/mrm特征峰面积进行比较来确定tubb3蛋白存在的增加或减少，以为了将tubb3蛋白的变化水平归一化至在各种细胞条件下其表达水平不变的其他蛋白质的水平

4.这些测定可以应用于tubb3蛋白的未修饰的片段肽和修饰的片段肽，其中所述修饰包括但不限于磷酸化和/或糖基化，并且其中修饰肽的相对水平以与确定未修饰肽的相对量相同的方式进行确定

ii.通过将单个生物样品中来自tubb3蛋白的给定片段肽的srm/mrm特征峰面积与掺入来自生物样品的蛋白裂解物的片段肽内标的srm/mrm特征峰面积进行比较可以实现给定肽的绝对定量。

1.所述内标是来自正在被查询(interrogated)的tubb3蛋白的片段肽的标记合成形式。将该标准品以已知量掺入样品中，并且可以分别测定生物样品中内部片段肽标准品和天然片段肽的srm/mrm特征峰面积，然后比较两个峰面积

2.这可以应用于未修饰的片段肽和修饰的片段肽，其中所述修饰包括但不限于磷酸化和/或糖基化，并且其中可以以与确定未修饰肽的绝对水平相同的方式测定修饰肽的绝对水平

3.将片段肽定量应用于癌症诊断和治疗

a.对tubb3蛋白的片段肽水平进行相对和/或绝对定量，并证明了如在癌症领域中所理解的，先前确定的tubb3蛋白表达与患者肿瘤组织中癌症的阶段/等级/状态之间的关联得以确认

b.对tubb3蛋白的片段肽水平进行相对和/或绝对定量，并证明了与不同治疗策略的临床结果的相关性，其中这种相关性已经在该领域得到证实，或者可以在将来通过患者群体和来自那些患者的组织的相关性研究来证明。一旦先前建立的相关性或将来得出的相关性通过该测定确认，那么测定方法可用于确定最佳治疗策略

通过分析离子阱和三重四极杆质谱仪上的所有tubb3肽，开发了特定tubb3肽的特异性和独特特征。该信息包括肽的单同位素质量、其前体电荷状态、前体m/z值、前体的跃迁m/z值，以及每种鉴定的跃迁的离子类型。对于每一种候选srm/mrm肽必须直接在来自福尔马林固定样品/组织的liquidtissue裂解物中通过实验确定该信息；因为，有趣的是，并非所有来自tubb3蛋白的肽都可以使用如本文所述的srm/mrm在这样的裂解物中检测到，这表明未检测到的tubb3肽不能被认为是用于开发用于直接在来自福尔马林固定样品/组织的liquidtissue裂解物中定量肽/蛋白质的srm/mrm测定的候选肽。

在三重四极杆质谱仪上进行特定tubb3肽的特定srm/mrm测定。通过特定tubb3srm/mrm测定分析的实验样品例如是由已经福尔马林固定并且石蜡包埋的组织制备的liquidtissue蛋白裂解物。来自诸如测定的数据表明在福尔马林固定的样品中存在该tubb3肽的独特srm/mrm特征峰。

该肽的特定跃迁离子特征用于定量测量福尔马林固定的生物样品中的特定tubb3肽。这些数据表明该tubb3肽的绝对量是每微克所分析的蛋白质裂解物中肽摩尔量的函数。基于福尔马林固定患者来源组织的分析，对组织中tubb3蛋白水平的评估可以提供关于每个特定患者的诊断、预后和治疗相关信息。在一个实施方案中，本公开描述了用于测量生物样品中微管蛋白β-3链蛋白(tubb3)水平的方法，包括使用质谱检测和/或定量从生物样品制备的蛋白质消化物中tubb3片段肽的量；并计算样品中tubb3蛋白的水平；并且其中所述水平是相对水平或绝对水平。在相关实施方案中，定量tubb3片段肽包括通过与已知量的添加的内标肽比较来确定生物样品中tubb3片段肽的量，其中所述内标肽具有相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述内标是同位素标记的内标肽，其包含选自由¹⁸o、¹⁷o、³⁴s、¹⁵n、¹³c、²h或其组合的一种或更多种重稳定同位素。

本文所述测量生物样品中tubb3蛋白水平的方法(或作为其替代物的片段肽)可用作患者或受试者中癌症的诊断指示剂。在一个实施方案中，通过将组织中发现的tubb3蛋白水平与正常和/或癌症或癌前组织中发现的蛋白水平相关联(例如，比较)，tubb3蛋白水平测量的结果可用于确定癌症的诊断阶段/等级/状态。

技术人员将认识到，紫杉烷类药剂(taxaneagents)也可以用作包括另外的药物或药物组合的治疗方案的一部分。患者肿瘤样品中tubb3的水平通常以amol/μg表示，但也可以使用其他单位。技术人员将认识到参考水平可以表示为中心值附近的范围，例如+/-250、150、100、50或25amol/μg。在下面详细描述的第一个胃癌的具体实例中，发现tubb3蛋白的合适参考水平为700amol/μg。在第二个三阴性乳腺癌的实例中，也发现截止值是700amol/μg，尽管发现850和930amol/μg的截止值也具有统计学意义。然而，技术人员将认识到，可以基于临床结果和经验选择高于或低于这些参考水平的水平。

提供了改进的治疗方法，其中当tubb3水平低于预定参考水平时用基于紫杉烷的治疗剂治疗患者，以及当tubb3水平高于预定参考水平时用替代方案治疗患者。在胃癌的情况下，如下所述，当tubb3水平低于截止值时，患者可以用诸如folfiri，随后多西紫杉醇(泰索帝)和顺铂(cddp)的方案进行治疗，相比当tubb3水平高于截止值时，用folfiri或5-fu加亚叶酸(甲酰四氢叶酸)。在三阴性乳腺癌的情况下，当tubb3水平低于截止值时，患者可以用act(蒽环类和环磷酰胺，随后紫杉烷)进行治疗，而当tubb3水平高于截止值时，患者可以用cmf(环磷酰胺、甲氨蝶呤和5-fu)治疗。

因为可以从相同的liquidtissue生物分子制剂分析核酸和蛋白质，所以可以从蛋白质被分析的相同样品中的核酸产生关于疾病诊断和药物治疗决策的额外信息。例如，如果tubb3蛋白由某些细胞以增加的水平表达，则当通过srm测定时，数据可以提供关于细胞状态及其不受控制的生长的潜力、最佳治疗的选择和潜在耐药性的信息。同时，可以从存在于相同liquidtissue生物分子制剂中的核酸获得关于基因和/或核酸和它们编码的蛋白质的状态的信息(例如，mrna分子及其表达水平或剪接变异)。可以在蛋白质，包括tubb3蛋白的srm分析同时评估核酸。在一个实施方案中，可以通过检查编码那些蛋白质的核酸来评估关于tubb3蛋白和/或一种、两种、三种、四种或更多种其他蛋白质的信息。例如，可以通过以下中的一种或更多种、两种或更多种或者三种或更多种来检查那些核酸：测序方法，聚合酶链式反应方法，限制性片段多态性分析，缺失、插入的鉴定和/或确定包括但不限于单碱基对多态性、转换，颠换或其组合的突变的存在。

tubb3的蛋白质组学分析预测多西紫杉醇治疗胃部根治性腺癌的益处：重新评估itaca-s试验的样本

在itaca-s试验中，患有可切除的胃或胃食管连接部腺癌的患者被随机分配到folfiri(伊立替康180mg/m²第1天，lv100mg/m²2小时输注和5-fu400mg/m²推注，第1天和第2天，随后600mg/m²/天22小时连续输注，q14进行4个周期)，随后多西紫杉醇75mg/m²第1天，顺铂75mg/m²第1天，q21持续3个周期(顺序组(sequentialarm))或degramont治疗方案(5-fu/lv组)。该试验的初步结论是，更加强化的治疗方案对比单药治疗未能显示出无疾病和os的任何益处。见annoncol.25：1373-8(2014)。

以下描述的分析显示出使用上述基于质谱(ms)的蛋白质组学测定表明iii类β-微管蛋白(tubb3)蛋白的低表达或无表达预示着用基于紫杉烷的疗法进行治疗的患者的存活率提高。

根据基于ms的tubb3蛋白组学测定的lod，建立tubb3在700amol/μg的截止值，作为基于紫杉烷的疗法的单一预测生物标志物。接受基于紫杉烷的化疗(itaca-s试验)的转移性胃癌患者的预测生物标志物截止值在临床上得到验证。

接受基于紫杉烷的化疗的转移性胃癌患者(itaca-s试验)的前瞻性-回顾性tubb3截止值已在临床上得到验证。tubb3水平高于确定的截止值(＞700amol/μg)的患者的中位总生存期(medianoverallsurvival，os)显著短于截止值以下的患者(＜700amol/μg)(1566天对比801天，p＝0.0282)。见图1。

有趣的是，发现与紫杉烷组患者相比，未接受基于紫杉烷的化疗治疗时，tubb3＞700amol/μg的患者具有显著更长的os(1991天对比801天，p＝0.0480)。与5-fu/lv组患者相比，tubb3＜700amol/μg的患者从基于紫杉烷的化疗中获益(1556天对比1227天)。见图2和3。

tubb3的蛋白质组学分析预测act治疗三阴性乳腺癌的益处：

三阴性乳腺癌(tnbc)是一种异质性疾病，与其他乳腺癌类型相比，具有侵袭性临床过程和增加的局部复发率和远处转移率。joensuuetal，annoncol，23suppl6：p.vi40-5(2012)。通常建议全身化疗以防止疾病复发，但是，虽然已经鉴定了许多化学疗法生物标志物，但筛选不是常规的，并且化学疗法方案未被调整以考虑个体肿瘤生物学。根据个体肿瘤的生物学特征鉴别哪些患者对治疗有反应的能力可确保提供最有效的治疗方法，同时使患者免于不必要的毒性。

以下描述的方法使用定量蛋白质组学方法显示肿瘤分子谱与使用标准治疗(act：多柔比星、环磷酰胺(cyclophosphamide)，随后多西紫杉醇(docetaxel))治疗的tnbc患者(n＝97)之间的关联。

方法：来自tnbc患者(n＝97)的福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)组织块的显微切割肿瘤区域进行liquid消化和蛋白质组学分析。使用多重srm-ms测定来定量包括tubb3在内的多种蛋白质的水平。kaplan-meier分析用于获得预测辅助治疗后存活益处的最佳蛋白质表达阈值。

结果：在97个患者样品中的69个(71％)中通过靶向蛋白质组学可检测到

tubb3，并测量到了8.8倍的表达范围(700-6161.7amol/μg)。tubb3的高蛋白表达(tubb3＞930amol/μg)与较短的总体存活(os)和较差的无复发存活期(relapse-freesurvival，rfs)相关。在tubb3低表达的患者(tubb3＜930amol/μg)中，rfs和总生存期(os)在统计学上显著更好。数据显示截止值为700amol/μg，尽管850和930amol/μg的截止值也被发现具有统计学意义。见图4-7。

tubb3的广泛表达范围表明某些疗法基于生物标志物表达具有不同的应答率。此处显示的结果表明，通过测量tubb3的蛋白质表达提供了改进的治疗方法，并且tubb3是用act治疗的tnbc患者对基于紫杉烷的疗法的抗性的预测标志物。