通过在液相色谱中使用新型保留指数系统鉴定未知化合物的制作方法

本发明涉及基于新型保留指数系统鉴定未知化合物的方法，其中借助液相色谱(lc)或液相色谱与质谱联用(lc-ms)进行这样的鉴定。

背景技术：

在引入保留指数系统之前，定性色谱分析依靠绝对保留时间(tr)和/或相对保留时间(tr(rel))作为鉴定参数。

绝对保留时间法在于将分析物保留时间与已知化合物的保留时间(例如，列出的参照化合物的tr)进行比较：如果峰的tr与参照物相同，则可以进行阳性鉴定。

然而，这样的方法仅在恒定的色谱条件下才是可靠的：即使是微小的差异也可能导致保留时间偏差，使得鉴定感兴趣的分析物即使并非不可能也非常困难。因此，由于绝对保留时间的高可变性，这样的方法存在重现性的问题。

为了克服此问题，可以使用相对保留时间法(即分析物tr与内标物tr之间的比值)。这样，由于对两种化合物的影响相同，分析条件的微小变化可被抵消。然而，相对保留时间法意味着选择一个合适的标准物是有挑战性的。因此，由于不可能固定单个标准物足够接近所有感兴趣的分析物，特别是在复杂基质中，这样的方法存在准确性的问题。

这些限制大部分都可以通过使用保留指数系统来克服。

保留指数系统最初由kovàts提出，他建议使用标准化合物(即正构烷烃)的同系列(同系物系列)来固定在色谱图的同一区域中洗脱的分析物的气相色谱(gc)保留行为。在所述保留指数系统中，每个标准正构烷烃根据其烷基链中的碳原子数被任意赋予保留指数值。常规地，为了避免使用小数，将碳原子数乘以100。给定化合物的保留指数等于具有与所述给定化合物相同的校正保留时间的假设的正构烷烃的碳原子数(×100)。因此，举例来说，具有的保留指数等于1090的化合物在烷烃c10(i＝1000)和c11(i＝1100)之间洗脱。

根据kovàts定义，某化学化合物的保留指数(i)为其归一化至相邻洗脱的正构烷烃的保留时间的保留时间。因此，根据下式进行保留指数(i)计算：

其中，

t’ri为未知化合物的校正保留时间，t’rz和t’r(z+1)分别为在未知化合物i之前和之后立即洗脱的烷烃的校正保留时间，且z表示烷烃链中的碳原子数(即链长)。

术语“校正保留时间”(t'r)意为分析物分配至固定相所需的时间，且对应于分析物保留时间(tr)减去未保留峰的洗脱时间(tm)(即，又称为停留时间)：

t'r＝tr-tm

当应用等温gc条件时，洗脱此同系列的保留时间随着烷烃链长度呈指数增长。因此，校正保留时间与参照烷烃的保留指数之间存在半对数关系。

在程序升温gc中，相反，由于正构烷烃系列以线性模式洗脱的事实，其意味着保留时间和保留指数之间存在线性关系，保留指数被限定为线性保留指数(以下也称lri)，并通过下式计算：

其中，

tri为未知化合物的保留时间，trz和tr(z+1)分别为在未知化合物i之前和之后立即洗脱的烷烃的保留时间，且z表示烷烃链中的碳原子数。

这种方法还通过使用多环芳烃作为同系列提出[m.l.lee,d.l.vassilaros,c.m.white,m.novotny.anal.chem.,v.51,p.768(1979)]。在该文章中，lee等人也报道了基于紧密相关的化合物作为内标的保留指数系统，对于多环芳烃分析更加可靠。换句话说，如果参照化合物具有的化学物理性质与待测定的分析物的化学物理性质相似，则保留指数的重现性增加。

文献中还描述了其他保留指数系统。其中，利用有偶碳链数的脂肪酸甲酯(fame)作为同系列的保留指数系统常用于表征脂肪酸样品[f.p.woodford,c.m.vangent.j.lipidres.,v.1,p.188(1960)；t.k.miwa,k.l.mikolajcazak,f.r.earle,i.a.wolff.anal.chem.,v.32,p.1739(1960)]。在这种情况下，由于同系列的两个连续化合物之间的碳原子差等于二，式2被修改如下：

因此，可以根据式4进行通用的lri计算：

其中，

z是与在分析物之前立即洗脱的化合物相关的任意数，且n表示在未知分析物之前或之后立即洗脱的参照化合物之间的z单元的差。

在gc中，鉴于lri和质谱(ms)数据两者的高重现性，这些参数的组合和互补可得出明确的鉴定。此外，可用的商业数据库包括成千上万的ms谱，允许非常快速和自动的鉴定过程，其中常使用lri作为二次过滤器(例如，具有高谱图匹配但lri值落在所选范围之外的化合物被自动地从可能的候选名单中排除)。

然而，迄今为止，在液相色谱(lc)中尚未建立有效、可靠且高重现性的保留指数系统。

关于保留指数在液相色谱中的使用，在过去几年里已经提出了几种方法，有时结合uv光谱信息，主要用于毒理学研究中药物的鉴定。第一次尝试当属baker和ma[j.k.baker,c-y.ma.j.chromatogr.a,v.169,p.107(1979)]，他们建议在等度条件下使用烷-2-酮系列(即从丙酮至2-二十三酮)作为同系列参照混合物。三年后，smith等人[smith,r.m.j.chromatogr.a,v.216,p.313(1982)]建议使用烷基芳基酮同系列，因为其具有更高的uv吸收。

然后评估了固定相化学和填装以及流动相组成的影响，得出结论，由于即使在轻微不同的分析条件下也会出现显著的tr偏差，在液相色谱中lc条件的标准化对于创建可靠的鉴定方法和可用的数据库是必要的。

在此方面，bogusz等人描述了使用1-硝基烷烃(即从硝基甲烷至1-硝基辛烷)进行保留指数计算，因为相比于烷基芳基酮系列，它们在常见的反相(rp)条件下显示出更好的色谱空间覆盖。此外，由于采用梯度洗脱模式的事实，其相当于gc中的程序升温，使用式2进行保留指数计算[m.bogusz,r.aderjan.j.chromatogr.a,v.435,p.43(1988)]。

然而，硝基烷烃价格昂贵且在高ph下并非高度稳定。

此外，如wo2013/134862中报道，本领域已知的保留指数标准物，诸如例如烷基苯酮，主要设计用于有uv吸光度检测的lc。

wo2013/134862描述了使用1-烷基吡啶磺酸的同系列作为保留指数标准物用于液相色谱，尤其是用于使用特别地电喷雾(esi)电离系统或大气压力化学电离(apci)电离系统的lc-ms方法。

然而，在wo2013/134862中，没有有关借助其他检测器鉴定未知化合物的暗示，特别是借助没有给出关于化合物结构的信息的检测器，诸如例如elsd(蒸发光散射检测器)检测器。wo2013/134862中描述的方法仅在与质谱联用时才有效，因此其本身在液相色谱中作为鉴定工具并不可靠。此外，同系列中包括的化合物尚未从毒理学角度进行研究，且由于吡啶环的存在可能具有很高的毒性。这些化合物的另一限制涉及它们在市场上相对有限的可获得性。

使用上述每种同系列时遇到的限制(诸如低uv吸收、色谱空间的有限覆盖、高毒性、差的可承受性和化学稳定性)，以及由分析参数、仪器或甚至柱填装的任何改变而实验的低保留时间重现性，阻碍了在实验室内和实验室间的水平两者上在液相色谱中广泛使用保留指数数据库。

因此，仍然需要可有效作为参照混合物的同系列，允许建立基于新型保留指数系统用于在液相色谱中鉴定未知化合物的可靠且高重现性的方法。

技术实现要素：

本发明的发明人现已惊奇地发现，当使用三酰甘油的同系列作为保留指数参照混合物时，可建立基于新型保留指数系统的有利的lc方法，允许克服现有技术中已知的限制。

因此，本发明的目的是将三酰甘油(下文又称tag)的同系列用于液相色谱，其中所述系列优选地包括由奇链脂肪酸组成的简单三酰甘油。

本文还提供了用于在液相色谱中鉴定未知化合物的方法，其中所述方法优选地为hplc或uhplc方法，最终与质谱(ms)联用。该方法包括以下步骤：向每个参照tag赋予保留指数值；对tag参照混合物进行色谱分离(以及，最终建立校正曲线以外推未包括在所选参照混合物中的参照tag的保留时间)；对样品中的未知化合物进行色谱分离；确定每个分离的未知化合物的保留指数值(最终还通过使用在所选同系列所覆盖的色谱空间之外洗脱的参照tag的外推的tr值)；以及通过将得到的lri值与列表化合物的lri值进行比较来鉴定未知化合物。

本文还提供了可用于在液相色谱中鉴定未知化合物的保留指数的库(即数据库)。

本文还提供了名为cromatoplusspectra的软件，该软件已经适当地开发，仅基于将未知化合物的lri值与之前建立的lri库(或数据库)的lri值相匹配，从而使鉴定过程自动化且快速。

附图说明

图1：uhplc-elsd方法开发步骤：a)等度条件(40％溶剂b)下鱼肝油的色谱图；b)5min等度步骤(20％溶剂b)和70min线性梯度(20-50％b)下鱼肝油的色谱图；c)多步骤梯度洗脱(30min的0-25％b和75min的25-50％b)下鱼肝油的色谱图；d)多步骤梯度洗脱(30min的0-25％b和75min的25-50％b)下黄油样品的色谱图；e)105min线性梯度(0-50％b)下黄油样品的色谱图。

图2：参照tag的校正曲线tr相对于pn，包括在同系列(从c9c9c9至c19c19c19)的一种中。

图3：通过使用最终开发的方法获得的uhplc-elsd选择的色谱图：a)琉璃苣油；b)山羊乳；c)鲱鱼油；d)参照同系列。

图4：鉴定的a)亚麻籽油和b)鲱鱼油的色谱图。

图5：a)llp和b)ooln的esi-ms谱，以及碎片说明。mag：单酰甘油；dag：二酰甘油；tag+na+：三酰甘油的钠加合物。

图6：所选同系列的色谱，以及每对相邻同系物的sn和δlri值(δ)。

图7：报告uhplc-elsd和hplc-esi-ms分析之间的平均lri值(值在表8中报告)的柱状图；误差条对应于δlri值。

图8：海鲈鱼色谱图，作为仅使用lri数据库鉴定的样品色谱图的实例提供。

定义

术语“同系列”是指具有相同通式，仅烷基链中的亚甲基数不同的一系列化合物。换句话说，连续的成员通过在链中插入额外的亚甲基桥(即-ch2-)而在质量上有所不同。该系列中相邻的成员被称为“相邻同系物”。

出于本发明的目的，当优选由奇链脂肪酸组成的三酰甘油时，相邻成员(或相邻tag)，诸如例如三壬酸甘油酯(c9c9c9)和十一烷酸甘油三酯(c11c11c11)，质量相差六个额外的亚甲基桥。

术语“参照混合物”是指一组化合物，其为出于本发明的目的被选作标准物的同系列的一部分。

具体实施方式

本发明的第一目的是将三酰甘油的同系列用于液相色谱，其中所述系列优选地包括由奇链脂肪酸组成的简单三酰甘油。

选择三酰甘油作为主要的目标分析物，因为其生物学重要性和非常规则的液相色谱图，特别是在反相液相色谱(rp-lc)中，且由于之前从未在类似的研究中考虑过它们。

下面报告了三酰甘油通式结构：

其中，

r’、r”和r”’，合在一起或单独，可以是相同的或不同的直烷基链。

本发明的三酰甘油可以是简单或混合的tag。简单tag仅包括一种类型的脂肪酸(即r’、r”、r”’是相同的)，而混合的tag包括两种或三种不同的脂肪酸(即r’、r”、r”’中的两种或三种是不同的)。优选地，同系列的参照三酰甘油是简单tag。每种脂肪酸可以是饱和的或不饱和的，且可以包含一个、两个或三个不饱和度。优选地，同系列的参照三酰甘油是饱和的tag。本发明的三酰甘油可以包括偶链脂肪酸和奇链脂肪酸两者。优选地，同系列的参照三酰甘油包括奇链脂肪酸。

本发明的参照三酰甘油是可商购的。可替代地，它们可以通过甘油与三种合适的脂肪酸的酯化反应，或者通过甘油与三种合适的酯的酯交换反应而容易地合成。

由于所使用的同系列必须覆盖所有可能的分析物的预期保留时间，已选择本发明的参照三酰甘油使得它们覆盖范围广泛的保留时间。

在本发明的一种实施方式中，参照同系列包括但不限于，范围从三庚酸甘油酯(c7c7c7)至二十一烷酸甘油三酯(c21c21c21)或其任何部分的三酰甘油。

事实上，出于本发明的目的，相邻tag的所述同系列的任何部分均适合作为参照混合物，条件是它包括选自由以下组成但不限于以下的组的至少两个相邻的tag：三庚酸甘油酯(c7c7c7)、三壬酸甘油酯(c9c9c9)、十一烷酸甘油三酯(c11c11c11)、十三烷酸甘油三酯(c13c13c13)、十五烷酸甘油三酯(c15c15c15)、十七烷酸甘油三酯(c17c17c17)、十九烷酸甘油三酯(c19c19c19)和二十一烷酸甘油三酯(c21c21c21)。

在本发明的优选实施方式中，参照同系列包括以下范围的三酰甘油：

-从三庚酸甘油酯(c7c7c7)至十九烷酸甘油三酯(c19c19c19)；或

-从三壬酸甘油酯(c9c9c9)至十九烷酸甘油三酯(c19c19c19)；或

-从三壬酸甘油酯(c9c9c9)至二十一烷酸甘油三酯(c21c21c21)；或

其任何部分。

特别地，范围从c9c9c9至c19c19c19的参照混合物，很大程度上覆盖了从饮食角度来看脂质样品通常落入的色谱空间。更特别地，它们覆盖了具有同系物分布的从约9至约120min的几乎所有色谱，如图3d中所示。

此外，根据所使用的色谱方法和/或样品组成，以上公开的参照混合物可以扩展至短链三酰甘油(例如，至三甲酸甘油酯，c1c1c1)或长链三酰甘油。

主要由于其色谱空间的最佳覆盖以及它不受色谱分析条件影响的事实，参照tag同系列使本发明的保留指数系统在实验室内和实验室间水平两者上均可重现。

本发明还提供了用于液相色谱的包括三酰甘油的同系列的试剂盒。

优选地，试剂盒包括含有由奇链脂肪酸组成的简单三酰甘油的参照同系列。

在一种实施方式中，试剂盒包括含有但不限于范围从三庚酸甘油酯(c7c7c7)至二十一烷酸甘油三酯(c21c21c21)或其任何部分的三酰甘油的参照同系列。

出于本发明的目的，试剂盒可以包括所述同系列的任何部分，条件是它包括选自由以下组成但不限于以下的组的至少两个相邻的tag：三庚酸甘油酯(c7c7c7)、三壬酸甘油酯(c9c9c9)、十一烷酸甘油三酯(c11c11c11)、十三烷酸甘油三酯(c13c13c13)、十五烷酸甘油三酯(c15c15c15)、十七烷酸甘油三酯(c17c17c17)、十九烷酸甘油三酯(c19c19c19)和二十一烷酸甘油三酯(c21c21c21)。

在本发明的优选实施方式中，试剂盒包括含有但不限于以下范围的三酰甘油的参照同系列：

-从三庚酸甘油酯(c7c7c7)至十九烷酸甘油三酯(c19c19c19)；或

-从三壬酸甘油酯(c9c9c9)至十九烷酸甘油三酯(c19c19c19)；或

-从三壬酸甘油酯(c9c9c9)至二十一烷酸甘油三酯(c21c21c21)；或

其任何部分。

此外，本发明的试剂盒可以包括同系列，使得以上公开的每个参照同系列或其部分可以根据所使用的色谱法和/或样品组合物扩展至短链三酰甘油(例如，至三甲酸甘油酯，c1c1c1)或长链三酰甘油。

根据本发明，所述试剂盒可以以(多个)个体小瓶的形式包括tag同系列，每个小瓶包括一参照tag，或者作为包括tag参照混合物的单个小瓶。每个参照tag和/或tag参照混合物可以是固体干燥形式，或者作为即用溶液，预先或与未知化合物(即分析物)一起引入lc系统。

优选地，试剂盒提供tag参照混合物作为在适当溶剂中的即用溶液，在适当溶剂中简单稀释之后，预先或与未知化合物一起引入lc系统。

实际地，试剂盒提供tag参照混合物作为在2-丙醇中的即用溶液，对于每种tag其浓度为但不限于1000mg/l，在2-丙醇中简单稀释之后，预先或与未知化合物(即分析物)一起引入lc系统。

选择的三酰甘油的标准混合物(即同系列)优选地在浓度范围50-1000mg/l中制备，取决于所使用的检测器，即取决于其灵敏度：当用ms检测器时，使用50-100mg/l的浓度，而对于灵敏度较低的elsd或uv检测器，则用更高的浓度。然后，同系列既可以用作外标物，也可以用作内标物。

在第一种情况下，将这样的tag标准混合物注入到液相色谱系统中，以便分离每种参照三酰甘油。所得到的色谱图形成三酰甘油的参照模式，可用作后续定性分析的外标物。

本发明的参照三酰甘油也可以通过与待鉴定分析物的样品共注入而用作内标物。然而，对于非常复杂的基质，应优选外标法以避免也具有参照峰的色谱过密。事实上，这可以造成分辨率的问题。

本发明的另一目的是开发基于tag保留指数系统在液相色谱中鉴定未知化合物的方法，其中所述方法特别地是能够最大化真实样品中脂质化合物的基线分离的高效液相色谱(hplc)或超高效液相色谱(uhplc)方法。

更具体地，本发明的优选的目的是开发能够最大化真实脂质样品中脂质化合物的基线分离的uhplc方法，对于明确鉴定未知化合物是有效且可靠的，有以及甚至没有质谱的补充。

因此，本文描述了在液相色谱中鉴定未知化合物的方法，该方法包括以下步骤：

a.向每个参照tag赋予保留指数值；

b.对tag参照混合物进行色谱分离；

c.对样品中的未知化合物进行色谱分离；

d.确定每个分离的未知化合物的保留指数值；

e.鉴定未知化合物。

由于它允许将保留时间转换为与系统无关的常数，本文公开的新型保留指数系统可以独立于所选仪器和分析条件而使用。

关于步骤a.，如上所述，从文献中得知，可以根据有机化合物的烷基链中碳原子数任意赋予该有机化合物保留指数值。

因此，出于本发明的目的，向所要求保护的同系列的每个参照tag，根据如下任意赋予保留指数值：

lristd＝100×pn

其中，

pn(分配数)与和甘油骨架结合的脂肪酸的碳链长度(cn)和双键数(db)有关，根据下式：

pn＝cn-2db

通过举例，lristd对于三庚酸甘油脂(c7c7c7)等于2100，对于三壬酸甘油酯(c9c9c9)等于2700，对于十三烷酸甘油三酯(c13c13c13)等于3900，对于十九烷酸甘油三酯(c19c19c19)等于5700，等。

详细地，可以通过使用hplc或uhplc系统进行步骤b.和c.两步的色谱分离。在第一种情况下，通过使用hplc系统，例如watersalliancehplc系统(watersassociatesinc)，任选地与质谱仪联用进行分析，诸如电喷雾电离质谱仪(即esi-ms)。在第二种情况下，通过使用uhplc系统，例如nexerax2系统(shimadzu)，与合适的检测器联用进行分析。出于本发明的目的，合适的检测器可以是破坏性或非破坏性检测器，选自但不限于以下：蒸发光散射检测器(elsd)、紫外检测器、uv和光电二极管阵列检测器、通过大气压力接口(api)或电子电离(ei)源两者的质谱仪。优选elsd。此外，在色谱仪与质谱仪联用的情况下，合适的api接口可以是电喷雾(esi)、大气压力化学电离(apci)或大气压光电离(appi)，这些接口都适合于tag分析。

关于分析条件，本发明的发明人已成功建立了几乎独立于所使用的色谱仪器和条件两者的方法。

影响该方法且特别地该方法重现性的唯一特征是流动相。事实上，对于步骤b.和c.两步的色谱分离，选择的流动相包括乙腈(以下也称溶剂a)和2-丙醇(以下也称溶剂b)。然而，发明人已惊奇地发现，以梯度洗脱优选地以线性梯度洗脱运行的此流动相(即乙腈/2-丙醇流动相)，允许在色谱分辨率(即约162的峰容量值)和分析时间(即约125min)之间获得最佳折中，据我们所知，对于非常复杂的样品，诸如鱼油和乳制品，是迄今为止所达到的最好的。

此外，乙腈和2-丙醇两者的毒性远低于在以往方法中使用的其他溶剂，诸如二氯甲烷或丙酮，其特点尤其是挥发性非常高。

另一问题是最强溶剂(即2-丙醇)的最大百分比的选择。大量实验之后，发明人发现，在等度的条件下，在40％和60％之间、优选地在45％和55％之间且更优选地等于50％的2-丙醇的百分比，足以在最复杂的真实样品之一(即鱼肝油)中完全洗脱所有的化合物(图1a)。为了改善色谱法，之后仔细评估了梯度洗脱程序，旨在最大化复杂真实样品的基线分离。

已经制定了合适的梯度程序，具体如下：

i.0-5min，20％b，75min至50％b(图1b)，但其在低分配数(pn)区域(即从约30至约36)显示出差的分辨率，并且在最丰富的pn区域，即pn42，存在多个共洗脱。

ii.0-30min，0-25％b，30-105min至50％b(图1c)，由此在30、32和34pn区域之间实现了清晰的分离，以及在每个pn区域中有较大的分辨率；及最后

iii.在105min中线性梯度0-50％b(图1e)。

后者，即iii.，得到了本色谱法的极大改善，达到更好的分辨率，改善的峰形，显示出更均匀且更窄的峰宽(参见图1e相对于图1d)，以及最佳的分析时间。

出于这些原因，这样的线性梯度乙腈/2-丙醇代表最适合于本发明的方法，特别是相对于步骤b.和c.两步的色谱分离。

以最大化分离为目标，发明人还仔细考虑了温度。评估了在30-40℃范围内的三个温度(即30℃、35℃和40℃)，得出结论，在所述范围内该方法是易于重现的。然而，优选35℃的温度。本文提供的实验还表明，本发明的方法独立于分析条件和色谱仪器，诸如，例如柱尺寸、固定相装填、流动相的流速和梯度倾斜度(参见evidenceofthemethodindependency:repeatabilitystudies(方法独立性的证据：重复性研究))。

所要求保护的方法尽可能地独立于分析条件，允许得出结论，本发明的保留指数系统及基于其的数据库可用于实验室内和实验室间两种水平上的样品鉴定。

步骤b.的参照混合物优选地包括由奇链脂肪酸组成的简单三酰甘油，其代表根据本发明的新型保留指数系统的参照同系列。

步骤b.还可以包括校正曲线tr相对于pn的最后的建立。详细地，考虑到tr与pn之间的线性关系，使用步骤a.中参照tag的pn值和步骤b中获得的保留时间来构建图是可能的(图2)。

关于步骤c.，“色谱分离”应按照步骤b.中所公开的理解，而术语“样品”意为真实样品，更具体地为真实脂质样品，例如范围从非常简单的植物油至更复杂的鱼油、乳及乳源性脂质样品，诸如但不限于以下：植物油，水生生物(例如鱼和藻类)及其衍生物(例如鱼粉和鱼油)，乳制品以及生物样品，如全血、血浆和细胞膜。

关于步骤d.的保留指数值的确定，它可以根据本发明通过使用奇链tag作为参照同系列(例如从c9c9c9至c19c19c19)，借助式4(在下文列出)来进行。

其中，

tri是未知化合物i的保留时间，trz和tr(z+1)是分别在未知化合物i之前和之后立即洗脱的tag的保留时间，z是与在未知化合物i之前立即洗脱的化合物相关的pn，且n代表在未知化合物i之前和之后立即洗脱的参照tag之间的z单元的差。

如上所述，出于本发明的目的，z等于每个参照tag的pn。因此，通过举例，c9c9c9的z为27，c19c19c19的z高至57。

此外，由于两个相邻同系物之间的z单元之差等于6，当使用式4来计算lri时n取为6。

步骤d.还可包括借助步骤b中建立的校正曲线tr相对于pn(图2)进行保留时间的外推。详细地，考虑到tr和pn之间的线性关系，外推未包括在所使用的同系列中(例如，pn小于27或大于57)的参照化合物的保留时间是可能的。更特别地，考虑到未知化合物的保留时间(步骤c.)，外推在未知化合物之前和之后立即洗脱的两参照tag的保留时间和pn是可能的。因此，使用这样的式4中的保留时间和/或pn来计算在同系列所覆盖的色谱空间之外洗脱的化合物的lri值将是可能的。

在本发明的另一实施方式中，步骤d.也可以借助cromatoplusspectra软件执行，该软件自动地外推在同系列所覆盖的色谱空间之外洗脱的峰的保留指数。这样的外推也是基于tr和pn之间的正比例/线性关系，且可以由每个操作者在excel文件上容易地执行。

鉴定步骤e.通过将计算的未知化合物的lri值与之前获得的列表化合物的lri值进行比较来进行；如果未知峰的计算lri与参照的相同，则可以作出阳性鉴定。

术语“列表化合物”包括但不限于，步骤a.中建立的化合物(即参照tag的lri值)。所述术语实际上还包括借助本色谱法分析的所有化合物的保留指数值，其已成为本发明的保留指数库(即lri数据库，包括多于209种tag和其他简单和复杂的脂质，诸如，例如游离脂肪酸、单酰甘油和二酰甘油(分别为mag和dag)以及甾醇类、类胡萝卜素和蜡)的一部分。

在本发明的另一实施方式中，鉴定步骤e.可以借助cromatoplusspectra软件进行，该软件已经适当的开发，仅基于将未知化合物的lri值与之前建立的lri库的lri值相匹配，从而使鉴定过程自动化且快速。通过新软件的鉴定过程由以下步骤组成：同系列峰的色谱中的峰积分以确定其保留时间；真实样品的色谱中的峰积分；加载之前积分的同系列色谱的lri数据处理窗口；加载lri库(通常是仅包括化合物名称和lri值的excel文件)；对每种未知化合物进行lri计算；通过一次简单的点击与lri库匹配；然后获得候选对象列表，取决于软件中设置的lri容限窗口(公差窗口)。

关于色谱分离，在优选的实施方式中，该方法包括配备有两个连续偶联的窄孔柱(100×2.1mm(l×id))的uhplc系统，其中固定相装填由2μm之下的dp单分散颗粒组成，且流动相为乙腈(a)/2-丙醇(b)，在梯度条件下：0-50％b在105min中(保持20min)。维持流速为400μl/min，温箱温度为35℃。对于检测条件，在优选的实施方式中，采用elsd检测器，并应用以下elsd参数：蒸发温度60℃，雾化气体(n2)压力270kpa，检测器增益166＜1mv；取样频率：10hz。

图3a、3b和3c分别报道了琉璃苣油、鲱鱼油和山羊奶的色谱图，与参照同系列色谱图(图3d)进行了直接比较；示出了根据分配数的即时鉴定(甚至通过目视检查)，目的是突出每个pn区域在保留时间方面的样品间重复性，尽管洗脱谱完全不同。此外，为了指出本方法的高效色谱有效性，图4中示出了所注入的最复杂的植物油之一——亚麻籽油，和有最大数的鉴定的tag的样品——鲱鱼油的色谱图。

下表1提供了用于指代分析的化合物中的多种脂肪酸的缩写列表。

表1

仅基于本发明的保留指数系统的鉴定本身是可靠的，并可得出明确的鉴定(即不发生保留指数重叠)。然而，有时，得到的lri值可以与多于一种参照化合物阳性匹配。这种情况为二亚油基-棕榈酰基-甘油(llp)，具有的lri为4360±6，以及二油基-亚麻基-甘油(ooln)，具有的lri为4358±2。因此，为了避免模糊鉴定，步骤e.还可以包括检查每个种类的ms裂解模式，从而选择出正确的候选对象。图5示出了llp(图5a)和ooln(图5b)种类的esi-ms谱，及其碎片说明。详细地，每种tag都示出了由分子种类的钠加合物、二酰甘油和单酰甘油裂解表征的裂解谱，从而可以得出明确的鉴定。走进本发明的此方面的细节，当采用lc-ms系统时，使用相同的软件进行鉴定过程，通过添加对ms谱的解读的另一步骤，其可以通过在峰上一次简单的点击而可视化。在不久的将来，还可以创建谱库，并结合lri数据库用作自动鉴定工具。在这种情况下，软件应能够同时应用这两种鉴定过滤器，从而只提供正确的候选对象。

相反，本发明的方法也可用于辨别具有非常相似或相同的质谱的化合物。综上所述，使用保留指数于液相色谱与ms特别是ei-ms或api-ms联用中，通过提供第二个独立的实验值显著提高了峰鉴定的可靠性。因此，可以得出结论，根据本发明，保留指数不仅是在lri数据库中执行自动且快速搜索的重要参数，而且它们也可以成为ms的补充，允许辨别具有相同质谱裂解的分析物，从而实现高度可靠的鉴定。

还值得注意的是，迄今为止，通常通过以互补的方式考虑脂肪酸甲酯(fame)的gc谱和完整脂质的lc谱来研究脂质谱。以这种方式，完整脂质的鉴定可以通过fa组成带动；换句话说，可以通过考虑fa的相对丰度来区分同量异位素(isobar)(相同的ms谱)，fa结合于酰基甘油(mag、dag和tag)和磷脂中并存在于甾醇酯、类胡萝卜素酯、蜡中。此外，对于非常简单的样品，已知fa组成并考虑到在rp-lc下脂质的典型洗脱谱，则ms信息可能不是必需的。事实上，在rp-lc中，脂质是根据增加的pn洗脱的，然后基于保留行为可进行初步鉴定。然而，当考虑复杂的样品时，诸如鱼油或乳和乳源性样品，可以观察到很多例外，由于高度多元未饱和以及短链饱和的脂肪酸的不可预知的保留行为，其可能被更弱地保留并在色谱的较低pn区中洗脱。

为此，本发明的方法提供了与每种脂质相关的保留指数值，代表了更可靠的鉴定工具。

如上所述，根据本发明，还提供了在液相色谱中用作有效的鉴定工具的列表化合物的保留指数库(即数据库)。

通过使用cromatoplusspectra软件(chromaleont,messina,意大利)建立保留指数数据库，由于保留指数和链长之间存在线性关系，该软件能够外推早于c9c9c9(下至三甲酸甘油酯，c1c1c1)以及在c19c19c19之后洗脱的tag的lri值。然后，通过使用cromatoplusspectra软件进行分析，该软件允许将为每个峰自动计算的lri与之前创建的lri数据库的lri直接进行匹配。由于它返回尽可能窄的候选对象列表，仅依靠lri数据库执行搜索且/或不考虑任何谱数据是可能的。此外，在用不同类型的仪器(例如，hplc、uhplc、nanolc)与不同类型的检测器(例如，elsd、api-ms、ei-ms等)偶联进行的lc分析上成功地测试了该软件。

如上文所公开，本发明人成功找到了适当的参照混合物，其覆盖所有分析时间，并在不同实验条件下显示出规律的洗脱谱。

因此，由于本文公开的tag同系列的规律的保留行为以及本发明的方法的鲁棒性，构建表2是可能的。

表2包含所有鉴定的化合物的列表，根据它们的洗脱时间排序，连同作为样品间平均值附近的置信区间报道的它们的pn和计算lri。还报道了距平均值的绝对实验最大差(δlri)，且可考虑用于数据库搜索。使用正态概率分布以95％置信水平评估置信区间，假设方法的不确定性等于对每个lri值获得的所有标准偏差的平均值。这样的假设源自标准偏差分布可以近似为pearsonchi-square(χ²)函数的事实。因此，它与被测变量无关，而只与其自由度有关，自由度对应于同一变量的维数或总体。在这种特定情况下，lri值的总体(p)，在下表2中的括号内表示，对应于包括特定化合物的样品数(每个一式两份，因为每个样品都进行了两次分析)。

表2

鉴定的化合物连同它们的pn、lri和δlri值的列表

^*样品间平均值；^#单酰甘油种类；^$二酰甘油种类；^a外推值；p：总体；^§ce＝胆固醇酯，其pn与结合于胆固醇骨架的脂肪酸的pn一致。

表2还代表了可用作液相色谱中的有效鉴定工具的参照保留指数的保留指数库(即数据库)。所述保留指数库列表，但不限于，借助基于公开的保留指数系统的即时方法获得的，根据它们的保留行为鉴定的总共224种化合物。特别地，数据库可以包括所有简单和复杂的脂质，诸如，例如游离脂肪酸、单酰甘油、二酰甘油和三酰甘油，以及甾醇、类胡萝卜素和蜡。

所有化合物的置信区间长度≤12个单元；其结果是，连续tag之间的差(即δlri)高于12个lri单元避免了任何峰错配。如上文所公开，事实上，仅基于本发明的保留指数系统的鉴定本身是可靠的，并可得出明确的鉴定(即不发生保留指数重叠)。

在这种背景下，色谱分辨率取得特殊的重要性；它与所谓的分离数(sn)密切相关，其表示在同系列的两个连续tag(分别为z和z+6)之间可以分辨的峰数：

其中，

tr(z+6)和trz是同系列的两个连续的tag的保留时间，且wh(z+6)和whz是对应的半高峰宽。

通过将式5应用于z＝39和z＝45区域(任意选择，因为该区域中包含大量tag)，sn等于25，这意味着在c13c13c13和c15c15c15标准化合物之间可以满意地分辨出25个峰。因此，两个相邻峰之间的最小保留指数差(即δ)必须是：

δ＝600/(sn+1)

在目前的情况下等于23，这大大克服了上述获得的δlri。为了实现准确的库搜索结果，实验lri间隔长度(即δlri^*2)必须还小于δ值(δlri^*2<δ)。例如，在3900-4500lri区域内，其δ等于23，δlri不应超过11.5的值(δ/2，以下也称最大可容忍可变性)，这意味着更大的变化将导致相邻峰之间的重叠。因此，如果两个相邻峰具有的lri差异等于或高于23，且指数可变性低于±11.5，则不会发生错配或错误鉴定。因此，对所有连续参照化合物峰进行了sn和δ计算，发现对于每个区域，δ等于或甚至高于实验lri间隔长度(δ≥δlri^*2)。特别地，获得了总sn为122且平均δ为30单元，意味着δlri值小于15通常确保可靠的鉴定(δ/2≥δlri)，从而证明本发明的方法有高准确性。作为证明，下面提供了表3。

表3

*外推值

它示出了最常见的鉴定的化合物及其lri值，表示为平均值±实验可变性，以及每对相邻同系物的sn值，从中可以推断出最大可容忍可变性。实验可变性低于色谱图的所有区域的最大可容忍可变性，证明了即刻法的有效性。

图6中示出了同系列色谱图，以及每对相邻同系物的sn和δlri值两者。

考虑到分析物的平均峰宽(wb)，可产生类似的考虑。事实上，wb＝0.8min(48s)且1lri＝25min/600＝0.042min(2.52s)，其中25分钟是c13c13c13和c15c15c15保留时间之间的时间差，lri可变性(δlri)为±15单元对应于0.63min(37.8s)，结果比wb小(即δlri<wb)。也就是说，所获得的保留指数具有的测定重复性小于未知化合物的基底峰宽。

这样的结果再次证明，在保留时间方面，每个lri仅对应于在色谱图中占据特定位置的化合物，仅基于本发明的保留指数系统就准确指出了潜在鉴定的可靠性。

本发明的新型保留指数系统和基于其的lri数据库已成功鉴定了多种不同的真实脂质样品，诸如但不限于以下：植物油、水生生物(例如鱼和藻类)及其衍生物(例如鱼粉和鱼油)、乳制品和生物样品，如全血、血浆和细胞膜。

优选实施方式的描述

本文所述的实施方式仅具有说明性目的，且不意味着限制所要求保护的发明的范围。此外，对本领域技术人员来说显而易见的下述实施方式的修改和变更，旨在包括在所附权利要求书中。

样品制备

出于本发明的目的，任何脂质样品都是合适的样品。特别地，植物油、鱼油、乳脂肪、乳源性脂肪、其衍生物和组合都是合适的样品。在一些实施方式中，选择了植物油(例如，花生、玉米、大豆、油菜籽、葡萄籽、杏仁、榛子、向日葵、亚麻籽、奇亚(chia)、印加果(sachainchi)、琉璃苣、蓖麻、橄榄)、鱼油(例如，鲱鱼、鱼肝、海鲤、金枪鱼、鱼积分器(fishintegrator)、虾)和乳及乳源性脂肪(例如，山羊、牛、全脂生物乳、水牛芝士、黄油)。

根据本领域已知的用于提取脂质相的任何合适方法进行脂质样品制备(例如，使用有机溶剂或通过分别用于乳样品和鱼样品的folch和bligh&dyer程序进行脂质提取)。通常，以1-10mg/ml的浓度进行注入。

lri计算与数据分析

根据式4计算lri，通过使用根据本发明的奇链tag作为参照同系列(例如，从c9c9c9至c19c19c19)，并通过赋予z一个等于每个参照tag的分配数(pn)的值，其与碳链长度(cn)和双键数(db)相关，根据下式：

pn＝cn-2db

因此，对于c9c9c9，z等于27，对于c19c19c19，z高至57，且n等于6。

通过使用cromatoplusspectra软件(chromaleont,messina,意大利)建立lri数据库，该软件也能够外推在c9c9c9之前和在c19c19c19之后洗脱的化合物的lri值。然后，通过使用cromatoplusspectra软件进行分析，该软件允许将为每个峰自动计算的lri直接与之前创建的lri数据库的lri进行匹配。

方法独立性的证据：重复性研究

本发明的发明人已成功建立了新型保留指数系统，使得基于其的色谱方法不仅能够为范围广泛的脂质样品提供最大分辨率，而且也独立于所选择的色谱条件，且因此，在实验室内和实验室间水平上是可重复的。

在方法重复性方面，本发明的发明人还进行了系统研究，以在大范围的实验条件下评估lri稳定性。特别地，通过注入包括总共54种tag的三种植物油(琉璃苣油、亚麻籽油和橄榄油)准确评估了在色谱分离中发挥作用的所有分析参数，诸如，例如柱尺寸、固定相装填、流速、温箱温度、梯度和流动相组成。这种重复性研究并不限于所选择的油，而是代表了本色谱法适用的所有脂质样品。

关于柱，比较了两种不同的固定相装填：单分散2μm之下(粒径1.9μm)和部分多孔(粒径2.7和2.0μm)颗粒。此外，使用了不同的柱尺寸：100×2.1mm，l×id，以400μl/min运行，以及100×4.6mm，l×id，以1.8ml/min运行，目的是评估内径的影响。还通过考虑两列连续偶联的柱来改变固定相床长度。结果在下表4中报告，其包含tag以及其每个柱上的pn和lri值的列表。还提供了样品间平均值和δlri。实验表明，由于获得可变性(δlri)≤15，本发明的方法独立于柱尺寸和固定相装填两者。

表4

^a流速400μl/min，梯度：0-105min，0-50％b(保持20min)；^b流速400μl/min，梯度：0-52.5min，0-50％b(保持10min)；^c流速1.8ml/min，梯度：0-52.5min，0-50％b(保持10min)。所有分析中温箱温度均为35℃。

还值得注意的是，尽管之前的工作教导使用宽孔柱(即4.6mmi.d或更大)，但本发明的方法使用窄孔柱(2.1mmi.d)并以较小的流速运行，除了显著节省了溶剂之外，还允许与ms检测器进行更直接的偶联(如果有的话)。

然后选择部分多孔100×2.1mm，l×id，2.0μmdp的柱用于评估其他参数的影响。

然后在梯度模式下(即0-52.5min，0-50％b(持续10min))于35℃下比较了三种不同的流速：300μl/min、400μl/min和500μl/min。下表5示出了以不同流速计算的lri值以及它们的平均δrli，突出了在所有条件(δlri≤10)之间的完美的一致，并得出结论，本发明的方法是独立的，甚至独立于流速。

表5

关于洗脱相的梯度，比较了三种不同的梯度倾斜度(％b/min)，即，0.95％b/min、1.4％b/min和0.70％b/min。下表6示出了以不同梯度倾斜度计算的lri值，以及它们的平均δrli，再次证明这种变化(δlri≤15)不会显著影响本方法。

表6

关于温度，比较了在30-40℃范围内的三种不同的温箱温度，即，30℃、35℃和40℃，得出结论，10℃的变化可以影响lri值，而5℃差异对色谱方法不具有大的影响。下表7示出了30和35℃之间以及35和40℃之间两者的平均值，连同它们的δlri值，再次显示，本发明的方法是可靠的且可重复的，甚至在存在温差(即最大至5℃)且最大δlri等于13的情况下。

表7

因此，成功地证明了本发明的方法几乎独立于色谱设备所涉及的所有变量。

进行保留指数重复性研究，目的是评估和证明本新型鉴定方法的鲁棒性，并使lri数据库可以在实验室内和实验室间两水平上使用。

通过ms分析的可靠性研究

在表2中列出的224种化合物中，代表植物油的54种tag通过hplc-esi-ms分析确认为阳性，而uhplc-esi-ms分析对于确认鱼样品和乳样品的鉴定是必需的。所获得的结果表明本发明的方法具有很高的可靠性。

然而，如果完全共洗脱，则不同化合物可能具有相同的lri。然而，它们也呈现相同的质谱是不可能的。为此目的，对琉璃苣油、亚麻籽油和橄榄油进行了hplc-esi-ms分析，为通过uhplc-elsd方法对植物油中常见的54种tag的初步鉴定提供了证明。同样在该情况下，为了验证lri库搜索的正常运行，即使用lri数据库以实现可靠的鉴定，必须对在不同仪器设置，即uhplc-elsd和hplc-esi-ms，上计算的lri值进行比较。

下表8包含在三种油中鉴定的最丰富的tag以及平均值和δlri值的比较，而图7在柱状图中报道了平均值，每个都有相应的δlri。

表8

由uhplc-elsd和hplc-esi-ms计算的平均lri、δlri和lri值。

相反，本发明的色谱方法也可用于辨别具有非常相似或相同的质谱的化合物。综上所述，使用保留指数于lc与ms联用中，特别是ei-ms或api-ms中，确实通过提供第二个独立的实验值显著提高了峰鉴定的可靠性。

其他实施方式

本文所述的实施方式和实施例仅具有说明性目的，且它们不意味着限制所要求保护的本发明的范围。对其他脂质种类，诸如游离脂肪酸、单酰甘油和二酰甘油以及甾醇、类胡萝卜素和蜡的鉴定落入本发明的范围内。事实上，发明人计划在不久的将来使本方法适用于对不同真实样品的整体脂质分析。还清楚的是，本发明的保留指数数据库可以通过包括其他脂质种类的保留指数而扩大，诸如，例如游离脂肪酸、甘油单酯和甘油二酯以及甾醇、类胡萝卜素和蜡的保留指数，用于实现不同真实样品的所有脂质种类保留行为(例如，tr和ri)的全面的数据库。本发明人还计划将保留指数系统应用于还适用于测定极性脂质(诸如磷脂)的色谱法。

实施例

样品制备

实施例1：蔬菜样品制备

通过将10mg的油溶解于10ml的2-丙醇中来制备植物油样品，除了对于琉璃苣油，是将10mg溶解于1ml的相同溶剂中。

实施例2：乳样品制备(通过folch)

将10ml的乳用40ml的氯仿:甲醇混合物(1:2v/v)处理，并在磁力搅拌下置于冰浴中30分钟；将内容物转移到分液漏斗中，并用力摇晃5分钟；然后，将混合物收集到不同的试管中，并以3000rpm离心15分钟。一旦获得相分离，则将下层相(包括脂质部分)汇集在一起，将上层相(水相)再次加入分液漏斗中，以用20ml的氯仿:甲醇混合物(2:1v:v)进一步提取。再次重复最后一步。将汇集的有机相在无水硫酸钠上过滤，并使用旋转蒸发器蒸发。

实施例3：鱼样品制备(通过bligh&dye)

将10g的鱼组织称重，并制成小块。用30ml的氯仿:甲醇混合物(1:2v:v)提取样品，并使用ultraturrax设备均匀化10min。然后，加入10ml的氯仿和18ml的蒸馏水，并再均匀化1min；将混合物收集到不同的管中，并以3000rpm离心15min。汇集下层有机相，同时用20ml10％(v/v)氯仿中的甲醇再次提取上层水相。然后，将所有的有机相汇集在一起，过滤，使用旋转蒸发器无水蒸发。

仪器和优选的分析条件

实施例4：hplc-esi-ms

通过使用由四元泵、自动取样器和柱恒温器组成的watersalliancehplc2695分离模块与micromassquattro微型api轻便三重四极杆质谱(watersassociatesinc，milford，ma，美国)联用进行分析。在ascentisexpressc18100×2.1mm(l×id)，2.0μmdp柱(milliporesigma)上进行分离。流动相为(a)乙腈:10mm甲酸铵水溶液95:5(v:v)和(b)2-丙醇，在梯度条件下：0-52.5min，0-55％b(保持17.5min)。流速设置为400μl/min，且温箱温度为35℃；注入体积为2μl。ms采集使用以正电离模式运行的z型喷雾的电喷雾(esi)源进行，条件如下：质谱范围，250-1250m/z；活动时间，1秒；脱溶气体(n2)流速，700.0lhr^-1；没有应用锥气体；源温度150℃；脱溶温度，250℃；毛细管电压，3kv；锥电压，80v；提取器电压，3v；rf透镜，0.2v。

实施例5：uhplc-elsd

通过使用由cbm-20a控制器、两个lc-30ad双塞并流泵(120.0mpa最大压力)、dgu-20a5r脱气器、cto-20ac柱温箱、sil-30ac自动取样器和spdm30apda检测器(1.8μl检测器流动细胞体积)组成的nexerax2系统(shimadzu，京都，日本)进行分析。将uhplc系统与elsd(蒸发光散射检测器)检测器(shimadzu)偶联。在两个连续偶联的titanc18100×2.1mm(l×id)，1.9μmdp柱(milliporesigma，bellefonte，pa，美国)上进行分离。流动相为(a)乙腈和(b)2-丙醇，在梯度条件下：0-105min，0-50％b(保持20min)。流速设置为400μl/min，且温箱温度为35℃；注入体积为5μl。应用以下elsd参数：蒸发温度60℃，雾化气体(n2)压力270kpa，检测器增益＜1mv；取样频率：10hz。

实施例6：鉴定真实脂质样品

使用本发明所述的色谱实施方式和lri方法将不同的鱼油和植物油进行注入和阳性鉴定。

下图8示出了根据实施例3(bligh&dyer方法)中报道的程序提取，并根据实施例5(uhplc-elsd方法)中报道的仪器设置和分析条件进行分析的海鲈鱼脂质样品的色谱图。在色谱图和表9两者中均报道了仅基于lri鉴定方法的峰鉴定。阳性鉴定了总共30种tag，列表的值和实验值之间的差δlri≤15。此外，通过hplc-esi-ms分析确认了所有鉴定的化合物。数据库的扩大可以确保大量化合物的鉴定。

表9：在海鲈鱼样品中获得的鉴定峰的pn值、lritab值、lriexp值和值