REP蛋白作为蛋白质抗原用于诊断试验的制作方法
本发明涉及dna复制相关的(rep)蛋白或抗rep抗体的检测和定量用于诊断神经退行性疾病，诸如例如多发性硬化症(ms)。具体地，本发明涉及msbi1基因组编码的rep蛋白。
多发性硬化症(ms)的病因学尚未得到解决。因此，需要ms的生物标志物，其可以用来诊断ms和/或监测ms或治疗ms和/或评估ms的易感性。
多发性硬化症(ms)的特点是损害大脑和脊髓中的神经细胞的ms病变的脱髓鞘作用。ms症状或作为突然恶化的发作(复发、加重、偶发、突发)发生，或作为随时间的逐渐恶化(进行性)而发生。脱髓鞘启动炎症过程，其触发t细胞以及细胞因子和抗体的释放。采用神经影像学、分析脑脊液和诱发电位等用于ms的诊断。
从不同的测试材料中分离出17种不同但部分相关的dna分子的谱。(multiplesclerosis(ms)braintissue,bovinesera,milk)(funk,gunstetal.2014,gunst,zurhausenetal.2014,lamberto,gunstetal.2014,whitley,gunstetal.2014)。
在这些分离物中，与传染性海绵状脑病(tse)关联的分离物sphinx1.76(1,758bp；登记号hq444404，(manuelidisl.2011))紧密相关的两种dna分子是从ms患者的脑组织中分离的。这些分离物为msbi1.176(msbi，多发性硬化脑分离物)(1,766bp)和msbi2.176(1,766bp)，分别命名为“msbi1基因组”和“msbi2基因组”。msbi1,176与sphinx1.76的序列具有98％的核苷酸相似性。这些分离物的大型开放阅读框(orfs)编码假定的dna复制蛋白，它们之间具有高度相似性。另一个常见特征是存在重复子样串联重复。该重复区域的排列表明了单核苷酸核心中的变异。该重复子样重复可构成rep蛋白的结合位点。这些分离物的序列已经以登记号lk931491(msbi1.176)和lk931492(msbi2.176)(whitleyc.etal.2014)保存在embl数据库中，并已经在wo2016/005064中进行了比对和描述。
从牛乳中得到其他分离物。这些牛乳分离物(cmi)为cmi1.252、cmi2.214和cmi3.168，分别命名为“cmi1基因组”、“cmi2基因组”和“cmi3基因组”。这些分离物的序列已经以登记号lk931487(cmi1.252)、lk931488(cmi2.214)和lk931489(cmi3.168)保存在embl数据库中，并已经在wo2016/005064中进行了比对和描述。
本发明人已发现，msbi1基因组示出了转录的rna的大量生产，且msbi1基因组编码的rep蛋白在人类细胞中表达。本发明人已发现，msbi1和msbi2基因组编码的rep蛋白(msbi1rep和msbi2rep)代表了用于致病性筛选试验的生物标志物。作为dna复制相关的蛋白(repb)，rep蛋白具有dna结合活性，且对于启动游离或病毒dna分子的复制可以是必不可少的。根据本发明，结构上类似于msbi1基因组编码的rep的rep蛋白示出了显著的自寡聚化和聚集潜力，其在体内和体外的原核系统中均有描述。(giraldo,moreno-diazdelaespinaetal.2011,torreira,moreno-delalamoetal.2015)。
本发明提供了基于使用作为抗原的rep蛋白的病原特异性、诊断性筛选试验的平台。
在某些实施方式中，由于分离的dna(例如msbi1)试剂的致病活性与rep蛋白表达的联系，因而使用抗rep抗体作为病原性标志物。患者血清中抗rep抗体含量的增加表明，相应的患者肯定在足以启动rep特异性免疫响应的足够长的时间段内暴露于与rep相关的蛋白或自身表达的rep。作为人抗体的靶点，rep蛋白用作抗原。根据抗rep抗体的量的定量，可以诊断或监测急性ms以及ms的易感性。因为已经认识到，样本中诱导的抗rep抗体或表达的rep蛋白的量的增加表明了ms的发生和/或状态，因此可以分别使用抗rep抗体和rep蛋白的量的增加作为诊断ms的病原性生物标志物。
有利地，可以在血液样本(诸如血清或血浆样本)中检测到ms的病原性生物标志物，而不需要从脑脊液中获得样本。
因此，本发明提供了dna复制相关的(rep)蛋白，用于诊断神经退行性疾病，例如多发性硬化症(ms)。在某些实施方式中，rep蛋白由msbi1基因组编码，并包括(i)如seqidno:1所示的氨基酸序列；
(ii)能够与特异于包括如seqidno:1所示的氨基酸序列的蛋白质的抗rep抗体结合的seqidno:1的片段；或
(iii)具有与(i)或(ii)的氨基酸序列90％或更高同源性，并且能够与特异于包括如seqidno:1所示的氨基酸序列的蛋白质的抗rep抗体结合的氨基酸序列。
在其他实施方式中，rep蛋白由msbi2基因组编码，并包括(i)如seqidno:8所示的氨基酸序列；
(ii)能够与特异于包括如seqidno:8所示的氨基酸序列的蛋白质的抗rep抗体结合的seqidno:8的片段；或
(iii)具有与(i)或(ii)的氨基酸序列90％或更高同源性，并且能够与特异于包括如seqidno:8所示的氨基酸序列的蛋白质的抗rep抗体结合的氨基酸序列。
在其他实施方式中，rep蛋白由cmi1基因组编码，并包括(i)如seqidno:10所示的氨基酸序列；
(ii)能够与特异于包括如seqidno:10所示的氨基酸序列的蛋白质的抗rep抗体结合的seqidno:10的片段；或
(iii)具有与(i)或(ii)的氨基酸序列90％或更高同源性，并且能够与特异于包括如seqidno:10所示的氨基酸序列的蛋白质的抗rep抗体结合的氨基酸序列。
在其他实施方式中，rep蛋白由cmi2基因组编码，并包括(i)如seqidno:11所示的氨基酸序列；
(ii)能够与特异于包括如seqidno:11所示的氨基酸序列的蛋白质的抗rep抗体结合的seqidno:11的片段；或
(iii)具有与(i)或(ii)的氨基酸序列90％或更高同源性，并且能够与特异于包括如seqidno:11所示的氨基酸序列的蛋白质的抗rep抗体结合的氨基酸序列。
在其他实施方式中，rep蛋白由cmi3基因组编码，并包括(i)如seqidno:12所示的氨基酸序列；
(ii)能够与特异于包括如seqidno:12所示的氨基酸序列的蛋白质的抗rep抗体结合的seqidno:12的片段；或
(iii)具有与(i)或(ii)的氨基酸序列90％或更高同源性，并且能够与特异于包括如seqidno:12所示的氨基酸序列的蛋白质的抗rep抗体结合的氨基酸序列。
在某些实施方式中，与对照样品中的rep蛋白量相比，受试者样品中rep蛋白的量的增加与神经退行性疾病例如ms的诊断相关，即指示ms。根据本发明，通过与对照样品相比rep蛋白的量增加，为至少2倍，来指示神经退行性疾病例如ms的诊断或神经退行性疾病例如ms的易感性。
在其他实施方式中，与对照样品中的抗rep抗体量相比，受试者样品中抗rep抗体的量的增加与神经退行性疾病例如ms的诊断相关，即指示ms。根据本发明，通过与对照样品相比抗rep抗体的量增加，为至少2倍，来指示神经退行性疾病例如ms的诊断或神经退行性疾病例如ms的易感性。
本发明的rep蛋白几乎可以用于使用已知抗原来检测抗体或细胞介导的免疫响应的任何测试形式。因此，本发明还包括检测对rep蛋白的细胞介导免疫响应，例如t细胞免疫响应。
在某些实施方式中，本发明提供了在受试者中诊断神经退行性疾病的方法，包括以下步骤
(a)将来自受试者的样本与rep蛋白一起温育；
(b)检测受试者样本中与rep蛋白形成免疫复合物的抗体的量；以及
(c)将相比于对照样本中的量与rep蛋白结合的抗体的量与神经退行性疾病的诊断相关联。
在特定实施方式中，本发明提供了在受试者中诊断ms的方法，包括以下步骤
(a)将来自受试者的样本与rep蛋白一起温育；
(b)检测受试者样本中与rep蛋白形成免疫复合物的抗体的量；以及
(c)将相比于对照样本中的量与rep蛋白结合的抗体的量与ms的诊断相关联。
在特定实施方式中，rep蛋白是固定化的，例如附连到支撑物或载体上，然后将固定化的rep蛋白与来自受试者的样本一起温育。
在其他实施方式中，在细胞中表达rep蛋白，然后将这些细胞与来自受试者的样本一起温育。
在某些实施方式中，与rep蛋白形成免疫复合物的抗体的量通过连接有信号产生化合物的能够与该免疫复合物的抗rep抗体结合的额外的结合剂来量化，例如可检测的标记的二级抗体，优选地抗人抗体。
在其他实施方式中，将来自受试者的样本中的抗体固定化，然后与规定量的rep蛋白一起温育。
优选地，来自受试者的样本和对照样本为血液样本，诸如血清或血浆样本。
在其他实施方式中，本发明提供了在患者中诊断神经退行性疾病的方法，包括以下步骤
(a)通过抗rep抗体检测来自受试者的样本中的rep蛋白的量，以及
(b)将相比于对照样本中的量的在步骤(a)中在来自受试者的样本中检测到的rep蛋白的量与神经退行性疾病的诊断相关联。
在某些实施方式中，本发明提供了在患者中诊断ms的方法，包括以下步骤：
(a)通过抗rep抗体检测来自受试者的样本中的rep蛋白的量，以及
(b)将相比于对照样本中的量的在步骤(a)中在来自受试者的样本中检测到的rep蛋白的量与ms的诊断相关联。
在这样的实施方式中，来自受试者的样本和对照样本选自由血清样本、血浆样本或组织样本组成的组。
在特定实施方式中，抗rep抗体与在选自由seqidno:1的从1至136、从137至229以及从230至324的氨基酸组成的组的氨基酸序列内的表位结合。例如，抗体与seqidno:2或seqidno:3所包括的表位结合。
在其他实施方式中，本发明提供了用于诊断ms的试剂盒，包括(a)rep蛋白，特别是msbi1、msbi2、cmi1、cmi2或cmi3rep蛋白，(b)连接有信号产生化合物的额外的结合剂，例如连接有可检测的标签并且能够与根据本发明的抗rep抗体结合的抗人抗体，和(c)适合于固定化根据(a)的rep蛋白或抗rep抗体的固体基质，其中，在样本中特别是血清或血浆样本中怀疑有辅助抗体。
在特定实施方式中，将试剂盒放在一起用于免疫分析，例如选自由酶联免疫吸附试验(elisa)、放射免疫试验(ria)、酶免疫试验(eia)、荧光免疫试验(fia)、发光免疫试验(lia)和条带试验组成的组。
附图说明
图1示出了通过血清温育1d尺寸分辨的rep蛋白膜条带的2×8个样本的血清筛选的实例。将包含rep蛋白的硝化纤维素条带分别与ms血清样本组库或健康供体血浆组库的两种不同的血清/血浆稀释液(1:500和1:2000)一起温育。用抗人igg连接hrp的二级抗体检测rep结合的人igg。通过密度测定法量化在全长rep蛋白靶点的尺寸上的抗体信号(参考右侧的coomassie蛋白染色和抗repwb对照)。
图2示出了基于elisa筛选的rep特异性血清响应的定量。每96孔检测到50、100、200、400或800ngrep蛋白(靶抗原)。在封闭并洗涤之后，将rep蛋白抗原与合并的ms血清样本或者合并的对照血浆样本以1:500的稀释度在室温(rt)下温育6h。在洗涤并与连接hrp的抗人igghrp二级抗体温育以及最后的洗涤之后，通过tmb底物反应和在450nm处的吸光度测定来对rep结合的人igg的存在进行定量。定量表明信号强度与rep蛋白(抗原)的量有良好的相关性。平均而言，ms组库的信号强度水平超过对照组库的强度，至少1.9倍。通常，基于elisa的血清筛查表明了对于至少1:1000(数据未示出)的血清稀释度的可检测的血清抗体，因此该实验的滴度很可能大于1:1000，在1:2000-1:4000的区域中，或在平台优化后甚至更大。
图3示出了基于elisa筛选的rep特异性血清响应的定量。每96孔检测到200ngrep蛋白(靶抗原)。在封闭并洗涤之后，将rep蛋白抗原与7个个体ms血清或者7个个体对照血清一式两份以1:500的稀释度在室温(rt)下温育6h。在洗涤并与连接有hrp的抗人igghrp二级抗体温育以及最后的洗涤之后，通过tmb底物反应和在450nm处的吸光度测定来对rep结合的人igg的存在进行定量。ms样本的平均强度超过对照血清的平均强度，至少8倍，一些ms样本显示为平均对照强度的10-16倍。
图4至6示出了通过使用在y坐标上标出的抗rep抗体a、b、c、d1和d2获得的免疫荧光图像数据。
图7示出了westernblot分析，其中a、b、c和d1标出了所使用的抗rep抗体的组。
图8示出了“优化的”(＝seqidno:13)与“原始的”(＝野生型；seqidno:15)msbi1序列的序列比对。对优化后的密码子进行了标记。
本发明提供了作为致病标志物的抗rep抗体的存在的诊断筛选试验。样本中抗rep抗体含量的增加表明，相应的受试者肯定在足以诱导rep蛋白特异性免疫响应的足够长的时间段内暴露于与rep相关的蛋白或自身表达的rep蛋白。通过这样的筛选分析，可以进行基于抗rep抗体的定量的对ms的诊断、预后和监测。在可替代的实施方式中，可以通过抗rep抗体直接在样本中检测和定量rep蛋白。
本文使用的“rep蛋白”是指dna复制相关的蛋白(repb)。rep蛋白包括dna结合活性，且对于启动游离/病毒dna分子的复制可以是必不可少的。通常，rep蛋白是指来自小sphinx基因组的组的rep蛋白(whitleyetal.,2014)。特别地，rep蛋白为msbi1基因组编码的rep蛋白(msbi1rep)、msbi2基因组编码的rep蛋白(msbi2rep)、cmi1基因组编码的rep蛋白(cmi1rep)、cmi2基因组编码的rep蛋白(cmi2rep)或cmi3基因组编码的rep蛋白(cmi3rep)。优选地，msbi1rep蛋白由以登记号lk931491保存在embl数据库中的msbi1.176编码，且具有如seqidno:1所示的氨基酸序列，或者rep蛋白是msbi2，由以登记号lk931492保存在embl数据库中的msbi2.176编码，且具有如seqidno:8所示的氨基酸序列(whitley,gunstetal.2014)。在另一优选的实施方式中，cmi1rep蛋白由以登记号lk931487保存在embl数据库中的cmi1.252编码，且具有如seqidno:10所示的氨基酸序列。在另一优选的实施方式中，cmi2rep蛋白由以登记号lk931488保存在embl数据库中的cmi2.214编码，且具有如seqidno:11所示的氨基酸序列。在另一优选的实施方式中，cmi3rep蛋白由以登记号lk931489保存在embl数据库中的cmi3.168编码，且具有如seqidno:12所示的氨基酸序列。在特定的优选实施方式中，rep蛋白包括在小sphinx基因组中保守的n-末端区，基本上由seqidno:1的从1至229的氨基酸组成，以及对msbi1.176有特异性的c-末端可变区，基本上由seqidno:1的从230至324的氨基酸组成。n-末端保守区包括基本上由seqidno:1的从1至136的氨基酸组成的假定的第一dna结合结构域，和基本上由seqidno:1的从137至229的氨基酸组成的第二假定的dna结合结构域。
“rep蛋白”还包括具有seqidno:1或seqidno:8的蛋白的片段和变体，其能够结合对具有seqidno:1或seqidno:8的氨基酸序列的rep蛋白有特异性的抗rep抗体。优选地，这样的片段是具有seqidno:1或seqidno:8的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段，其包括针对抗seqidno:1或seqidno:8的rep蛋白的抗-rep蛋白抗体的至少一个表位，且优选地包括至少7、8、9、10、15、20、25或50个连续的氨基酸。在特定的实施方式中，片段包括或基本上由rep蛋白的结构域组成，例如，n-末端保守区、c-末端可变区、第一或第二dna结合结构域。具有seqidno:1或seqidno:8的蛋白质的变体包括与seqidno:1相比一个或多个氨基酸的删除、替换或增加，且具有与seqidno:1或seqidno:8的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性，其中，变体能够结合对具有seqidno:1或seqidno:8的氨基酸序列的rep蛋白有特异性的抗rep抗体。变体的定义包括，例如包含氨基酸的一种或多种类似物的多肽(包括，例如非天然氨基酸、肽核酸(pna)等)、具有替换的键的多肽以及本技术中已知的天然存在和非天然存在的其他修改。术语rep蛋白包括具有异种氨基酸序列、具有前导序列或具有标签序列等的融合蛋白。在本发明的某些实施方式中，蛋白质标签被遗传地转移到上述rep蛋白上，例如选自由msbi1、msbi2、cmi1、cmi2或cmi3组成的组的rep蛋白。特别地，至少一个蛋白标签附接到由如seqidnos:1-3、8-12、14中的任何一个所示的氨基酸序列组成的多肽上。这样的蛋白标签可以通过化学试剂或通过酶的方法去除。蛋白标签的实例有用于纯化的亲和标签或色谱标签。例如，rep蛋白可以与例如选自由his6-标签(seqidno:4)、t7-标签(seqidno:5)、flag-标签(seqidno:6)和strep-ii-标签(seqidno:7)、his-标签(seqidno:4)、t7-标签(seqidno:5)、flag-标签(seqidno:6)或strepii-标签(seqidno:7)组成的组的标签序列融合。此外，可以将诸如绿色荧光蛋白(gfp)或其变体的荧光标签附连到根据本发明的rep蛋白上。
在特定的优选实施方式中，msbi1基因组编码的rep蛋白(msbi1rep)是为在人细胞系(例如，hek-293、hek293tt、hek293t、hek293ft、hacat、hela、siha、caski、hdmec、l1236、l428、bjab、mcf7、colo678、任何原代细胞系)以及牛(例如mac-t)或小鼠细胞系(例如gt1-7)中生产而经密码子优化的。关于密码子优化，可以将编码抗原的核苷酸序列设计为使用在将要产生抗原的受试者的基因中所使用的密码子。在优选的实施方式中，所使用的密码子是“人源化的”密码子。这样的密码子使用可提供抗原在人细胞中的高效表达。可以使用任何合适的密码子优化方法。这样的方法和对这样的方法的选择是本领域技术人员熟知的。根据本发明，msbi1基因组编码的rep蛋白(msbi1rep)的这样的密码子优化的变体包括或具有seqid.no.:13所示的序列，并包括或具有seqid.no.:14所示的序列。总共在编码rep蛋白的927个核苷酸msbi1rep基因(从起始到终止密码子)中有686个核苷酸被替换，以改善密码子使用。具有对例如人密码子使用最佳的适应的完美密码子使用通过密码子适应指数(cai)为1来描述，表示所有密码子都为人表达而优化。对于原始msbi1编码的rep基因，计算对人系统的cai为0,67，其远远低于被认为是良好密码子适应的较低阈值的0,8的cai。在msbi1rep基因的密码子优化之后，计算优化的dna的cai为0,94，表明对人系统为几乎最佳密码子适应。特别地，对18个极少使用的密码子进行了修改，其中大多数代表在人系统中使用频率非常低(＜10％)的编码亮氨酸的密码子。在图8中示出了seqidno:13的密码子优化的msbi1序列与seqidno:15的野生型msbi1序列的序列比对。
本发明的rep蛋白，包括如上定义的rep片段和rep变体，可以通过经典化学合成来制备。合成可以在均相溶液中或在固相中进行。根据本发明的多肽还可以借助重组dna技术来制备。根据本发明生产和纯化rep蛋白的实例在实施例1中示出。
如本文所用，“受试者”是指哺乳动物个体或患者，包括鼠、家畜例如牛、猿猴和人类。优选地，受试者为人类患者。
如本文所用，“样本”是指包括液体和固体样本的生物样本。液体样本包括血液液体，诸如例如血清、血浆和脑脊液(csf)。固体样本包括组织样本，诸如组织培养物或活检标本。
如本文所用，“相关联”是指抗rep抗体和rep蛋白的量，即水平或滴度，分别与例如ms的疾病状态显著相关。该相关性通过检测来自待测试受试者的样本和对照样本中存在的量的差异程度来确定。“对照样本”意为单个样本或各种即多于两个对照样本的平均值。对照取自未被诊断为ms的健康个体。可替代地，该相关性可以通过用预先确定的截止值检测待测试受试者的样本中存在的量的差异程度来理论地确定。截止值是指在不同疾病状态之间，例如健康状态和患病状态之间，具有统计学显著分离的参考值。截止值可以通过使用本领域已知的统计测试对足够大的组的来自有病史的患者的测试样本和来自健康测试组的样本进行统计分析来确定。
在某些实施方式中，对例如ms的诊断，通过与对照样本相比在来自受试者的样本中蛋白质即rep蛋白和抗rep抗体的量增加，各自至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍或1000倍来指示。
如本文所用，“抗rep抗体”是指在本发明的方法中以可检测水平与rep蛋白结合的抗体，该抗体与本发明的rep蛋白的亲和力比与非rep蛋白的更强。优选地，rep蛋白的抗原亲和力是背景结合的至少2倍。特别地，抗rep抗体对具有seqidno:1的氨基酸序列的msbi1rep或msbi2rep有特异性。在特定的实施方式中，抗体对msbi1rep、msbi2rep、cmi1rep、cmi2rep和/或cmi3rep有交叉特异性。在某些实施方式中，抗rep抗体对msbi1rep、msbi2rep、cmi1rep、cmi2rep和/或cmi3rep中的至少两个优选地全部有交叉特异性，并与seqidno:1的从1至136的氨基酸内的表位结合。
所有试验的一个共同特征是，rep蛋白与怀疑包含抗rep蛋白抗体的样本在允许rep蛋白与样本中存在的任何这样的抗体结合的条件下相接触。这样的条件典型地是生理温度、ph值和离子强度，使用过量的rep蛋白。将rep蛋白与样本温育，然后检测包括抗原的免疫复合物。在某些实施方式中，rep蛋白与信号产生化合物(例如可检测的标签)连接，或者连接有信号产生化合物的额外的结合剂(例如二级抗人抗体)被用于检测免疫复合物。
在基于rep蛋白作为蛋白抗原的试验中，可以对抗rep抗体进行检测和定量，其中rep蛋白充当样品中疑似存在的哺乳动物(例如人类)抗体的靶点。优选地，rep蛋白是纯化的(例如，参见实施例1)，且样本可以是例如血清或血浆样本。该方法包括将rep蛋白固定在基质上，然后将固定化的rep蛋白与样品温育。最后，通过与连接有信号产生化合物的检测结合剂，例如允许基于hrp底物定量的二级hrp(辣根过氧化物酶)结合的检测抗体，对样本的rep蛋白与抗体之间形成的免疫复合物的rep结合的抗体进行定量。该信号产生化合物或标签本身是可检测的，或可与额外的化合物反应以生成可检测的产物。
在其他实施方式中，间接地定量化抗rep抗体，通过首先将样本的抗体固定在基质上，然后与规定量的rep蛋白温育，rep蛋白可以是标记的或包括标签蛋白，其中固定化并存在于基质上的抗-rep抗体从蛋白样本液体混合物中捕获rep蛋白，然后对结合的rep蛋白进行定量。
在其他实施方式中，rep蛋白可以在细胞中表达，并将这些细胞与样本温育。然后，对与由细胞表达的rep蛋白结合的样本中的抗rep抗体进行检测和定量。
免疫试验的设计可进行很大的改变，且许多形式都是本领域已知的。例如，方案可使用固体支撑物或免疫沉淀。大多数试验涉及使用连接有信号产生化合物的结合剂，例如标记的抗体或标记的rep蛋白；标记可以是例如酶、荧光、化学发光、放射性或染料分子。放大来自免疫复合物的信号的试验也是已知的；其实例为利用生物素和亲和素或链霉亲和素的试验，以及酶标记和介导的免疫试验，诸如elisa试验。
免疫试验可采用非均相或均相形式，并具有标准型或竞争型。在非均相形式下，多肽(rep蛋白或抗rep抗体)典型地与固体基质或支撑物或载体结合，以促进温育后样本从多肽中分离。可以使用的固体支撑物的实例有硝化纤维素(例如，以膜或微量滴定孔形式)、聚氯乙烯(例如，以薄片或微量滴定孔)、聚苯乙烯乳胶(例如，以珠或微量滴定板、聚偏氟乙烯(被称为immunolon)、重氮化纸、尼龙膜、活性珠和蛋白a珠。典型地在将固体支撑物从测试样本中分离之后并在检测结合的抗rep抗体之前清洗包含抗原多肽的固体支撑物。标准形式和竞争形式两者都是本领域已知的。
在均相格式中，将测试样本与rep蛋白在溶液中温育。例如，它可以处于将沉淀所形成的任何rep蛋白抗体复合物的条件下。这些试验的标准形式和竞争形式两者都是本领域已知的。
在标准格式中，直接监测抗体-rep蛋白复合物中的抗rep抗体的量。这可以通过确定识别抗rep抗体上的表位的(标记的)抗异种(例如抗人)抗体是否会由于复合物形成而结合来实现。在竞争形式中，通过监测对复合物中已知量的标记的抗体(或其他竞争配体)的结合的竞争效应来推断样本中抗rep抗体的量。
根据形式，通过多种已知技术中的任何一种检测包括抗rep抗体的所形成的复合物(或在竞争性试验的情况下，竞争抗体的量)。例如，复合物中未标记的抗rep抗体可以使用与标签(例如酶标签，诸如例如hrp)复合的抗异种ig的缀合物来检测。
在免疫沉淀或凝集试验形式中，rep蛋白与抗rep抗体之间的反应形成从溶液或悬浮液中析出的网状物，并形成可见的沉淀层或膜。如果样本中不存在抗rep抗体，则不会形成可见的沉淀。
所选择的固相可包括聚合或玻璃珠、硝化纤维素、微粒、反应盘的微孔、试管和磁珠。信号产生化合物可包括酶、发光化合物、色原体、放射性元素和化学发光化合物。酶的实例包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶(hrp)和β半乳糖苷酶。强化剂化合物的实例包括生物素、抗生物素和亲和素。结合成员的强化剂化合物的实例包括生物素、抗生物素和亲和素。
在其他实施方式中，本发明提供了多种方法，其中，样本中rep蛋白的量增加与神经退行性疾病(例如ms)的诊断或易感性相关，或者被用于监测疾病(例如ms)，或监测疾病(例如ms)的治疗。在这样的实施方式中，样本中的rep蛋白通过抗rep抗体检测。
这样的方法包括以下步骤：
(a)通过抗rep抗体检测来自受试者的样本中的rep蛋白的量；以及(b)将相比于对照样本中的量的在步骤(a)中在来自受试者的样本中检测到的rep蛋白的量与神经退行性疾病(例如ms)的诊断相关联。
可在用于检测血清或血浆样本中的rep蛋白的这样的方法中使用的试验的实例包括但不限于免疫沉淀、免疫荧光、斑点印迹和westernblot。
例如，可以将血清样本与抗rep蛋白抗体温育以捕获样本中的rep蛋白，然后进行rep蛋白的免疫沉淀的步骤，且此后进行通过sds-page和westernblot检测的步骤。
在其他实例中，可将斑点印迹膜与血清温育，然后进行sds-page和westernblot的步骤。
在另一实例中，将样本的血清稀释液加载到sds-page上，然后进行westernblot。
在其他实施方式中，通过免疫组织化学方法或免疫荧光显微镜法在组织样本中检测rep蛋白。
在某些实施方式中，使用抗rep抗体来检测或捕获样本中的rep蛋白。
术语“抗体”优选地涉及基本上由具有不同表位特异性的合并的多克隆抗体组成的抗体以及不同的单克隆抗体制剂。如本文所用，术语“抗体”(ab)或“单克隆抗体”(mab)旨在包括能够与rep蛋白特异性结合的完整的免疫球蛋白分子以及抗体片段(诸如例如fab和f(ab’)2片段)。fab和f(ab’)2片段缺乏完整抗体的fc片段，更快地从循环中清除，且可能具有比完整抗体更少的非特异性组织结合。因此，这些片段以及fab或其他免疫球蛋白表达库的产物是首选的。此外，可用于本发明目的的抗体包括嵌合、单链、多功能(例如双特异性)和人源化抗体或人抗体。
在某些实施方式中，其抗体或抗原结合片段与信号产生化合物连接，例如，携带可检测的标签。其抗体或抗原结合片段可以是直接或间接地可检测标记的，例如，用放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂或酶。本领域技术人员知道用于与抗体结合的其他合适的标签，或者能够使用常规实验确定这样的标签。
抗rep抗体优选地通过本领域技术人员熟知的方法针对具有seqidno:1或seqidno:8的氨基酸序列或其片段的rep蛋白产生(生成)。
在某些实施方式中，在本发明的方法中使用能够与小sphinx基因组(抗小sphinx样rep抗体或抗sslrep抗体)的组中的多种或所有类型的rep蛋白结合的抗rep抗体。这样的抗sslrep抗体与seqidno:1的氨基酸1至229中的rep蛋白的保守n-末端区内的表位结合。在特定的实施方式中，使用抗sslrep类型的抗rep抗体，其与seqidno:2(seqidno:1的氨基酸32-49)或seqidno:3(seqidno:1的氨基酸197-216)内的表位结合。seqidno:2和seqidno:3的肽片段在小sphinx基因组组中的rep蛋白中是高度保守的，且由于其亲水性而似乎被暴露。可通过用基本上由seqidnos:2或3所示的氨基酸序列组成的肽类，或者用优选地包括源自seqidno:1的氨基酸1至229的保守n-末端rep蛋白区域的至少8-15个氨基酸的其他免疫原性片段免疫例如小鼠或豚鼠来产生抗sslrep型的抗rep抗体。
在其他实施方式中，使用对msbi1rep蛋白有特异性的抗rep抗体。这样的抗体可以例如通过用具有seqidno:1的氨基酸序列的全长rep蛋白免疫哺乳动物(诸如小鼠或豚鼠)来产生。
优选地，本发明的方法使用能够在不同种类的体液(诸如例如血液、血清、脊髓液或脑脊液)中检测从皮克(picogramm)到飞克(femtogramm)的范围的rep蛋白的抗rep抗体。
在本发明的方法中，可以使用特定类型的抗rep抗体或两种或多种不同类型的抗rep抗体的组库。如果使用不同类型的抗rep抗体的组库，抗rep抗体组库可包括与在rep蛋白的不同结构域(例如，第一dna结合结构域(例如seqidno:1的aa1-136)、第二dna结合结构域(例如seqidno:2的aa137-229)和/或可变结构域(例如seqidno:1的aa230-324))内的不同表位结合，特别地与在msbi1rep蛋白(seqidno:1)的不同结构域内的不同表位结合的不同的抗rep抗体。
在其他实施方式中，抗rep抗体用于从患者和/或健康个体中筛选rep蛋白的探针。在例如神经退行性疾病患者的组织中选择性检测rep蛋白，表明了样本中检测到的rep蛋白的分离的dna基因组与样本所来源的患者的疾病之间存在因果关系。
对于通过抗rep抗体方法检测rep蛋白，可以应用诸如例如westernblot、免疫荧光显微镜法或免疫组织化学方法。
在某些实施方式中，使用能够在某些特定的细胞定位处检测rep蛋白的抗rep抗体。例如，抗rep抗体可以检测细胞质、核膜和细胞核中的rep蛋白，或者检测细胞质中的斑点。这样的抗rep抗体的组的实例在表1中示出：
a组的抗rep抗体具有在seqidno:3(seqidno:1的aa198-217)中所示的氨基酸序列内的表位，且能够检测包括小sphinx基因组组(例如msbi2、cmi1、cmi4)的该保守表位的msbi1rep和rep蛋白。在免疫荧光试验中，这样的抗rep抗体检测特定的rep定位模式，其中主要定位均匀分布在细胞质和核膜上；且在细胞核中可见到额外的弱的且均匀分布的定位。这样的a组抗体的实例是抗体ab01523-1-1(dsmacc3327)，其在实施例中作为a组抗体使用。
b组的抗rep抗体具有在seqidno:2(seqidno:1的aa33-50)中所示的氨基酸序列内的表位，且能够检测包括小sphinx基因组组(例如msbi2、cmi1、cmi4)的该保守表位的msbi1rep和rep蛋白。在免疫荧光分析中，这样的抗rep抗体特异性检测rep蛋白的斑点(细胞质聚集)(通常在核膜的外围)。这样的b组抗体的实例是被称为ab02304-4-1(dsmacc3328)的抗体，其在实施例中作为b组抗体使用。
c组的抗rep抗体特异性检测msbi1(seqidno:1)的结构表位。在免疫荧光试验中，这样的抗rep抗体检测特定的rep定位模式，其中主要定位均匀分布在细胞质和核膜上；且在细胞核中可见到额外的弱的且均匀分布的定位。这样的c组抗体的实例是抗体msbi1381-6-2(dsmacc3329)，其在实施例中作为c组抗体使用。
d组的抗rep抗体特异性检测msbi1(seqidno:1)的结构表位，其中被指定为“d1”的抗体msbi1961-2-2检测在msbi1的c-末端结构域中的seqidno:9(aa281-287)中示出的表位。被指定为“d2”的抗体msbi1761-5-1(dsmacc3328)检测msbi1的3d结构表位，其仅在体内条件下可实现，且在westernblots中不可实现。在免疫荧光分析中，这样的抗rep抗体特异性检测rep蛋白的斑点(细胞质聚集)(通常在核膜的外围)。
在某些实施方式中，使用a、b、c或d组的抗rep抗体；或至少两组不同的a、b、c或d组的抗rep抗体的组合来确定探针中rep蛋白定位的类型，以及这样的rep蛋白定位是否与病原体功能相关。例如，是否存在斑点。在某些实施方式即本发明的方法或试剂盒中，选自a组和b组的至少一种抗rep抗体与选自c组和d组的至少一种抗rep抗体组合。在特定的实施方式即本发明的方法或试剂盒中，a组的抗rep抗体与选自b、c和d组的至少一种其他抗rep抗体组合。例如，a组的抗rep抗体可与c组和d组的其他抗rep抗体组合。不同组的抗rep抗体的这样的组合提高了诊断评估的特异性，特别是对ms的诊断。这些a、b、c或d组抗体优选地用于对ms的诊断。
以下抗体于2017年9月28日保存在deutschesammlungfürmikroorganismenundzellkulturen(dsmz)[德国微生物保藏中心]：
抗体ab01523-1-1保藏号dsmacc3327；
抗体ab02304-4-1保藏号dsmacc3328；
抗体msbi1381-6-2保藏号dsmacc3329；和
抗体msbi1761-5-1保藏号dsmacc3330。
抗体msbi1961-2-2已于2017年10月6日保存在dsmz。
在其他实施方式中，提供了用于诊断ms的试剂盒。该试剂盒可包括用于检测抗rep抗体和/或rep蛋白的材料，以及用于在诊断ms的试验中使用该材料的说明书。该试剂盒可包括一种或多种以下组分：根据本发明的生物标志物，即分别为rep蛋白和抗-rep抗体，例如表1的抗体；信号产生化合物、用于附连捕获剂的固体基质、样本的稀释剂、洗涤缓冲液。信号产生化合物是指与能够与本发明的生物标志物结合的额外的结合剂连接的，或直接与本发明的生物标志物连接的可检测的标签。
本发明通过以下实施例进一步说明，但并不限于这些实施例：
实施例1：
msbi1rep蛋白纯化
将在msbi1基因组内鉴定的编码全长rep开放阅读框(orf)的核苷酸分子克隆到表达质粒(pexp5-ct，invitrogen)中，该表达质粒能够基于大肠杆菌(e.coli)高产量无细胞体外翻译系统(expresswaytm无细胞大肠杆菌表达系统，invitrogen)进行蛋白表达。通过加入20反应体积的包含100mmnah2po4、10mmtrishcl、ph8.0、5mm咪唑的8m尿素样本缓冲液ph8.0，来使体外翻译反应内合成的具有seqidno:1的氨基酸序列的rep蛋白变性。然后在基于将c-末端his6-标签融合到rep蛋白上的变性条件下(20mm咪唑用于洗涤，以及300mm咪唑用于蛋白洗脱)纯化rep蛋白。纯化的质量由coomassie蛋白染色和抗rep蛋白抗体的westernblotting确定。用密度测定法计算了rep蛋白纯度，且其纯度大于95％。纯化后的蛋白可直接用于基于elisa的血清筛选，或者进行sds-page，然后转移印迹到硝化纤维素膜上，用于血清温育1d尺寸分辨的rep蛋白膜条带。
实施例2：
血清主板的生成
首先等分血清样本以减少样本冻融循环。然后，通过在u形96孔板中由0.02％(w/v)叠氮化钠最终浓度稳定，在pbsph7.2中产生1:1稀释的血清建立主板。该板当存储于4℃下并在无菌条件下处理时，在至少2个月内是稳定的，并在个体筛选实验之前作为进一步血清稀释(1:20最终稀释)的模板使用。
实施例3：
通过血清温育1d尺寸分辨的rep蛋白膜条带的血清筛选
对于基于1d分别率rep蛋白膜条带与血清的温育的筛选试验，将20μg纯化的rep蛋白加载在sigmatru-page4-20％预制凝胶上。在凝胶装载前，将分隔凝胶袋的壁移除以产生一个大袋和用于分子量标准的单个的袋。在1d尺寸分辨的sds-page之后，使用标准的湿/罐转移印迹方案将蛋白转移印迹到硝化纤维素膜上。在此之后，用ponceaus对印迹膜上的蛋白(基本上是一条全长rep蛋白带，运行高度为约40kda)进行可视化，以检查转移质量并准备切割2mm宽度且完整1d尺寸分辨的膜的高度的膜条带。然后用每个500μl无血清封闭剂(genetextrident通用封闭剂)封闭条带1h。在此之后，基于两种不同的血清稀释液对血清进行表征。在4℃下在线性振动装置上进行血清温育14h(过夜)。在此之后，在室温下用pbs-tph7.20.1％吐温-20洗涤膜条带3×5min。通过用连接有hrp的山羊抗人igg(h+l)二级抗体在室温下温育1h，来检测血清内的rep特异性结合的人igg。在于室温下用pbs-tph7.20.1％吐温20进行三次洗涤3×5分钟之后，将每个个体的血清温育液的条带用胶带固定在塑料薄膜上。然后用ecl底物(bioradclarity)温育薄膜，以在bioradwesternblot检测系统上可视化的结合的人类igg。通过密度测定法进行定量对应于与蛋白膜上的rep带特异性结合的igg的量的信号。
图1中示出了1d尺寸分辨的rep蛋白膜条带的结果的实例，且表2中示出了血清反应阳性的血清/血浆样本的定量：几乎50％的血清样本对两种稀释(1:500和1:2000)都得到很强的信号，且21个样本中只有3个是完全阴性的。在血浆对照中，7个样本在1:500稀释时得到中间信号(一些额外的样本信号非常低)，而在1:2000稀释时只有3个样本得到非常微弱的信号，而所有其他的样本都是血清反应阴性的。所有的量化都证实ms-血清强度显示出相比于对照血清强度高的信号的趋势，至少30倍。
表2：血清反应阳性的血清/血浆样本的定量。
根据ms血清组库和健康对照血浆组库(各总共21个)的1:500和1:2000的血清/血浆稀释的信号强度，计算检测rep特异性人igg的血清/血浆。对于两种稀释(1:500和1:2000)，几乎50％的血清样本都得到很强的信号，且21个样本中只有3个是完全阴性的。在血浆对照中，7个样本在1:500稀释时得到中间信号(一些额外的样本信号非常低)，而在1:2000稀释时只有3个样本得到非常微弱的信号，而所有其他的样本都是血清反应阴性的。所有的量化都证实ms-血清强度显示出相比于对照血清强度高的信号的趋势，至少30倍。
实施例4：
通过elisa进行血清筛选
将适量纯化的rep蛋白(通常每孔为50和200ng之间)加入到预先置于maxisorp96孔elisa板(fisherscientific)中的ph8.08m尿素和ph7.2pbs的1:1混合物中。允许蛋白在线性振动装置上于4℃下与板基质结合14h。然后在室温下用pbs-tph7.20.1％吐温-20洗涤板3×5min，然后在4℃下用最终包含0.02％叠氮化钠的pbsph7.21％(w/v)bsa封闭至少14h。在此之后，将血清以1:500的稀释加入，并在室温下进行温育6h。在此之后，在室温下用pbs-tph7.20.1％吐温-20洗涤板3×5min。通过用连接有hrp的山羊抗人igg(h+l)二级抗体在室温下温育1h，来检测血清内的rep特异性结合的人igg。在于室温下用pbs-tph7.20.1％吐温-20洗涤3×5min三次之后，向每个孔中加入100μltmb(3,3′,5,5′-四甲基联苯胺，对hrp敏感)的底物溶液并在室温下温育5min。通过加入100μl8m乙酸/1m硫酸来停止反应。通过测量450nm处的吸光度在perkinelmerelisa兼容装置上量化信号强度。
基于elisa筛选的rep特异性血清响应的定量的实例结果在图2中示出：定量表明信号强度与rep蛋白(抗原)的量有良好的相关性。平均而言，ms组库的信号强度水平超过对照组库的强度，至少1.9倍。通常，基于elisa的血清筛查表明对于至少1:1000(数据未示出)的血清稀释度可检测的血清抗体，因此该实验的滴度很可能大于1:1000，在1:2000-1:4000的区域中，或在平台优化后甚至更大。
实施例5：
免疫荧光分析
在免疫荧光8-孔腔中在dmem10％fcs(补充有1x谷氨酰胺(gibco)和1x非必需氨基酸(gibco))中培养hek293tt细胞(125.000/孔)24h，然后使用聚乙烯亚胺(pei)进行表达自体荧光标志物蛋白zsgreen的对照质粒zsgreen1ci(clontech)或者在3′末端载有全长msbi1reporf编码zsgreen-rep融合蛋白的相同质粒的的dna转染。在dna转染48小时后，用pbs洗涤细胞，在rt下用pbs4％pfa在rt下固定20min，并在振动装置上在rt下用pbs0,5％曲拉通x-100透化10min。用pbs洗涤细胞，并在rt下用pbs1％bsa进行封闭45min。在37℃下在pbs1％bsa中用1:500抗体稀释液(包括缺乏一级抗体的对照)进行小鼠单克隆抗rep抗体(参见表1)的温育1h。用pbs洗涤细胞三次，然后在rt下与pbs1％bsa温育15min。然后，在rt下在pbs1％bsa中进行与二级抗体(alexafluor546山羊抗小鼠，1:500；dna标志物hoechst33342，1:5.000)的温育45min。将细胞用pbs1％bsa洗涤三次，并用pbs洗涤三次，然后安装盖片(dako封固介质)。在zeiss细胞观察仪(20x物镜，样本和对照物的暴露时间固定)上获得免疫荧光图像。
免疫荧光图像(图4)显示用a组和c组抗体进行抗体处理可产生对细胞质+核膜(+细胞核)定位的靶蛋白的特异性检测，而无对聚集物的检测。相比之下，b组和d组抗体显示出与斑点蛋白的特异性共定位和无至微弱水平的细胞质信号。在zsgreen融合蛋白上单独抗体的对照温育并没有产生显著的信号检测(使用相同暴露时间进行抗体信号的可视化)。
实施例6：
免疫荧光分析
在免疫荧光8-孔腔中在dmem10％fcs(补充有1x谷氨酰胺(gibco)和1x非必需氨基酸(gibco))中培养hek293tt细胞(125.000/孔)24h，然后使用聚乙烯亚胺(pei)进行表达自体荧光标志物蛋白zsgreen的对照质粒zsgreen1ci(clontech)或者在3′末端载有全长cmi1reporf编码zsgreen-rep融合蛋白的相同质粒的dna转染。在dna转染48小时后，用pbs洗涤细胞，在rt下用pbs4％pfa在rt下固定20min，并在振动装置上在rt下用pbs0,5％曲拉通x-100透化10min。用pbs洗涤细胞，并在rt下用pbs1％bsa进行封闭45min。在37℃下在pbs1％bsa中用1:500抗体稀释液(包括缺乏一级抗体的对照)进行小鼠单克隆抗rep抗体(表1)的温育1h。将细胞用pbs洗涤三次，然后在rt下与pbs1％bsa温育15min。然后，在rt下在pbs1％bsa中进行与二级抗体(alexafluor546山羊抗小鼠，1:500；dna标志物hoechst33342，1:5.000)的温育45min。将细胞用pbs1％bsa洗涤三次，并用pbs洗涤三次，然后用盖片(dako封固介质)封固。在zeiss细胞观察仪(20x物镜，样本和对照物的暴露时间固定)上获得免疫荧光图像。
免疫荧光图像(图5)显示，虽然a组抗体特异性地检测到细胞质+核膜(+细胞核)定位的靶蛋白而无对聚集物的检测，但b组抗体检测到斑点靶蛋白，有细胞质定位的靶蛋白的最小的背景。c组和d组的msbi1特异性抗体不能产生对信号的特异性检测。抗体d1和d2两者均属于“d”组，但具有略微不同的表位识别。
实施例7：
免疫荧光分析
在免疫荧光8-孔腔中在dmem10％fcs(补充有1x谷氨酰胺(gibco)和1x非必需氨基酸(gibco))中培养hek293tt细胞(125.000/孔)24h，然后使用聚乙烯亚胺(pei)进行对照质粒pcdna3.1(-)(invitrogen)或者表达全长msbi1reporf的密码子优化的变体(seqid.no.:13)的相同质粒的的dna转染。在dna转染48小时后，用pbs洗涤细胞，在rt下用pbs4％pfa在rt下固定20min，并在振动装置上在rt下用pbs0,5％tritonx-100透化10min。用pbs洗涤细胞，并在rt下用pbs1％bsa进行封闭45min。在37℃下在pbs1％bsa中用1:500抗体稀释液(包括缺乏一级抗体的对照)进行与小鼠单克隆抗rep抗体(表1)的温育1h。将细胞用pbs洗涤三次，然后在rt下与pbs1％bsa温育15min。然后，在rt下在pbs1％bsa中进行与二级抗体(alexafluor488山羊抗小鼠，1:500；dna标志物hoechst33342，1:5.000)的温育45min。将细胞用pbs1％bsa洗涤三次，并用pbs洗涤三次，然后用盖片(dako封固介质)封固。在zeiss细胞观察仪(20x物镜，样本和对照物的暴露时间固定)上获得免疫荧光图像。
免疫荧光图像(图6)显示用a组和c组抗体进行抗体处理可产生对细胞质+核膜(+细胞核)定位的靶蛋白的特异性检测，而无对聚集物的检测。相比之下，b组和d组抗体显示出与斑点蛋白的特异性共定位和无至微弱水平的细胞质信号。在zsgreen融合蛋白上单独抗体的对照温育并没有产生显著的信号检测(使用相同暴露时间进行抗体信号的可视化)。
实施例8：
westernblot分析
在6-孔细胞培养板中在dmem10％fcs(补充有1xglutamax(gibco)和1x非必需氨基酸(gibco))中培养hek293tt(1,5mio/6-孔)24h，然后使用聚乙烯亚胺(pei)进行编码具有n-末端zsgreen标签的作为融合蛋白的全长msbi1、cmi1或msbi2rep蛋白的zsgreen1ci质粒的dna转染。dna转染后48小时，将细胞用pbs洗涤，通过胰蛋白酶消化分离，再次用pbs洗涤并在sds-page
图7显示虽然a组和b组的抗体特异性地检测所有三种rep融合蛋白，除msbi1rep融合蛋白之外还包括cmi1和msbi2rep融合蛋白，但c组和d组的msbi1特异性抗体仅检测msbi1rep融合蛋白。抗体d2是wb阴性的，最可能是由于其检测3d结构表位，其在sds-page中在变性条件下不占优势，且在此处未测试。
序列总结
参考文献:
funk,m.,etal.(2014).“isolationofprotein-associatedcirculardnafromhealthycattleserum”.genomeannounc2(4)
giraldo,r.,etal.(2011).“repa-wh1prionoid:asyntheticamyloidproteinopathyinaminimalisthost.”ab0152-64
gunst,k.,etal.(2014).“isolationofbacterialplasmid-relatedreplication-associatedcirulardnafromaserumsampleofamultiplesclerosispatient.”genomeannounc2(4).
lamberto,i.,etal.(2014).“mycovirus-likednavirussequencesfromcattleserumandhumanbrainandserumsamplesfrommultiplesclerosispatients.”genomeannounc2(4).
manuelidisl.,2011.“nucleaseresistantcirculardnasco-purifywithinfectivityinscrapieandcjd”.j.neurovirol.ab0117131-145
torreira,e.,etal.(2015).“amyloidogenesisofbacterialprionoidrepa-wh1recaptiulatesdimertomonomertransitionsofrepaindnareplicationinitiation.”structure23(1):183-189
whitley,c.,etal.(2014).“novelreplication-competentcirularadnamoleculesfromhealthycattleserumandmilkandmultiplesclerosis-affectedhumanbraintissue.”genomeannounc2(4)。
序列表
<110>德国癌症研究公共权益基金会（deutscheskrebsforschungszentrum）
<120>rep蛋白作为蛋白质抗原用于诊断试验
<130>pn19009336p
<150>ep16193119.1
<151>2016-10-10
<160>15
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>324
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>msbi1rep蛋白
<400>1
metseraspleuilevallysaspasnalaleumetasnalasertyr
151015
asnleualaleuvalgluglnargleuileleuleualaileileglu
202530
alaarggluthrglylysglyileasnalaasnaspproleuthrval
354045
hisalasersertyrileasnglnpheasnvalgluarghisthrala
505560
tyrglnalaleulysaspalacyslysaspleuphealaargglnphe
65707580
sertyrglnglulysarggluargglyargileasnilethrserarg
859095
trpvalserglnileglytyrmetaspaspthralathrvalgluile
100105110
ilephealaproalavalvalproleuilethrargleugluglugln
115120125
phethrglntyraspilegluglnileserglyleuserseralatyr
130135140
alavalargmettyrgluleuleuilecystrpargserthrglylys
145150155160
thrproileilegluleuaspgluphearglysargileglyvalleu
165170175
aspthrglutyrthrargthraspasnleulysmetargvalileglu
180185190
leualaleulysglnileasngluhisthraspilethralasertyr
195200205
gluglnhislyslysglyargvalilethrglypheserphelysphe
210215220
lyshislyslysglnasnserasplysthrprolysasnseraspser
225230235240
serproargilevallyshisserglnileprothrasnilevallys
245250255
glnprogluasnalalysmetseraspleugluhisargalaserarg
260265270
valthrglygluilemetargasnargleuseraspargphelysgln
275280285
glyaspgluseralaileaspmetmetlysargileglnsergluile
290295300
ilethraspalailealaaspglntrpgluserlysleuglugluphe
305310315320
glyvalvalphe
<210>2
<211>18
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>rep肽
<400>2
glualaarggluthrglylysglyileasnalaasnaspproleuthr
151015
valhis
<210>3
<211>20
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>rep肽
<400>3
lysglnileasngluhisthraspilethralasertyrgluhislys
151015
lysglyargthr
20
<210>4
<211>8
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>his标签
<400>4
glyalahishishishishishis
15
<210>5
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>t7标签
<400>5
metalasermetthrglyglyglnglnmetgly
1510
<210>6
<211>8
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>flag标签
<400>6
asptyrlysaspaspaspasplys
15
<210>7
<211>8
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>trepii标签
<400>7
trpserhisproglnpheglulys
15
<210>8
<211>319
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>msbi2.176
<400>8
metserlysleuvalvallysaspasnalaleumetasnalasertyr
151015
asnleuaspleuvalgluglnargleuileleuleualaileileglu
202530
alaarggluserglylysglyileasnalaasnaspproleuthrval
354045
hisalaglusertyrileasnglnpheglyvalhisargvalthrala
505560
tyrglnalaleulysaspalacysaspasnleuphealaargglnphe
65707580
sertyrglnserlysserglulysglyasnileglnasnhisargser
859095
argtrpvalsergluileiletyrileaspthrglualathrvallys
100105110
ileilephealaproalailevalproleuilethrargleugluglu
115120125
glnphethrlystyraspilegluglnileseraspleuserserala
130135140
tyralaileargleutyrgluleuleuilecystrpargserthrgly
145150155160
lysthrproileileglyleuglyglupheargasnargvalglyval
165170175
leuaspserglutyrhisargilealahisleulysgluargvalile
180185190
gluhisserilelysglnileasngluhisthraspilethralathr
195200205
tyrgluglnhislyslysglyargthrilethrglypheserphelys
210215220
phelysglnlyslysprolysglnalagluilealathrgluthrpro
225230235240
lysthralathrasnaspproaspthrthrlysproleuthrglupro
245250255
glnilealalystyrsermetileleucyslysleuglyserileser
260265270
aspleuserasnpheproasptyrproalaphealaasntrpilegly
275280285
asnileleuargasnproglulysalaaspgluglnilealalysarg
290295300
ilephethralaleulysthrgluthrasptyrserlyslysasn
305310315
<210>9
<211>7
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>msbi1表位
<400>9
asnargleuseraspargphe
15
<210>10
<211>326
<212>prt
<213>人工
<220>
<223>cmi1.252
<400>10
metseraspleuilevallysaspasnalaleumetasnalasertyr
151015
asnleualaleuvalgluglnargleuileleuleualaileleuglu
202530
alaarggluthrglylysglyileasnalaasnaspproleuthrval
354045
hisalasersertyrileasnglnpheasnvalgluarghisthrala
505560
tyrglnalaleulysaspalacyslysaspleuphealaargglnphe
65707580
sertyrglnglulysarggluargglyargileasnilethrserarg
859095
trpvalserglnileglytyrmetaspaspthralathrvalgluile
100105110
ilephealaproalavalvalproleuilethrargleugluglugln
115120125
phethrglntyraspilegluglnilesergluleuserseralatyr
130135140
alavalargleutyrgluleuleuilecystrpargserthrglylys
145150155160
thrproileileaspleuthrgluphearglysargleuglyvalleu
165170175
aspthrglutyrthrargthraspasnleulysmetargvalileglu
180185190
leuglyleulysglnileasngluhisthraspilethralasertyr
195200205
gluglnhislyslysglyargthrilethrglypheserphelysphe
210215220
lysglnlyslyslysthrglyalaglumetprolysasnseraspser
225230235240
serprohisileglulysproserglnileproalaasnilealalys
245250255
glnprogluasnalalyslysaspaspleuglyhisargalaserlys
260265270
ilethrglyleuilemetserasnglyleualaaspargphelysarg
275280285
glyaspgluservalileaspmetmetlysargilelysglugluile
290295300
thrthraspthrthralaaspglntrpgluasnlysleuglugluphe
305310315320
glyvalilepheglnser
325
<210>11
<211>324
<212>prt
<213>人工
<220>
<223>cmi2.214
<400>11
metseraspleuilevallysaspasnalaleumetasnalasertyr
151015
asnleuaspleuvalgluglnargleuileleuleualaileleuglu
202530
alaarggluthrglylysglyileasnalaasnaspproleuthrval
354045
hisalaglusertyrileasnglnpheglyvalalaargglnthrala
505560
tyrglnalaleulysaspalacyslysaspleuphealaargglnphe
65707580
sertyrglnglulysarggluargglyargalaasnilethrserarg
859095
trpvalserglnilealatyrileaspgluthralathrvalgluval
100105110
ilephealaproalavalvalproleuilethrargleugluglugln
115120125
phethrglntyraspilegluglnileserglyleuserseralatyr
130135140
alavalargleutyrgluleuleuilecystrpargserthrglylys
145150155160
thrprovalilegluleualagluphearglysargleuglyvalleu
165170175
asnaspglutyrthrargseraspasnphelyslystrpileileglu
180185190
asnproilelysglnileasngluhisthraspilethralasertyr
195200205
gluglnhislyslysglyargthrilethrglypheserphelysphe
210215220
lysglnlyslyslysthrgluprogluthrprolysasnseraspser
225230235240
serglnargileglulysproserglnileproalaasnilevallys
245250255
glnprogluasnalaasnleuseraspleuglnhisargalaserlys
260265270
ilethrglyleuilemetserasnargleuseraspargphelysgln
275280285
glyaspgluserilemetglnmetmetalaargileglnsergluile
290295300
thrthraspserilealaaspglntrpglnserlysleuglugluphe
305310315320
glyvalvalphe
<210>12
<211>324
<212>prt
<213>人工
<220>
<223>cmi3.168
<400>12
metseraspleuilevallysaspasnalaleumetasnalasertyr
151015
asnleualaleuvalgluglnargleuileleuleualaileleuglu
202530
alaarggluthrglylysglyileasnalaasnaspproleuthrval
354045
hisalasersertyrileasnglnpheasnvalgluarghisthrala
505560
tyrglnalaleulysaspalacyslysaspleuphealaargglnphe
65707580
sertyrglnglulysarggluargglyargalaasnilethrserarg
859095
trpvalserglnilealatyrileaspgluthralathrvalgluval
100105110
ilephealaproalavalvalproleuilethrargleugluglugln
115120125
phethrglntyraspilegluglnileserglyleuserseralatyr
130135140
alavalargleutyrgluleuleuilecystrpargthrthrglylys
145150155160
thrprovalleuaspleuthrgluphearglysargleuglyvalleu
165170175
aspthrglutyrthrargthraspasnleulysmetargvalileglu
180185190
glnserleulysglnileasnlyshisthraspilethralasertyr
195200205
gluglnhislyslysglyargthrilethrglypheserphelysphe
210215220
lysglnlyslyslysthrgluprogluthrprolysasnasnaspser
225230235240
glyvalserlysprolysthrvalgluileproalagluvalvallys
245250255
glnprolysasnthrasnleuseraspleuglulysargvalargmet
260265270
ilethrglyalailealalysasnasnleualaserargpheglnhis
275280285
glyasngluserproleuaspmetmetlysargileglnsergluile
290295300
thrseraspgluthralaaspleutrpglnasnlysleuglusermet
305310315320
glyvalvalphe
<210>13
<211>999
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>密码子优化的msbi1
<400>13
atgagcgacctgatcgtgaaagacaatgccctgatgaacgcctcctacaacctggcactg60
gtcgaacagagactgattctgctggctatcatcgaggcaagggagaccggcaagggcatc120
aacgccaatgaccccctgacagtgcacgccagctcctacatcaaccagtttaatgtggag180
cgccacaccgcctatcaggccctgaaggacgcctgcaaggatctgtttgcccggcagttc240
agctaccaggagaagcgggagagaggcaggatcaacatcacaagcagatgggtgtcccag300
atcggctatatggacgataccgccacagtggagatcatctttgcaccagcagtggtgcct360
ctgatcaccaggctggaggagcagttcacacagtacgacatcgagcagatctccggactg420
tctagcgcctacgccgtgcgcatgtatgagctgctgatctgttggcggtctaccggcaag480
acacctatcatcgagctggatgagttccgcaagcggatcggcgtgctggacaccgagtac540
accagaacagataacctgaagatgagagtgatcgagctggccctgaagcagatcaatgag600
cacaccgatatcacagcctcttatgagcagcacaagaagggccgcgtgatcaccggcttc660
agctttaagttcaagcacaagaagcagaactctgacaagacaccaaagaatagcgattcc720
tctccccggatcgtgaagcacagccagatccctaccaacatcgtgaagcagccagagaat780
gccaagatgtccgacctggagcacagggcatctagggtgacaggcgagatcatgagaaat840
aggctgagcgatcggttcaagcagggcgacgagtccgccatcgatatgatgaagagaatc900
cagtccgagatcatcaccgacgccatcgccgatcagtgggaatctaaactggaagagttt960
ggagtcgtgtttggagcacatcaccatcatcatcactga999
<210>14
<211>326
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>msbi1蛋白
<400>14
metseraspleuilevallysaspasnalaleumetasnalasertyr
151015
asnleualaleuvalgluglnargleuileleuleualaileileglu
202530
alaarggluthrglylysglyileasnalaasnaspproleuthrval
354045
hisalasersertyrileasnglnpheasnvalgluarghisthrala
505560
tyrglnalaleulysaspalacyslysaspleuphealaargglnphe
65707580
sertyrglnglulysarggluargglyargileasnilethrserarg
859095
trpvalserglnileglytyrmetaspaspthralathrvalgluile
100105110
ilephealaproalavalvalproleuilethrargleugluglugln
115120125
phethrglntyraspilegluglnileserglyleuserseralatyr
130135140
alavalargmettyrgluleuleuilecystrpargserthrglylys
145150155160
thrproileilegluleuaspgluphearglysargileglyvalleu
165170175
aspthrglutyrthrargthraspasnleulysmetargvalileglu
180185190
leualaleulysglnileasngluhisthraspilethralasertyr
195200205
gluglnhislyslysglyargvalilethrglypheserphelysphe
210215220
lyshislyslysglnasnserasplysthrprolysasnseraspser
225230235240
serproargilevallyshisserglnileprothrasnilevallys
245250255
glnprogluasnalalysmetseraspleugluhisargalaserarg
260265270
valthrglygluilemetargasnargleuseraspargphelysgln
275280285
glyaspgluseralaileaspmetmetlysargileglnsergluile
290295300
ilethraspalailealaaspglntrpgluserlysleuglugluphe
305310315320
glyvalvalpheglyala
325
<210>15
<211>974
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>msbi1野生型
<400>15
atgagcgatttaatagtaaaagataacgccctaatgaatgctagttataacttagctttg60
gttgaacagaggttaattctattagcaatcatagaagcgagagaaacaggcaaagggatt120
aatgccaatgatcctttaacagttcatgcaagtagctatatcaatcaatttaacgtagaa180
aggcatacggcatatcaagccctcaaagatgcttgtaaagacttgtttgcccgtcaattc240
agttaccaagaaaagcgagaacgaggacgaattaatattacaagtcgatgggtttcgcaa300
attggctatatggacgatacagcaaccgttgagattatttttgcccctgcggttgttcct360
ctgattacacggctagaggaacagttcacccagtacgatattgagcaaattagcggttta420
tcgagtgcatatgctgttcgtatgtacgaactgctgatttgttggcgtagcacaggcaaa480
acaccaattattgagctagacgagtttagaaagcgaataggtgttttagatactgaatac540
actagaacagataatttaaagatgcgagttattgaattagccctaaaacaaatcaacgaa600
catacagacatcacagcaagctatgaacaacacaaaaaagggcgagtgattacaggattc660
tcattcaagtttaagcacaagaaacaaaacagcgataaaacgccaaaaaatagcgattct720
agcccacgtatcgtaaaacatagtcaaatccctccaacattgtaaaacagcctgaaaacg780
ccaaaatgagcgatttagaacatagagcgagccgtgttacaggggaaataatgcgaaatc840
gtctgtcagatcggtttaaacaaggcgatgaatcagcaatcgacatgatgaaacgtattc900
aaagtgaaataataaccgatgcaatagcagaccagtgggaaagcaaactggaggagtttg960
gcgtggttttttag974
pct/ro/134表
- 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞！