用于扩展范围的灵敏度的联合免疫测定和磁免疫测定方法与流程
本申请要求2016年12月9日提交的美国临时申请号62/432,283的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
发明领域
本发明涉及确定现场护理测试(point-of-caretesting)中的分析物的系统和方法。特别地，本发明涉及利用免疫测定和磁免疫测定技术的组合来检测特定浓度的扩展范围(extendedrange)内的分析物的系统和方法。
发明背景
现场护理(poc)样品分析系统通常基于一个或多个可重复使用的测试仪器(instrument)(例如，读取设备(apparatus))，其使用一次性使用的一次性测试装置(device)(例如，包括分析元件的筒(cartridge)或条带)执行样品测试，例如用于传感诸如ph、氧气和葡萄糖这样的分析物的电极或光学器件(optics)。一次性测试装置可包括流体元件(例如，用于接收样品并将样品递送到传感电极或光学器件的导管)、校准元件(例如，用于使用已知浓度的分析物标准化电极的含水流体)以及用于标准化光学器件的具有已知消光系数的染料。仪器或读取设备包括电路和用于操作电极或光学器件以进行测量和执行计算的其他部件。仪器或读取设备还具有显示结果并将这些结果传送到实验室和医院信息系统(分别为lis和his)的能力，例如，通过计算机工作站或其他数据管理系统。仪器或读取设备与工作站之间以及工作站与lis或his之间的通信可以通过例如红外链路、有线连接、无线通信或能够进行发送和接收电子信息的任何其他形式的数据通信或其任何组合。一种著名的现场护理系统(i-
现场护理样品测试系统的一个益处在于消除了将样品送至中心实验室进行测试的耗时需求。现场护理样品测试系统允许在患者床边的护士或医生(使用者或操作者)获得可靠的定量分析结果，有时质量可与实验室中获得的质量相当。在操作中，护士选择具有所需测试组的测试装置，从患者抽取生物样品，将其分配到测试装置中，任选地密封测试装置，并将测试装置插入仪器或读取设备中。虽然步骤发生的特定顺序可以在不同的现场护理系统与提供者之间变化，但提供接近患者位置的快速样品测试结果的意图仍然存在。然后仪器或读取设备执行测试循环，即执行测试所需的所有其他分析步骤。这种简单性使医生能够更快地了解患者的生理状态，并通过减少诊断或监测的周转时间(turnaroundtime)，使医生能够更快地决定适当的治疗，从而增加患者成功结果的可能性。
诸如肌钙蛋白测试的心脏标志物测试是一种这样的诊断测试，其受益于通过poc样品分析系统提供的更快的周转时间。国家和国际心脏病学指南建议从血液采集时间到报告时间，向急诊科人员报告所测量的心肌标记物(如肌钙蛋白)的结果需要一小时的周转时间。poc样品分析系统的使用减少了从中心实验室测定报告心脏标志物结果的周转时间，但目前的poc样品分析系统不像中心实验室测定那样精确或灵敏。事实上，中心实验室测定与poc样品分析系统之间在精密度和灵敏度方面的差距正在增大，因为中心实验室测定的制造商已经或将要发布具有约10ng/l的第99个百分位数截止值和<1ng/l的检出限的肌钙蛋白测定，其目前不适用于现有的poc测试测定。这些高灵敏度检测能够检测大多数健康受试者的肌钙蛋白，而临床上，这可以检测更多的心肌损伤病例。
为了在分析上与这些中心实验室测定进行竞争，下一代poc测试测定将需要进行技术进步。因此，仍然需要扩展用于样品测试装置(例如，一次性使用的血液测试筒)的灵敏度范围的系统和方法，所述样品测试装置与在医院或其他位置的poc中的一个或多个测试仪器一起使用以递送医疗护理。
技术实现要素：
在一个实施方案中，提供了进行免疫测定的方法，所述免疫测定用于确定生物样品中的分析物浓度。所述方法包括将第一干燥试剂和第二干燥试剂溶解进入生物样品中。第一干燥试剂包括信号抗体，第二干燥试剂包括固定在磁珠上的捕获抗体，并且信号抗体和捕获抗体被配置成结合分析物。所述方法还包括将第一干燥试剂和第二干燥试剂溶解进入生物样品中，其中第一干燥试剂包括信号抗体，第二干燥试剂包括固定在磁珠上的捕获抗体，并且信号抗体和捕获抗体被配置成结合分析物，形成信号抗体与分析物的第一复合物，形成第一复合物和固定在磁珠上的捕获抗体的第二复合物，并使第一免疫传感器与包含第一复合物和第二复合物的生物样品接触，从而形成定位在第一免疫传感器表面上或其附近的第三复合物。第一免疫传感器包括固定的捕获抗体层，其被配置成结合分析物，并且第三复合物包括与固定的捕获抗体层结合的第一复合物。
所述方法还包括使定位在第二免疫传感器附近的磁场与包含第一复合物和第二复合物的生物样品接触，使得第二复合物定位在第二免疫传感器的表面上或其附近，并施加流体以从第一免疫传感器和第二免疫传感器洗涤生物样品。洗涤液包含配置成与信号抗体反应的底物。所述方法还包括测量第一免疫传感器处的第一信号，所述第一信号来自底物与第三复合物中定位在第一免疫传感器表面上或其附近的信号抗体的反应，测量第二免疫传感器处来自底物与第二复合物中信号抗体的反应的第二信号，所述信号抗体定位在第二免疫传感器的表面上或其附近，并且根据第一信号和第二信号中的至少一种确定生物样品中的分析物的浓度。
任选地，第一免疫传感器和第二免疫传感器是电化学免疫传感器，且第一信号和第二信号是电化学信号。
在一些实施方案中，所述信号抗体与酶，例如碱性磷酸酶缀合，并且所述底物是磷酸化分子，其被配置使得当磷酸酯(phosphate)部分被除去时，所述分子变为电活性的。
在另一个实施方案中，提供一种方法，包括将具有目标分析物的样品引入传感装置的样品室，并且将样品从样品室移动至含传感器芯片的导管。传感器芯片包括第一免疫传感器和第二免疫传感器，所述第一免疫传感器具有固定的捕获抗体层，所述捕获抗体被配置为与靶分析物结合，且所述第二免疫传感器具有定位在第二免疫传感器附近的磁场。所述方法还包括在生物样品中形成第一复合物和第二复合物。第一复合物包括信号抗体和目标分析物，第二复合物包括第一复合物和固定在磁珠上的捕获抗体。所述方法还包括使第一免疫传感器与包含第一复合物和第二复合物的生物样品接触，从而形成定位在第一免疫传感器表面上或其附近的第三复合物。第三复合物包括与固定的捕获抗体层结合的第一复合物。
所述方法还包括使定位在第二免疫传感器附近的磁场与包含第一复合物和第二复合物的生物样品接触，使得第二复合物定位在第二免疫传感器的表面上或其附近，将底物施加至第一免疫传感器和第二免疫传感器，测量第一免疫传感器处的第一信号，所述信号来自底物与第三复合物中定位在第一免疫传感器表面上或其附近的信号抗体的反应，测量第二免疫传感器处的第二信号，所述信号来自底物与第二复合物中定位在第二免疫传感器的表面上或其附近的信号抗体的反应，并且从第一信号和第二信号中的至少一种确定生物样品中的目标分析物的浓度。
任选地，第一免疫传感器和第二免疫传感器是电化学免疫传感器，且第一信号和第二信号是电化学信号。
在一些实施方案中，信号抗体与酶，例如碱性磷酸酶缀合，并且底物是磷酸化分子，其被配置使得当除去磷酸酯部分时，所述分子变为电活性的。
在另一个实施方案中，提供非临时性机器可读存储介质，其具有存储在其上的指令，当由一个或多个处理器执行时，所述指令使得所述一个或多个处理器执行包括将具有目标分析物的样品从样品室移动至导管的方法，所述导管包括传感器芯片、第一干燥试剂和第二干燥试剂。移动导致第一干燥试剂和第二干燥试剂溶解进入样品中并形成第一复合物和第二复合物，所述第一复合物包括信号抗体和目标分析物，且所述第二复合物包括第一复合物和固定在磁珠上的捕获抗体。传感器芯片包括第一免疫传感器和第二免疫传感器，所述第一免疫传感器具有固定的捕获抗体层，所述捕获抗体被配置为与靶分析物结合，第二免疫传感器具有定位在第二免疫传感器附近的磁场。所述方法还包括将样品移动到与第一免疫传感器接触，使得第一复合物和第二复合物形成定位在第一免疫传感器表面上或其附近的第三复合物。第三复合物包括与固定的捕获抗体层结合的第一复合物。
所述方法还包括将样品移动到与定位在第二免疫传感器附近的磁场接触，所述第二免疫传感器具有生物样品，其包含第一复合物和第二复合物，使得第二复合物定位在第二免疫传感器的表面上或其附近，移动底物与第一免疫传感器和第二免疫传感器接触，测量第一免疫传感器处的第一信号，所述信号来自底物与第三复合物中定位在第一免疫传感器表面上或其附近的信号抗体的反应，测量第二免疫传感器处的第二信号，所述信号来自底物与第二复合物中信号抗体的反应，所述信号抗体定位在第二免疫传感器的表面上或其附近，并且确定来自第一信号和第二信号的至少一种的生物样品中的目标分析物的浓度。
在一些实施方案中，将具有目标分析物的样品从样品室移动到导管包括使样品在第一干燥试剂和第二干燥试剂上振荡，所述第一干燥试剂和第二干燥试剂安置在传感器芯片的表面上。
在替代实施方案中，移动底物接触第一免疫传感器接触和第二免疫传感器包括开启泵，所述泵刺穿具有底物的包装并将底物排出进入与包括传感器芯片的导管流体连通的另一导管中。
附图简要说明
根据以下非限制性附图，将更好地理解本发明，其中：
图1示例本发明一些方面的肌钙蛋白免疫测定的进化；
图2示例本发明一些方面的组合免疫测定的原理；
图3显示本发明一些方面的现场护理仪器系统；
图4和5a-5j显示本发明一些方面的传感装置或筒；
图6a显示本发明一些方面的传感器芯片的制造的侧视图；
图6b、7、8a和8b显示本发明一些方面的传感器芯片配置；
图9a-9c示例本发明的一些方面的用于将磁体(magnet)安置在筒内的传感器芯片下方的各种示例性配置；
图10示例本发明的一些方面的用于将传感器安置在筒内的传感器芯片上的示例性配置；
图11a和11b显示了根据本发明的一些方面部分覆盖有脱离暴露的免疫传感器的部分周边(perimeter)的印刷磁层的示例性免疫传感器；
图12示例本发明一些方面的蚀刻沟槽方法；
图13示例本发明的一些方面的用于将传感器安置在筒内的传感器芯片上的示例性配置；
图14-17显示了本发明一些方面的方法；且
图18显示示例本发明的一些方面的能够在扩展浓度范围内确定样品中分析物的浓度影响的示意图。
发明详述
简介
心肌肌钙蛋白(ctn)是用于诊断急性心肌梗塞(ami)和未来严重心脏事件的风险分层的主要生物标志物。然而，中心实验室测定与心肌肌钙蛋白测试的poc样品分析系统之间的分析灵敏度差距已经增大，并且可能会妨碍某些医院的poc测试的采纳。可能还需要可以检测其他生物标志物或多种生物标志物的poc样品分析系统。例如，虽然心肌肌钙蛋白是ami诊断的主要分析物，但b型利钠肽(bnp)和nt-probnp已被证明可用于短期风险分层。高灵敏度心肌肌钙蛋白(hs-ctn)的检测也可用作初级保健中的风险分层标记物，即针对无症状的患者。这是基于观察到，在没有急性冠状动脉综合征存在下，心肌肌钙蛋白增加与心脏不良结果的高风险相关。如果这些生物标志物的检测被采纳作为高风险患者的常规医疗护理的一部分，则当在医生办公室和诊所进行测试时，对hs-ctn的poc测试可能是有用且便利的。
肌钙蛋白在健康患者中通常是不可检测的。肌钙蛋白的绝对异常值根据评估患者的临床环境和使用的测定的不同而改变。在出现胸痛和可能的心肌梗塞(mi)的患者中，使用具有可接受精密度的测定，异常值典型地高于健康人群的第99个百分位数作为截止值。众所周知，ctnt和ctni检测的第99个百分位数分别为0.012-0.016ng/ml和0.008-0.058ng/ml。ctni测定的第99个百分位数浓度的更宽范围来源于使用不同抗体和测定方法的许多不同检测测定。pocctn测定通常具有更高的第99个百分位数值，部分原因是与目前的实验室ctn测定相比分析噪声增加且灵敏度降低。例如，众所周知，在中心实验室测定中ctnt检测的第99个百分位数的截止值在0.01ng/ml。相反，在肌钙蛋白poc样品分析系统中的ctnt检测的第99个百分位数的截止值典型地约为0.05-0.08ng/ml。
肌钙蛋白poc样品分析系统典型地基于分析物与抗体的反应。在检测区的有限范围内，分析灵敏度是测定以尽可能最佳精密度捕获尽可能多的分析物的能力的直接函数。如每一测定的参考上限的第99个百分位数的变异系数(cv)所描述的最佳精密度(如图1所示)通常定义为小于或等于10％。更高的精密度(小于或等于10％的cv)允许更灵敏的测定并且有助于检测变化的值并降低测定的第99个百分位数决定限(decisionlimit)。尽管如此，开发满足这些需求并降低测定的第99个百分位数决定限的poc样品分析系统一直是具有挑战性的。
测定性能的增强需要增加(i)空白限(limitofblank)(lob)和检测限(lod)与(ii)lod和第99个百分位数之间的分辨率。当测试不含分析物的空白样品的平行测定(replicates)时，lob是预期发现的最高表观分析物浓度。lod是可能与lob可靠地区分并且检测是切实可行的最低分析物浓度。通过利用已知含有低浓度分析物的样品的测量的lob和测试平行测定来确定lod。定量限(loq)是分析物不仅可以被可靠地检测到、而且是满足偏差和不精密度的一些预定目标的最低浓度。loq可能等同于lod，或者它可能处于更高的浓度。灵敏度、分析灵敏度、检测下限、lob、lod和loq都是用于描述分析物的最小浓度的术语，其可以通过该测定可靠地测量。
在免疫测定中改善(i)lob和lod与(ii)lod和第99个百分位数之间的灵敏度或增加分辨率的方式之一在于改善信噪比。例如，可以通过增加系统的信号产生能力或减少系统产生的背景信号来实现免疫测定中灵敏度的改善。可以根据“灵敏度斜率”或每单位分析物产生的信号量来考虑信号产生能力：斜率＝(电流(na))/(浓度(ng/ml))和由此浓度(ng/ml)＝(电流(na))/(斜率(na/ng/ml)。在常规poc样品分析系统中，例如美国专利号7,419,821中描述的那些，其通过引用整体并入本文，传感器上涂覆有生物层，所述生物层包含共价连接的抗肌钙蛋白抗体，肌钙蛋白和酶-抗体缀合物(conjugate)的复合物与之结合。酶-抗体缀合物由此固定在靠近电极的位置，其比例与样品中最初存在的肌钙蛋白的量成正比。除了特异性结合之外，酶-抗体缀合物还可以非特异性地结合传感器。非特异性结合提供来自传感器的背景信号，其为不期望的并且应被最小化。为了解决该问题，美国专利号7,419,821公开了使用漂洗方案，且特别是使用分段流体漂洗传感器，作为减少背景信号的手段。poc样品分析系统(例如美国专利号7,419,821中描述的那些)具有约4na/ng/ml的信号产生能力或“灵敏度斜率”并且对于检测高水平的生物标志物如肌钙蛋白特别有效(即，高端灵敏度)。
然而，基于10μl的样品大小(典型地为poc样品分析系统)和可能以这样的样品大小存在的许多分析物分子，理论最大斜率约为1200na/ng/ml。据信，常规的poc样品分析系统仅具有约4na/ng/ml的信号产生能力，因为包含共价连接的抗肌钙蛋白抗体的生物层固定在传感器表面上或靠近传感器表面，且由此仅与传感器表面接触的分析物经受捕获和分析(例如，估计样品中所有分析物的0.3％经受捕获和分析)。
为了增加超过4na/ng/ml的信号产生能力或“灵敏度斜率”并增加免疫测定用于检测低水平生物标志物，例如肌钙蛋白(即，低端灵敏度)的有效性，常规的poc样品分析系统、例如美国专利号9,233,370中描述的那些(其全部并入本文)是采用磁敏感的(susceptible)珠捕获技术开发的。磁敏感的珠捕获技术允许酶-抗体缀合物定位在传感器表面上或接近传感器表面，并且在去除未结合的样品和洗涤传感器去除非特异性结合期间，起实质上将酶-抗体缀合物保留在传感器处或附近的作用。poc样品分析系统、例如美国专利号9,233,370中描述的那些具有约40na/ng/ml的信号产生能力或“灵敏度斜率”(即，非磁性免疫测定的信号产生能力的10倍)并且在检测低水平的生物标志物如肌钙蛋白(即低端灵敏度)方面特别有效。尽管如此，常规的poc样品分析系统远未达到约1200na/ng/ml的理论最大斜率。
为了改进常规poc样品分析系统的信号产生能力并提高免疫测定检测低水平生物标志物如肌钙蛋白(即低端灵敏度)的有效性，本发明的一个实施方案涉及一种扩展范围的磁传感器装置，其具有位于第一传感器(例如，电流分析传感器)上方的固定抗体捕获位点和位于具有下方设置高场磁体的第二传感器(例如，电流分析传感器)上方的另一抗体捕获位点。两个传感器各自对分析物(例如，ctn)具有灵敏度，但由于每个相应传感器使用的捕获试剂的差异而具有不同的灵敏度。第一传感器典型地是较低灵敏度传感器(斜率小于5na/ng/ml)，并且对于检测高水平的分析物如肌钙蛋白(即高端灵敏度)特别有效。第二传感器典型地是较高灵敏度的传感器(斜率大于7na/ng/ml)，并且对于检测低水平的分析物如肌钙蛋白(即低端灵敏度)特别有效。因此，在单个装置上实施较低灵敏度传感器和高灵敏度传感器扩展可使用所述装置检测的分析物的浓度范围。
两个传感器之间的分析物和标记试剂结合位置的差异很大程度上归因于它们对分析物的灵敏度的差异。两种传感器之间的灵敏度差异可以通过顺磁试剂溶解到样品与样品在第一传感器上的安置之间的时间的变化来进一步控制。可以通过改变测定中使用的顺磁抗体涂覆的颗粒的浓度来实现对两个传感器之间的灵敏度的进一步控制。控制传感器灵敏度的另一种技术可以通过控制顺磁试剂和第一传感器上的抗体浓度、亲和性或亲合力来进行。
前述技术方案在改善poc样品分析系统的信号产生能力并提高免疫测定用于检测低水平生物标记物，例如肌钙蛋白(即，低端灵敏度)的有效性时的优点在于它将通过增加(i)空白限(lob)和检测限(lod)与(ii)lod和第99个百分位数之间的分辨率来消除技术问题。例如，本发明的实施方式提供了超过常规poc样品分析系统和方法的技术贡献，因为本发明的技术特征可互操作以在单个装置上提供较低灵敏度传感器和高灵敏度传感器，这扩展可以使用所述装置检测的分析物的浓度范围。
免疫测定
图2示例根据本发明具体实施方案的组合免疫测定(例如，一步组合免疫测定)200的原理，其扩展可以使用分析器检测的目标分析物如肌钙蛋白i(tni)或心肌肌钙蛋白i(ctni)的浓度范围。在不同的实施方案中，组合免疫测定200包括非磁免疫测定技术205，其利用被配置成结合目标分析物215的酶-生物分子缀合物210和固定在非磁传感器(即，非均匀表面捕获免疫传感器)的表面上或附近的捕获生物分子220(例如，由捕获生物分子涂覆的乳胶珠或微球)。捕获生物分子220被配置成结合与酶-生物分子缀合物210结合的目标分析物215，使得酶-生物分子缀合物210被捕获并固定在非磁传感器的表面上或附近。非磁传感器可以以足以氧化或还原水解底物(substrate)的产物而不是直接底物的固定电化学电位(potential)被钳制(clamped)，或者可以将电位扫过适当范围一次或多次。组合免疫测定200还包括磁免疫测定技术225，其利用被配置成结合目标分析物215的酶-生物分子缀合物210和捕获生物分子230(例如，用捕获生物分子涂覆的磁珠或微球)。捕获生物分子230被配置成结合到与酶-生物分子结合物210结合的目标分析物215。结合与酶-生物分子结合物210结合的目标分析物215的捕获生物分子230可以通过磁体吸引在磁传感器的表面上或附近(即，均匀磁珠捕获免疫传感器)，使得酶-生物分子缀合物210被捕获并固定在磁传感器的表面上或附近。磁传感器可以以在足以氧化或还原水解底物的产物而不是直接底物的固定电化学电位被钳制，或者可以将电位扫过适当范围一次或多次。
酶-生物分子缀合物210包括与选择用于结合目标分析物的生物分子缀合的酶。在一些实施方案中，酶是碱性磷酸酶(alp)、辣根过氧化物酶或葡萄糖氧化酶，并且生物分子选自离子载体、辅因子、多肽、蛋白质、糖肽、酶、免疫球蛋白、抗体、抗原、凝集素、神经化学受体、寡核苷酸、多核苷酸、dna、rna或适合的混合物。在一些实施方案中，可选择生物分子以结合人绒毛膜促性腺激素、肌钙蛋白i、肌钙蛋白t、肌钙蛋白c、肌钙蛋白复合物、肌酸激酶、肌酸激酶亚单位m、肌酸激酶亚单位b、肌红蛋白、肌球蛋白轻链中的一种或多种链或这些的修饰片段。通过氧化、还原、缺失、添加或修饰至少一种氨基酸产生这种修饰的片段，包括用天然部分或用合成部分进行化学修饰。例如，可以选择生物分子作为单克隆或多克隆抗-肌钙蛋白i抗体(例如biospacific–peptide4(g-130-c),hytest–560(19c7,目录号4t21–单克隆肌钙蛋白iab)和internationalpointofcare–8i7(目录号ma-1040)。在某些实施方案中，所述生物分子特异性结合分析物并且对于结合分析物配体具有约107-1015m-1的亲和常数。
捕获生物分子220可以作为沉积在非磁传感器的至少一部分上或附近的生物层提供。生物层是多孔层，在其表面上包含足量的生物分子，其可以结合目标分析物，或通过产生能够测量的变化来响应这种分析物的存在。任选地，可以在非磁传感器与生物层之间插入选择性渗透筛选层以筛选电化学干扰物，如美国专利5,200,051中所述，该专利以其整体并入本文。
在一些实施方案中，生物层由特定直径在约0.001至50微米范围内的乳胶珠构建(例如，thermofisheroptilinkcarboxylate-modifiesmicroparticles(目录号83000591100351)，0.2um直径)。可以通过共价连接任何适合的生物分子来修饰珠，所述生物分子可以结合目标分析物，或者通过产生能够测量的变化来响应这种分析物的存在。本领域存在许多连接方法，包括提供胺反应性n-羟基琥珀酰亚胺酯基团，其用于便利地偶联赖氨酸或蛋白质的n-末端胺基团。在某些实施方案中，生物分子选自离子载体、辅因子、多肽、蛋白质、糖肽、酶、免疫球蛋白、抗体、抗原、凝集素、神经化学受体、寡核苷酸、多核苷酸、dna、rna或适合的混合物。在一些实施方案中，可选择生物分子以结合人绒毛膜促性腺激素、肌钙蛋白i、肌钙蛋白t、肌钙蛋白c、肌钙蛋白复合物、肌酸激酶、肌酸激酶亚单位m、肌酸激酶亚单位b、肌红蛋白、肌球蛋白轻链中的一种或多种或这些的修饰片段。通过氧化、还原、缺失、添加或修饰至少一种氨基酸产生这种修饰的片段，包括用天然部分或用合成部分进行化学修饰。例如，生物分子可以选择为单克隆或多克隆抗肌钙蛋白i抗体(例如，sdix–m06(#d2440ma06-ma)和hytest–cap1(19c7,目录号4t21–单克隆肌钙蛋白iab)。在某些实施方案中，生物分子特异性地与分析物结合，并且对于结合分析物配体具有约107-1015m-11的亲和常数。
捕获生物分子230可以作为连接于磁敏感的珠的生物分子提供。磁敏感的珠可以由本领域已知的任何材料组成(comprisedof)，所述材料易于通过在本发明的装置中使用或与其一起使用的磁体(例如，永久磁体或电磁体)移动。因此，关于珠的术语“磁性”和“磁敏感的”可互换使用。
在一些实施方案中，所述珠包括磁芯，其优选完全或部分涂覆有涂覆材料。磁芯可包括铁磁、顺磁或超顺磁材料。在优选的实施方案中，磁敏感的珠包括芯和外聚合物涂层(coating)。在其他实施方案中，磁珠包括非磁基底(substrate)珠，其由例如选自聚苯乙烯、聚丙烯酸和葡聚糖的材料形成，在其上放置磁涂层。在磁敏感的珠包括芯的某些实施方案中，磁芯可包括如下的一种或多种：铁氧体、fe、co、mn、ni，包括这些元素中的一种或多种的金属，这些元素的有序合金，由这些元素组成(comprisedof)的晶体，磁氧化物结构例如铁氧体，以及它们的组合。在磁敏感的珠包括芯的其他实施方案中，磁芯可以由磁体矿(fe3o4)、磁赤铁矿(γ-fe2o3)或由式me1-xofe3+xo3提供的二价金属铁氧体组成，其中me是，例如，cu、fe、ni、co、mn、mg或zn或这些材料的组合，其中x的范围为0.01至99。用于芯上外聚合物涂层的适合材料包括合成和生物聚合物、共聚物和聚合物共混物和无机材料。聚合物材料可包括丙烯酸酯、硅氧烷、苯乙烯、乙酸酯、亚烷基二醇(akyleneglycol)、烯属烃(alkylenes)、环氧烷(alkyleneoxides)、聚对二甲苯(parylenes)、乳酸和乙醇酸的聚合物的各种组合。生物聚合物材料包括淀粉或类似的碳水化合物。无机涂层材料可包括金属、金属合金和陶瓷的任何组合。陶瓷材料的实例可包括羟磷灰石、碳化硅、羧酸盐、磺酸盐、磷酸盐、铁氧体、膦酸盐和元素周期表中第iv族元素的氧化物。
通常，考虑到磁敏感的珠的可分散性要求，可以使用能够与本发明的磁体一起安置的任何适合大小的磁敏感的珠。在优选的实施方案中，至少50wt.％，例如至少75wt.％的磁敏感的珠保留在传感器表面处或附近。在一些示例性实施方案中，磁敏感的珠的平均粒度可以为0.01μm至20μm，例如0.1μm至10μm，0.1μm至5μm或0.2μm至1.5μm。如本文所用，术语“平均粒度”是指颗粒例如珠的平均最长尺寸，例如球形颗粒的直径，如通过本领域众所周知的方法测定的。磁敏感的珠的粒度分布优选是单峰的，不过，根据本发明也可以使用多型分布。虽然优选使用球形磁敏感的珠，但在其他实施方案中，其他珠的形状和结构，例如椭圆形、亚球形、圆柱形和其它不规则形状的颗粒在如本文所用的术语“珠”和“颗粒”的含义内。
用于磁敏感的珠制品的商业来源包括lifetechnologiestm的invitrogentm(carlsbad,california,u.s.a.)、ademtech(pessac,france)、chemicellgmbh(berlin,germany)、bangslaboratories,inc.tm(fishers,in)和seradyn,inc.(indianapolis,in)(例如lifetmtechnologies的invitrogentm-
在一些实施方案中，磁敏感的珠用任何适合的生物分子涂覆，所述生物分子可以结合目标分析物，或通过产生能够测量的变化来响应这种分析物的存在。本领域存在许多连接方法，包括提供胺反应性n-羟基琥珀酰亚胺酯基团，用于便利地偶联赖氨酸或蛋白质的n-末端胺基团。在链霉抗生物素蛋白修饰的磁敏感的珠的情况下，可以修饰生物分子以包括诸如生物素这样的粘合剂以将生物分子连接在珠表面上。例如，生物分子可以连接生物素(例如thermoscientific–ez-连接(link)磺基-nhs-lc-lc-生物素(产品#21338)或ez-连接磺基-nhs-lc-生物素(产品#21335))。在某些实施方案中，生物分子选自离子载体、辅因子、多肽、蛋白质、糖肽、酶、免疫球蛋白、抗体、抗原、凝集素、神经化学受体、寡核苷酸、多核苷酸、dna、rna或适合的混合物。所述生物分子可以被选择为结合如下的一种或多种：人绒毛膜促性腺激素、肌钙蛋白i、肌钙蛋白t、肌钙蛋白c、肌钙蛋白复合物、肌酸激酶、肌酸激酶亚单位m、肌酸激酶亚单位b、肌红蛋白、肌球蛋白轻链或这些的修饰片段。通过氧化、还原、缺失、添加或修饰至少一种氨基酸产生这种修饰的片段，包括用天然部分或用合成部分进行化学修饰。例如，所述生物分子可以被选择为单克隆或多克隆抗肌钙蛋白i抗体(例如biospacific–肽3(g-129-c)和hytest–cap1(19c7,目录号4t21–单克隆肌钙蛋白iab)。在某些实施方案中，所述生物分子特异性结合分析物并且对于结合分析物配体具有约107-1015m-11的亲和常数。
正如应理解的，本发明的实施方案可以在各种不同的系统和环境中实现。某些实施方案特别适用于从底物(例如，氨基苯磷酸(4-aminophenylphosphate))与抗体-酶缀合物(例如，一种或多种结合碱性磷酸酶(alp)的抗体)的反应中检测酶促产生的电活性物种(species)(例如，4-氨基苯酚)的免疫测定。然而，本文所述的系统和技术可用于检测分析物，其中使用除用酶以外的各种标记物标记的生物分子(而不是抗体)。例如，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，本文所述的生物分子可以连接于包括本领域已知的放射性标记、发色团、荧光团、化学发光物种、离子载体、电活性物种和其他的标记物。
正如应进一步理解的，本发明的实施方案可以在各种不同的系统和配置中实施，并且本文使用传感器表面上或附近的术语来描述生物分子复合物与特定传感器的表面之间的关系。在传感器表面上或附近限定生物分子复合物与特定传感器表面之间的工作距离，所述工作距离需要维持，使得可以在特定传感器的表面上测量生物分子复合物与底物的反应产生的信号。在一些实施例中，工作距离小于800μm，例如小于600μm或小于500μm。
用于进行免疫测定的生物样品测试系统
本发明涉及一种手持式poc仪器系统，其包括自含式的一次性传感装置或筒(装置)和配置患者床边使用的读取器或分析器(仪器)。将待测量的流体样品抽入筒中的样品入口孔或端口，并通过开槽开口或端口将筒插入分析器中。由分析器执行的测量通过连接至计算机端口的分析器上的端口输出到显示器或其他输出装置，例如打印机或数据管理系统。传输可以通过wi-fi、蓝牙链路、红外线等。例如，手持式ivd仪器系统可以具有与美国专利号5,096,669和美国专利号7,419,821中公开的系统类似的设计，这两个专利的全部内容通过引用并入本文。
图3显示典型的手持式poc仪器系统的部件部分和相互作用。系统300可以包括分析器305、一次性传感装置310、以及中央数据站或数据管理器315。分析器305可以包括例如用于视觉参考的显示器320和用于数据输入的一个或多个输入装置325。一个或多个输入装置325可以包括允许操作者向分析器305输入信息的一个或多个机构，例如但不限于触摸板、拨号盘、点击轮、滚轮、触摸屏、一个或多个按钮(例如，键盘)、鼠标、游戏控制器、跟踪球、麦克风、相机、接近传感器、光检测器、运动传感器、生物测定传感器及其组合。传感装置310可包括例如用于接收患者样品的端口330和用于检测生物样品中的分析物的传感器阵列335。例如，传感装置310可以被配置成对一定范围的生物样品类型进行分析。这些样品类型可包括例如血液、血浆、血清、痰液、脑脊液、泪液、尿液、身体组织、粪便物等。传感装置310可以通过开口340插入分析器305，使得分析器305与传感装置310电接触，以实现本发明的功能、步骤和/或性能。
分析器305可以使用例如无线连接、红外链路、光链路、网络连接345、350或使用传递信息的通讯方案的任何其他形式的通信链路与数据管理器315通信。数据管理器315可以驻留在诸如云环境内这样的网络基本结构上，或者可以是单独的独立计算装置(例如，服务提供商的计算装置)。数据管理器315可以包括总线、处理器、存储装置、系统存储器(硬件装置)、一个或多个输入装置、一个或多个输出装置、以及通信接口。数据管理器315可以被配置成在分析器305与中心位置(例如，lis或his(实验室或医院信息系统))和传感装置305之间提供连接。数据管理器315可以与使用能够发送和接收电子信息的任何类型的通信连接的各种系统组成部分连接，例如以太网连接或其他计算机网络连接。数据管理器315还可以任选地提供直接链接(link)回供应商(产品制造商)信息系统，例如通过因特网、拨号连接或其他直接或间接通信链路，或通过lis或his。这样的示例性实施方案可以提供传感装置305的自动重新排序，以维持医院的预定库存水平，并允许供应商预测需求并充分规划装置305的制造。它还可以提供更新装置信息的手段，例如筒属性和配置文件以及控制流体信息，例如，预期的分析物测试范围。
分析器305还可以包括处理器、存储装置和系统存储器。处理器可以是一个或多个传统处理器、微处理器或专门的专用处理器，其包括可操作以解释和执行计算机可读程序指令的处理电路，例如用于控制分析器305和/或传感装置310的各种其他组件的一个或多个操作和性能的程序指令，其用于实现本发明的功能、步骤和/或性能。在某些实施方案中，处理器解释并执行本发明的过程、步骤、功能和/或操作，其可以由计算机可读程序指令可操作地实现。例如，处理器可以测量在传感装置310的传感器处产生的信号(例如，指示生物样品中分析物的存在和/或浓度的信号)，基于测量的信号确定生物样品中的分析物的浓度，并且报告确定的浓度(例如，在显示器320上显示确定的浓度)。在一些实施方案中，由处理器获得或生成的信息(例如，传感装置310的标识、传感装置310的贮存期限、确定的浓度等)可以被存储在存储装置中。
存储装置可以包括可移动/不可移动、易失性(volatile)/非易失性计算机可读介质，例如但不限于非暂时性机器可读存储介质，诸如磁和/或光学记录介质及其对应的驱动器。根据本发明的不同方面，驱动器及其相关的计算机可读介质提供存储计算机可读程序指令、数据结构、程序模块和用于操作分析器305的其他数据的存储。在实施方案中，存储装置可以存储根据本发明的方面的操作系统、应用程序和程序数据。
系统存储器可以包括一个或多个存储介质，包括例如非暂时性机器可读存储介质，例如闪存，永久存储器，例如只读存储器(“rom”)，半永久性存储器，例如随机存取存储器(“ram”)，任何其他合适类型的非暂时性存储组件，或其任何组合。在一些实施方案中，包括有助于在分析器305与系统300的各种其他组件之间传送信息的基本例程(routines)的输入/输出系统(bios)可以被存储在rom中，例如在启动期间。另外，处理器可访问和/或当前正在操作的数据和/或程序模块例如操作系统、程序模块、应用程序和/或程序数据的至少一部分可包括在ram中。在实施方案中，程序模块和/或应用程序可以包括查找表，算法诸如用于识别以确定扩展浓度范围内的分析物的浓度的算法，以及提供处理器执行指令的比较工具。
分析器305还可以包括条形码读取器，其用于与分析器305结合使用用于读取来自患者的条形码腕带、来自传感装置310上的条形码或来自任何其他物品(例如，传感装置盒子(box)，控制流体盒子等)的信息。可以使用其他这样的编码布置(arrangement)。例如，分析器305还可以包括(可替代或除了条形码读取器)射频(rf)识别装置，其能够识别包括在每个单独的传感装置或每个装置盒子上或其中的rf标签。根据本发明的另一示例性实施方案，编码布置的一个或多个可以基于例如美国专利4,954,087中公开的类型的二进制编码销阵列(pinarray)，该专利的全部内容通过引用并入本文。各种编码布置可以传达相关信息，例如，特定装置类型的标识、制造日期和位置、制造批号、有效期、与装置相关联的唯一编号、与血液或其他样品参数的计算相关联的分析器305的使用系数等。
传感装置或筒
在一个实施方案中，如图4所示，传感装置或筒400包括顶部405(例如，盖)和底部410(例如，基部)，其中安装有至少一个具有电触点的微制造传感器芯片415和包括流体例如洗涤液的袋420。至少一个传感器芯片415可以安置在凹陷区418中并且被配置成基于流体样品中的特定化学物种的浓度(例如，来自患者的血样)生成电信号。在一些实施方案中，袋420中的流体组成选自水、校准液、试剂液、对照液、洗涤液和它们的组合。垫圈425位于顶部405与底部410之间，以将它们粘合在一起，并限定和密封筒400内的若干腔和导管(conduit)。垫圈425可实质上覆盖筒400的顶部405与底部部分410之间的整个区，如图4所示，或者可以仅定位在筒400的预定结构特征(例如，至少一个传感器芯片415)之上和之间(未示出)。垫圈425可以包括孔430，以实现顶部405与底部410之间的结构特征之间的物理、流体和/或气体连通。垫圈425可以具有或不具有粘合表面，并且可以在其两侧具有粘合表面，即形成双面粘合层。
如图5a-5j所示，在一些实施方案中，传感装置或筒500(例如，关于图4描述的筒400)具有外壳，其包括由刚性和柔性材料区形成的顶部502(例如，盖)和底部504(例如，基部)。如图5a-5j所示，盖502和基部504的刚性区(非阴影部分)优选地分别是单个连续区；然而，模制过程可以提供多个不连续的实质上刚性的区。盖502和基部504的柔性区(阴影部分)分别优选地是一组几个非邻接区。例如，可移位膜周围的柔性区可以在可闭合的密封构件处与柔性区分开并且不同。或者，柔性区可以包括单个邻接区。
传感装置或筒500还包括可密封的样品进入端口506和用于关闭样品进入端口502的可关闭的密封构件508、位于样品进入端口506下游的样品保持室510、毛细管止动件(stop)512、传感器区514和位于传感器区508下游的废物室516。优选地，样品保持室510的一部分的横截面积相对于样品进入端口506向远侧减小，如在图5h中斜坡(ramp)518所示。袋(例如，关于图4描述的袋420)可以设置在凹陷区520中并且与导管522流体连通，导管522通向传感器区514，任选地通过导管524。袋可以是美国专利号5,096,669或更优选地，美国专利号8,216,529中描述的设计，这两个专利的全部内容通过引用并入本文。凹陷区520优选地包括钉525，钉525构造成在袋上施加力时使袋破裂，例如通过读取器或分析器(例如，关于图3描述的分析器305)。一旦袋破裂，所述系统被配置成将流体内容物从袋输送到导管522。流体进入导管522和传感器区514和/或导管524内的移动可以通过泵实现，例如，气动泵连接到导管522或524。优选地，气动泵包括可移位膜526，其由形成在凹陷区或气囊528上方形成的外壳的柔性区527的一部分形成。在如图5a-5j所示的实施方案中，在反复按压可移位膜526时，装置经由导管524、529、530和531泵送，使得来自破裂袋206的流体流过导管270，进入导管275并在传感器区230上方流动。
在一些实施方案中，可闭合密封构件508包括形成密封构件532的刚性区的一部分，以及形成密封533的柔性区的一部分。密封构件508可绕铰链534旋转并且当处于闭合位置时，密封件533与样品入口506接合，从而提供气密密封。或者，可以通过在tpe上接触两种柔性材料，例如热塑性弹性体(tpe)来形成气密密封。任选地，可密封的样品进入端口506还包括通气孔(未示出)。在一个替代实施方案中，刚性区的一部分形成密封构件，并且柔性区的一部分形成围绕样品进入端口的周边密封，由此密封构件可围绕铰链旋转并且当处于闭合位置，接合周边密封，从而提供气密密封。或者，周边密封可以通过两种柔性材料的接触形成。在又一个实施方案中，密封构件可包括可滑动的闭合元件，如悬而未决的美国专利号7,682,833中所述，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，传感器凹穴514包括传感器阵列，所述传感器阵列包括用于一种或多种不同分析物(或血液测试)的一个或多个传感器。例如，传感器阵列可包括用于一种或多种不同分析物(或血液测试)的免疫传感器和/或磁免疫传感器。免疫传感器可以包括在实质上平面的芯片上的基部传感器(basesensor)或感测电极(例如，微制造的传感器芯片，诸如关于图4描述的至少一个传感器芯片415)，其中感测电极安置在导管524中用于接收与试剂混合的样品。磁免疫传感器可以包括在实质上平面的芯片(优选地包括免疫传感器的相同传感器芯片)上的基部传感器或感测电极，其中感测电极安置在导管524中用于接收与包括珠的试剂混合的样品，所述珠可以被吸引至磁体或响应安置在磁免疫传感器附近的磁场。在替代实施方案中，传感器阵列包括用于多种不同分析物(或血液测试)的多个传感器。因此，筒500可具有一个或多个传感器凹穴514，每个传感器凹穴514具有至少一个传感器。
传感器响应的分析物/性质可选自ph、pco2、po2、葡萄糖、乳酸盐、肌酸酐、脲、钠、钾、氯化物、钙、镁、磷酸盐/酯、血细胞比容、凝血酶原时间(pt)、活化部分凝血活酶时间(aptt)、活化凝血时间(act)、d-二聚体、前列腺特异性抗原(psa)、肌酸激酶-mb(ckmb)、脑利钠肽(bnp)、肌钙蛋白i(tni)、心肌肌钙蛋白(ctni)、人绒毛膜促性腺激素、肌钙蛋白t、肌钙蛋白c、肌红蛋白等及其组合。优选地，在作为全血的液体样品中测试分析物，然而可以使用其他样品，包括血液、血清、血浆、尿液、脑脊液、唾液及其改良形式。改良可包括稀释、浓缩、添加诸如抗凝血剂等试剂。无论样品类型如何，它都可以由筒500的样品入口502容纳。
筒500还可以包括安置在凹陷区520上方的柔性区536的一部分，所述凹陷区520被配置成像泵一样被致动以在凹陷区520内施加压力。在一些实施方案，柔性区536可以包括通用符号描述，以向用户指示用户不应将压力施加到柔性区536。例如，符号可以包括具有横杆的浮雕的圆。柔性区536的部分提供可以容纳分析器的致动器特征的表面(例如，如关于图3所述的分析器305)，以施加力并使下面的袋在凹陷区520中破裂。柔性区536中的塑料的厚度可以优选为约200至约800μm，例如约400μm。基本上，柔性区536应足够薄以容易弯曲，而足够厚以维持物理完整性而不会撕裂。
传感器和芯片设计
在一个实施方案中，微制造的传感器芯片(例如，关于图4描述的至少一个传感器芯片415)包括至少一个传感器或换能器(例如，工作电极或光学检测器)。例如，微制造的传感器芯片可以包括一对传感器，所述传感器包括第一传感器(例如，低端灵敏度传感器)和任选的第二传感器(例如，高端灵敏度传感器)。在一些实施方案中，可以将传感器分别制成硅芯片上的相邻结构。
在不同的实施方案中，传感器可以形成为具有金表面的电极，其涂覆有光限定的聚酰亚胺层，所述聚酰亚胺层包括开口以限定小金电极(例如，金微阵列电极)网，此时电活性物种可以被氧化。例如，可以实现传感器芯片的优选实施方案的晶片(wafer)级微制造，如图6a所示。具有平坦上表面和下表面的非导电基底600可以用作传感器芯片的基底。可以通过常规手段(例如，导电印刷)或本领域技术人员已知的微制造技术将导电层602沉积在基底600上，以形成至少一个晶体管。导电层602可包括贵金属，例如金、铂、银、钯、铱或其合金，但也可使用其他非反应性金属，例如钛和钨或其合金，如石墨的许多非金属电极、导电聚合物或其他材料也可以使用。微制造的传感器芯片还可以包括电连接603，其将电极连接到导电销，例如临时电连接器。
在一些实施方案中，传感器可包括在15μm中心上的5-10μm贵金属盘，例如7μm贵金属盘的阵列。贵金属盘或电极阵列可以覆盖直径为约300至900μm，任选地直径为400至800μm或约600μm的区，例如圆形区，并且可以通过在对由包括si、sio2、tiw和/或au或其组合的一系列层制成的基底上制备厚度达1.5μm的聚酰亚胺或光致抗蚀剂薄层进行光图案化来形成。在一些实施方案中，电极具有约130,000至300,000平方μm的工作面积(即，微电极)，直接在电极上方的样品体积可约为0.1-0.3μl，并且样品在传感器芯片上的体积可以是1-3μl。根据本发明的这些方面，在电极的区(例如，关于图5a-5j描述的一个或多个传感器凹穴514)中的导管(例如，关于图5a描述的导管524)的体积与传感器面积之比小于约6μl/约1平方mm，优选小于约50mm至约2平方mm，更优选小于约100μm至约500平方μm。因此，电极阵列提供了作为电活性物种的可检测部分的高收集效率，其具有与暴露金属的电容相关的任何电化学背景电流的贡献减少。特别地，绝缘聚酰亚胺或光致抗蚀剂层中的开口限定贵金属电极的区，在所述区可以氧化电活性物种，例如4-氨基苯酚，例如以每分子反应两个电子的形式。
微制造技术(例如，光刻和等离子体沉积)可用于在有限空间中构建多层传感器结构。例如，在美国专利号5,200,051中公开了用于在硅基底上微电子制造电化学免疫传感器的方法，该专利的全部内容通过引用并入本文，并且包括例如分配方法，将基底和试剂连接到表面(包括光形成层)的方法，以及进行电化学测定的方法。
如图6b所示，在一些实施方案中，微制造的扩展范围的传感器芯片604包括第一传感器605(例如，低端灵敏度电流分析(amperometric)传感器)和任选的第二传感器610(例如，高端灵敏度电流分析传感器)。可以将第一传感器605和第二传感器610分别制成传感器芯片604上的相邻结构。然而，为了使传感器芯片604确定准确的分析物的浓度，低端灵敏度传感器605可以与高端灵敏度传感器芯片610充分隔开。例如，在低至中等浓度的分析物时，由于高浓度的标记试剂连接于抗体涂覆的磁珠，高端灵敏度传感器610可产生高电流分析信号。在标记试剂使用酶来切割产生电活性物种的底物的实施方案中，高端灵敏度传感器610处的高浓度电活性物种可以沿着传感器芯片604移动并在低端灵敏度传感器605上产生电流分析信号。或者，低端灵敏度传感器处的低浓度电活性物种也可沿传感器芯片移动并在高端灵敏度传感器上产生电流分析信号。传感器之间的这种串扰的幅度取决于许多因素，并且可以显示传感装置运行之间的可变性，从而导致对低端灵敏度传感器和/或高端灵敏度传感器的电流分析读数的不精确性增加。因此，为了减少传感器之间的串扰，在某些实施方案中将两个传感器彼此隔开预定距离可能是有益的。
第一传感器605和第二传感器610以预定距离“x”彼此间隔开。例如，第一传感器605可以与第二传感器610间隔开至少0.03mm，优选地至少0.06mm。第一传感器605可以经由线路(wiring)615连接到第一导电销620(例如，临时电连接器)并且第二传感器610可以经由线路625连接到第二导电销630(例如，临时电连接器)。在一些实施方案中，第一传感器605可以被配置成免疫传感器(例如，低端灵敏度电流分析传感器)且第二传感器610可以被配置成磁免疫传感器(例如，高端灵敏度电流分析传感器)，它们两者形成在单个传感器芯片604上并安置在现场护理测试筒的一个或多个导管内。尽管如图6b所示，第二传感器610放置于第一传感器605的上游，但应当理解，本发明的替代实施方案设想使第二传感器610放置于第一传感器605的下游。
如图6b所示例的，第一传感器605可以用金属盘或电极阵列构建，其覆盖传感器芯片604的第一区中的圆形区，第二传感器610可以用金属盘或电极阵列构建，其覆盖传感器芯片604的第二区中的圆形区。优选地基于第一传感器605和第二传感器610中的每一个的印刷和性能特征(例如，最小化传感器之间的串扰)来选择传感器芯片604上的第一传感器605和第二传感器610的设计和布置。然而，本领域普通技术人员应理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以预期用于传感器的任何设计或布置。此外，尽管图6b中的实例中的第一传感器605和第二传感器610如本文所述为电流分析传感器，但是可以使用其中使用其他电化学或光学传感器的其他电化学过程或光学过程，例如光波导和电荷耦合器件(ccd)相机芯片。例如，使用电位传感器检测离子物种，例如na+或k+。
如本文所述，第一传感器605和第二传感器610可以形成为具有金表面的电极，所述金表面暴露(例如，没有聚酰亚胺或光致抗蚀剂覆盖)于导管内部环境并且被配置成直接接触设置在导管内的生物样品。线路615和620可以形成有金表面，所述金表面涂覆有光限定的聚酰亚胺或光致抗蚀剂层，使得线路615和620绝缘而不暴露于设置在导管内的生物样品。线路615和620可以形成为包括容纳(containment)环结构635和640。在一些实施方案中，用于第一传感器605的容纳环结构635可以配置成包括固定在电极表面上或附近的捕获抗体。例如，捕获抗体(如本文所讨论的)可以沉积在容纳环结构635内的第一传感器605的至少一部分上。线路615和620分别在第一导电销620和第二导电销630终止，其用于与分析仪或筒式读取器中的连接器接触(例如，如美国专利号4,954,087中所述的i-
在不同的实施方案中，第一传感器605是安置在导管中的免疫传感器，其用于接收与抗体-酶缀合物混合的生物样品，所述抗体-酶缀合物被配置成结合生物样品内的目标分析物。第一传感器605可以配置成从底物(例如，氨基苯磷酸)与抗体-酶缀合物(例如，一种或多种结合碱性磷酸酶(alp)的抗体)的反应中检测酶促产生的电活性物种(例如，4-氨基苯酚)。根据这些方面，第一传感器605包括涂覆有捕获抗体645的一个或多个捕获区，所述捕获抗体645被配置成结合与抗体-酶缀合物结合的目标分析物。捕获区645可以由容纳环结构635限定。在一些实施方案中，容纳环结构635是聚酰亚胺的疏水环或另一个光刻制造的层。可以在第一传感器605的表面上分配包括某种形式的捕获抗体(例如与珠或微球结合)的微滴或几个微滴(大小约5-40nl)。光限定环结构635包括该水性液滴，其允许捕获区645定位到几微米的精密度。捕获区645可以由0.03至约2mm2的大小制成。在本实施方案中，所述大小的上端受到导管和传感器芯片604大小的限制，但不是对本发明的限制。
在一些实施方案中，传感器芯片604的一部分(例如，基底的顶表面)、导管的壁(例如，关于图5a描述的导管524)和/或样品室(例如，关于图5g和5h描述的样品室510)的壁可以用一种或多种干燥试剂涂覆以改良生物样品。例如，传感器芯片604可以包括涂覆有用于感兴趣分析物的抗体-酶缀合物的试剂区650。试剂区650可以由容纳环结构655限定。在一些实施方案中，容纳环结构655是聚酰亚胺的疏水环或另一个光刻制造的层。可以在传感器芯片604的表面上分配或印刷含有某种形式的抗体-酶缀合物的微滴或几个微滴(大小约5-40nl)或一系列约100个纳米滴(大小约50-1000pl)。光限定环结构655包括该水性液滴，其允许试剂区650定位到几微米的精密度。试剂区650可以由0.03至约2mm2的大小制成。在本实施方案中，该大小的上端受到导管和传感器芯片604大小的限制，但不是对本发明的限制。
生物样品或流体可以在干燥试剂(例如试剂区650)上通过至少一次，以将试剂溶解在生物样品或流体中。用于改良筒内的生物样品或流体的试剂可包括抗体-酶缀合物、用捕获抗体涂覆的磁珠或阻止测定化合物之间特异性或非特异性结合反应的阻断剂。在生物样品或流体的一段内，试剂可以优先溶解并浓缩在区段(segment)的预定区内。这是通过控制区段的位置和移动来实现的。因此，例如，如果仅一部分区段(例如前缘)在试剂上往复运动，则可以在靠近前缘的位置实现高局部浓度的试剂。或者，如果需要均匀分布试剂，例如如果需要已知浓度的试剂进行定量分析，则样品或流体的进一步往复运动将导致混合和均匀分布。
在本发明的优选实施方案中，分析器经由第一导电销620向第一传感器605和参考电极施加电位，并测量由来自底物的氧化电流产生的电流变化作为电化学信号。电化学信号与生物样品中分析物的浓度成正比。第一传感器605相对于参考电极具有约+0mv至90mv，例如+60mv的施加电位，并且在另一个优选实施例中，第一传感器605相对于参考电极具有约+40mv的施加电位。由酶反应产物在约+10mv产生的信号可与未反应的底物在约+200mv产生的信号区分开。应注意，用于电流分析检测底物和分析物的精确电压将根据底物的化学结构而变化。重要的是，用于检测底物的电压差足以防止读数之间的干扰。
在不同的实施方案中，第二传感器610是安置在导管中的磁性免疫传感器，其用于接收与珠混合的生物样品，所述珠可被吸引到磁体或响应磁场。用捕获抗体涂覆珠，所述捕获抗体被配置成结合与抗体-酶缀合物结合的目标分析物，所述缀合物例如抗体-酶缀合物，其置于试剂区650中的，且随后溶解在生物样品中。第二传感器610可以配置成检测来自底物(例如，氨基苯磷酸)与抗体-酶缀合物(例如，一种或多种结合碱性磷酸酶(alp)的抗体)的反应的酶促产生的电活性物种(例如，4-氨基苯酚)。根据这些方面，高场磁体(例如，永久磁体或电磁体)可以安置在传感器芯片604附近(例如，下方)或者并入传感器芯片604中，以产生磁场其用于将与导管中的生物样品混合的珠吸引至实质上靠近第二传感器610的位置。基于第一传感器605和第二传感器610之间的预定距离“x”，磁场定位在第二传感器610周围，并且起在去除未结合的样品和洗涤电极期间将珠实质上保持在第二传感器610的表面处或附近。
本发明的高场磁体可包括提供高磁场(例如，大于约0.1特斯拉，大于0.4特斯拉或大于1特斯拉)的任何材料。例如，可以测量磁场作为磁体的实质上平坦表面区上的残余场。在一些实施方案中，高场磁体由诸如钕铁硼合金(ndfeb)合金(例如nd2fe14b)或铁氧体或铝镍钴(alnico)的材料组成，其典型地表现出大于0.1特斯拉，例如，大于0.5特斯拉或0.1至1特斯拉的场。在其他实施方案中，高场磁体由稀土元素的合金(例如，钕合金和钐钴(smco)合金)组成，其表现出大于0.1特斯拉，例如，大于1.2特斯拉或大于1.4特斯拉的场。在替代实施方案中，高场磁体包括电磁体，其中磁场由电流流动产生。电流可以由分析器提供，其中插入传感装置并且传感装置与该分析器电接触。
可以使用如本文详细描述的多种技术将高场磁体提供在传感器芯片604附近(例如，下方)或者将其并入到传感器芯片604中。在一些实施方案中，第二传感器610包括在实质上平面的基底上的感测电极和安置在电极附近(例如，在传感器芯片604的下方或相对侧上)的主体(bulk)永久高场磁体。在某些优选的实施方案中，主体永久高场磁体安置在传感装置的外壳中(例如，在筒的刚性区中切除部(cutout)或沟槽(trench))。例如，主体永久高场磁体可安置在筒外壳的基部内(例如，与传感器芯片不共面)。在其他实施方案中，高场磁体安置在分析器附近或内部，其中插入传感器装置。主体高场永久磁体可以是实质上圆柱形的，其具有约0.1mm至约5mm的直径和约0.1mm至约5mm的长度，并且安置成在短时间段内(例如，1-5分钟)适用于珠捕获的导管中产生“事件视界”(如所定义的)。导管通常具有约0.2mm至约5mm的高度和约0.2mm至约5mm的宽度，以及均匀或不均匀的横截面积。或者，主体磁体形状可以是正方形、矩形、椭圆形、薄片形、金字塔形、球形、子球形或其他形状。
在替代实施方案中，第二传感器610包括在实质上平坦的基底上的感测电极和磁化层(例如，微制造的磁层)。磁化层可以包括在(例如，在传感器芯片604的任何表面上安置、直接连接、涂覆或图案化)或嵌入芯片中(例如，安置在芯片内，与芯片成整体)。这种配置实质上靠近感测电极或在感测电极上吸引磁敏感的珠，并且在去除未结合的样品和洗涤感测电极期间实质上将它们保持在感测电极处。
磁化层可以是由能够在粘合剂或支撑基质(例如，热固性油墨(thermalsettingink)、聚酰亚胺、聚乙烯醇(pva)或热塑性等效物)中维持高场永磁场的颗粒磁材料(例如，ndfeb合金)形成的复合材料。除了热固性油墨、聚酰亚胺、pva和热塑性等效物之外，可以使用两部分化学固化的环氧树脂，kapton等作为用于将颗粒磁材料固定到传感器芯片的粘合剂。在一些实施方案中，粘合剂由热固性油墨组成，例如基于溶剂的包封剂丝网印刷油墨或在溶剂中的丙烯酸聚合物。在替代实施方案中，粘合剂由其他光成形基质材料组成。固化复合材料的方法可以基于光引发、热引发或化学引发的方法。复合材料不受粘度的限制，并且可包括适合应用的任何粘度。在一些实施方案中，复合材料具有为0.3至300,000cps的粘度，例如100至100,000cps或1,000至10,000cps。某些实施方案的复合材料中的磁颗粒具有0.01μm至100μm，例如0.1μm至10μm或3μm至7μm的平均粒径。
复合材料可以施加在传感装置中或传感装置上的各种位置(例如，施加于晶片或芯片的正面或背面、电极、外壳、读取器等)。例如，在一些实施方案中，复合材料以图案化方式(例如，使用掩模)施加到传感器芯片。在其他实施方案中，将复合材料施加到感测电极。在其他实施方案中，复合材料被施加在感测电极下方的磁化层中。在施加磁化层之前，磁化层可以被磁化或不被磁化。然而，在施加之后，磁层优选被磁化以为由磁化层产生的磁场提供方向性。
在一些实施方案中，传感器芯片604的一部分(例如，基底的顶表面)、导管的壁(例如，关于图5a描述的导管524)和/或样品室(例如，关于图5g和5h描述的样品室510)的壁可以用一种或多种干燥试剂涂覆以改良生物样品。例如，传感器芯片604可以包括涂覆有磁珠的试剂区660，所述磁珠具有用于感兴趣分析物的捕获抗体。试剂区660可以由容纳环结构665限定。在一些实施方案中，容纳环结构665是聚酰亚胺的疏水环或另一个光刻制造的层。可以在传感器芯片604的表面上分配或印刷含有某种形式的抗体-酶缀合物的微滴或几个微滴(大小约5-40nl)。光限定环结构665含有该水性液滴，其允许试剂区660被定位到几微米的精密度。试剂区665可以由0.03至约2mm2的大小制成。在本实施方案中，该大小的上端受到导管和传感器芯片604的大小的限制，并且不是对本发明的限制。尽管在图6b中，试剂区660放置于试剂区650的上游，应当理解，本发明的替代实施方式考虑使试剂区660放置于试剂区650的下游。
生物样品或流体可以在干燥试剂(例如，试剂区660)上通过至少一次，以将试剂溶解在生物样品或流体中。用于改良筒内的生物样品或流体的试剂可包括抗体-酶缀合物、用捕获抗体涂覆的磁珠或阻止测定化合物之间特异性或非特异性结合反应的阻断剂。在生物样品或流体的区段内，试剂可以优先溶解并浓缩在区段的预定区内。这是通过控制区段的位置和移动来实现的。因此，例如，如果仅一部分区段(例如前缘)在试剂上往复运动，则可以在靠近前缘的位置实现高局部浓度的试剂。或者，如果需要均匀分布试剂，例如如果需要已知浓度的试剂进行定量分析，则样品或流体的进一步往复运动将导致混合和均匀分布。
在本发明的优选实施方案中，分析器经由第二导电销630将电位施加到第二传感器610和参考电极，并测量由来自底物的氧化电流产生的电流变化作为电化学信号。电化学信号与生物样品中分析物的浓度成正比。第二传感器610相对于参考电极具有约+0mv至90mv，例如60mv的施加电位，并且在另一个优选实施方案中，第一传感器605相对于参考电极具有约+40mv的施加电位。由酶反应产物在约+10mv产生的信号可与未反应的底物在约+200mv产生的信号区分开。应注意，用于电流分析检测底物和分析物的精确电压将根据底物的化学结构而变化。重要的是，用于检测底物的电压差足以防止读数之间的干扰。
在一些实施方案中，传感器芯片604还可包括电导传感器670(例如，血细胞比容传感器)。电导传感器670被配置成确定试剂区650和660处的生物样品到达和/或离开以及第一传感器605和第二传感器610处的生物样品到达和/或离开。更具体地，电导传感器670处于垂直导管或传感器导管的长度，以及传感器的电极对之间的电阻可用于监测生物样品的流体前沿的相对位置。在极端情况下，开路读数表明生物样品已被推离试剂区650和660，并且闭路读数表明试剂区650和660被生物样品覆盖。
如图6b所示，电导传感器(conductometricsensor)670可以包括安置在第一传感器605和第二传感器610下游的至少两个电极675和680(即电极对)。电极675和680可以通过线路685和690连接到电导低销692和ac电源或电导高销695(例如，临时电连接器)。线路685和690可以形成有金表面，所述金表面涂覆有光限定的聚酰亚胺或光致抗蚀剂层，使得线路685和690绝缘而不暴露于设置在导管内的生物样品。因此，在一些实施方案中，生物样品或流体在导管中到达电极对(例如，在到达第一传感器605和第二传感器610之前)，然后到达第一传感器605和第二传感器610(例如，在离开试剂区650和660之后)。
如图7所示，在替代实施方案中，微制造传感器芯片700包括第一传感器705(例如，低端灵敏度电流分析传感器)和任选地第二传感器710(例如，高端灵敏度电流分析传感器)，与如同图6b相似地描述的类似。然而，如图7所示，第一传感器705可以由金属盘或电极阵列构建，其覆盖传感器芯片700的第一区中的圆形区，且第二传感器710可以由金属盘或电极阵列构建，其覆盖传感器芯片700的第二区中的正方形或细长区715。因为生物样品通过传感器上的导管，传感器芯片700的第二区中的正方形或细长区715为磁体或磁场提供更大的表面积以捕获涂覆有与生物样品一起分散的捕获抗体的珠。应当理解，微制造传感器芯片700可以包括相同的附加特征的一个或多个，例如关于传感器芯片604和图6b所描述的试剂区和电导传感器。
如图8a和8b所示，在设计用于降低两个传感器之间的串扰的其他实施方案中，提供了微制造的扩展范围的传感器芯片800(例如，关于图4描述的至少一个传感器芯片415)，其包括一对传感器，所述传感器包括第一传感器(例如，低端灵敏度传感器)和第二传感器(例如，高端灵敏度传感器)，其中清扫电极(scavengingelectrode)在传感器之间提供。在一些实施方案中，第一和第二传感器可以分别制造为硅芯片上的相邻结构。然而，为了使扩展范围的传感器芯片确定准确的分析物的浓度，低端灵敏度传感器可以与高端灵敏度传感器充分隔离。例如，在低至中等浓度的分析物时，高端灵敏度传感器可能产生高电流分析信号，这是由于高浓度的标记试剂连接在抗体涂覆的磁珠上。在标记试剂使用酶切割产生电活性物种的底物的实施方案中，高端灵敏度传感器处的高浓度电活性物种可沿传感器芯片移动并在低端灵敏度传感器上产生电流分析信号。或者，低端灵敏度传感器处的低浓度电活性物种也可沿传感器芯片移动并在高端灵敏度传感器上产生电流分析信号。传感器之间的这种串扰的幅度取决于许多因素，并且可以显示传感装置运行之间的可变性，从而导致对低端灵敏度传感器和/或高端灵敏度传感器的电流分析读数的不精密度增加。因此，在某些情况下，使用清扫电极降低扩展范围的传感器芯片中的两个传感器之间的串扰可能是有益的。
微制造的传感器芯片800包括第一传感器805(例如，低端灵敏度电流分析传感器)和第二传感器810(例如，高端灵敏度电流分析传感器)，与如关于图6b描述的类似。然而，与图6b中所示的传感器芯片604相比，第一传感器805和第二传感器810以增加的距离“y”彼此间隔开。例如，第一传感器805可以与第二传感器810间隔开至少0.2mm，优选地至少0.5mm。第一传感器805可以经由线路815连接到第一导电销820(例如，临时电连接器)并且第二传感器810可以经由线路825连接到第二导电销830(例如，临时电连接器)。在一些实施方案中，第一传感器805可以被配置成免疫传感器(例如，低端灵敏度电流分析传感器)和第二传感器810可以被配置成磁免疫传感器(例如，高端灵敏度电流分析传感器)，它们两者在单个传感器芯片800上形成并安置在现场护理测试筒的一个或多个导管内。
如图8a和8b所示，第一传感器805和第二传感器810之间增加的间隔“y”允许清扫安置在第一传感器805和第二传感器810之间的电极835。具体地，在传感器芯片800上选择第一传感器805和第二传感器810的设计和布置，以允许在第一传感器805和第二传感器810之间添加清扫电极835。清扫电极835被配置成氧化在第二传感器810处产生的电活性物种，使得第二传感器810处的高信号不会导致第一传感器805处的显著串扰和/或第一传感器805处的低信号不会导致第二传感器810处的显着串扰。例如，清扫电极被配置成(i)防止在第二传感器的区域中产生的电活性物种扩散到第一传感器，(ii)防止在第二传感器的区域中产生的电活性物种被运输到第一传感器，(iii)防止在第二传感器的区域中产生的电活性物种在第一传感器处被检测到，(iv)防止在第一传感器的区域中产生的电活性物种扩散到第二传感器，(v)防止在第一传感器的区域中产生的电活性物种被运输到第二传感器，和/或(vi)防止在第一传感器的区域中产生的电活性物种在第二传感器处被检测到。
在一些实施方案中，如图8a所示，清扫电极835经由线路840连接到第二传感器810。在替代实施方案中，如图8b所示，清扫电极1735经由线路845连接到电导低销850(例如，用于电导率传感器的临时电连接器)。清扫电极835的配置都被设计成使串扰最小化，同时导致对在第二传感器810处产生的信号和在第一传感器805处产生的信号的低影响。应当理解，微制造的传感器芯片800可以包括一个或者多个相同的附加特征，例如关于传感器芯片604和图6b描述的试剂区和电导传感器。
磁免疫传感器配置
图9a-9c显示磁免疫传感器(例如，如关于图6b所述的高端灵敏度电流分析传感器610)的三个示例性实施方案，其中磁部件直接集成到传感装置的基部或筒外壳中。在如图9a-9c所示的每个实施方案中，传感器芯片900包括免疫传感器905，所述免疫传感器905安置在导管910中并且安置在高场磁体920上方的基底915的表面上。高场磁体920可以是圆柱形的，长度为1mm至10mm，例如，2mm至5mm，优选约3mm，直径0.1mm至5mm，例如0.5mm至2mm。在图9a-9c中，高场磁体920具有分别约为约1mm、约0.5mm和约0.3mm的直径。高场磁体920在传感装置的基部或筒外壳925(例如，如关于图5a-5j所述的底部或基部504)内，并且任选地邻接传感器芯片900的下侧，优选地，其厚度约为0.2mm至5mm，例如0.5mm至2mm，或优选约1mm。根据这些方面，高场磁体(例如，永久磁体或电磁体)可以安置在传感器芯片900附近(例如，下方)，用于吸引导管中实质上接近或在传感器905上的磁敏感的珠。
如图10所示，根据本发明的一些方面的用于检测生物样品中的分析物的装置1000包括基底1005，其包括平面顶部和底部表面1010,1015；第一电化学传感器1020(例如，低端灵敏度电流分析传感器，其安置在基底1005的顶表面1010上；和第二电化学传感器1025(例如，高端灵敏度电流分析传感器)，其安置在基底1005的顶表面1010上并与第一电化学传感器1020相邻。在一些实施方案中，基底1005设置在装置1000的导管1027内。基底1005可以由选自硅、玻璃和塑料的基部材料组成。第一电化学传感器1020可以包括固定的抗体层1030，其被配置成结合分析物例如ctni。第一电化学传感器1020和第二电化学传感器1025可包括金微阵列电极，并且具有约100μm至约500μm或约200μm至约1500μm的直径。
装置1000还包括(i)在涂覆有用于分析物的抗体-酶缀合物的基底1005上第一试剂区1035，和/或(ii)在涂覆有具有用于分析物的捕获抗体的磁珠的基底1005上的第二试剂区1040。试剂区1035,1040可分别由容纳环结构1045,1050限定。在其他实施方案中，试剂区1035,1040可以位于导管1027上(例如，关于图5a描述的导管524)，和/或在样品室中(例如，关于图5g和5h描述的样品室510)。
装置1000还包括支撑基底1005的外壳1055。外壳1055具有开口或沟槽1060，其延伸到第二电化学传感器1025下方的外壳中的区1065。开口或沟槽1060包括高-场磁体1070(例如，主体永久高场磁体)，其任选地邻接基底1005的平坦底表面1015。高场磁体1070具有适合开口或沟槽1060内部的形状(例如，实质上为三角形、梯形、柱形、矩形、正方形、圆形、金字塔形等形状(实质上在本文中，本领域普通技术人员将理解，其意味着视觉上形状总体上是三角形、梯形、柱形、矩形、正方形、圆形、金字塔形等))。此外，高场磁体1070产生相对于第二电化学传感器1025对准的(alignedwith)(例如，在同一垂直平面上)和/或与基底1005的顶表面1010的水平面正交的磁场1075。一旦磁珠与生物样品混合，磁场1075被配置成将磁珠聚焦并将其吸引到第二电化学传感器1025的表面上。
在替代实施方案中，提供磁性免疫传感器(例如，如关于图6b所述的高端灵敏度电流分析传感器610)，其中磁性部件直接集成到传感器制造中，而不是作为单独的部件(例如，主体永久高磁场磁体)需要组装到传感装置的基部或筒外壳中。磁化层可以由复合材料形成，例如浆料，其包括能够在粘合剂或支撑基质(例如，聚酰亚胺、聚乙烯醇(pva)或热塑性等效物)中维持高场永磁场的颗粒磁材料，例如ndfeb合金。在一个实施方案中，使用美国专利号5,554,339中所述类型的微分配设备将可光成形的聚乙烯醇(pva)与研磨的nd2fe14b粉末混合的混合物印刷到晶片上，该专利的全部内容通过引用并入本文。印刷区可以是约400μm，或200至600μm的直径。图11a和11b显示了用印刷的聚酰亚胺和ndfeb颗粒基质1105部分覆盖的示例性免疫传感器1100，其中磁性免疫传感器的周边的一部分1110暴露。
在另一个实施方案中，可磁化颗粒的浆料(例如，研磨的nd2fe14b粉末)沉积在微制造的传感器芯片的非导电基底或晶片内的沟槽中。图12示例沟槽形成方法，其包括首先用氢氟酸(hf)蚀刻具有光致抗蚀剂1205的表面涂层的非导电基底1200(例如，硅晶片)，然后用热的氢氧化钾(koh)或三甲基铵氢氧化物(tmah)蚀刻基底，从而留下受控轮廓(例如，实质上为三角形、梯形、柱形、矩形、正方形、圆形、金字塔形等的形状(实质上在本文中，本领域普通技术人员将理解，其意味着视觉上形状总体上是三角形、梯形、柱形、矩形、正方形、圆形、金字塔形等)和尺寸(例如，深度和宽度为约5μm至约600μm)的沟槽1210。然后将可磁化颗粒(例如，ndfeb合金粉末)在热塑性基质(例如，聚酰亚胺)中的浆料微分散1215或旋涂1220到沟槽1210中以形成具有与基底1200共面的实质上平坦表面的磁化层1225。如共同拥有的美国专利号7,419,821和7,723,099中所述，可以进一步处理基底1200，其全部内容通过引用并入本文，以在基底1200上的每个蚀刻沟槽1210上提供免疫传感器阵列1230。免疫传感器阵列1230可以直接沉积在磁化层1225上，如(a)所示，或者在磁化层1225上，如(b)所示。
如图13所示，根据本发明的一些方面的用于检测生物样品中的分析物的装置1300包括基底1305，其包括平面顶部和底部表面1310,1315；第一电化学传感器1320(例如，低端灵敏度电流分析传感器)，其安置在基底1305的顶表面1310上；和第二电化学传感器1325(例如，高端灵敏度电流分析传感器)，其安置在基底1305的顶表面1310上并与第一电化学传感器1320相邻。在一些实施方案中，基底1305设置在器件1000的导管1327内。基底1305可以由选自硅、玻璃和塑料的基部材料组成。第一电化学传感器1320可以包括固定的抗体层1330，其被配置成结合抗体如ctni。第一电化学传感器1320和第二电化学传感器1325可包括金微阵列电极，并且具有约100μm至约500μm或200μm至约1500μm的直径。
装置1300还包括(i)在涂覆有用于分析物的抗体-酶缀合物的基底1305上的第一试剂区1335，和/或(ii)在涂覆有具有用于分析物的捕获抗体的磁珠的基底1005上的第二试剂区1340。试剂区1335,1340可分别由容纳环结构1345,1350限定。在其他实施方案中，试剂区1335,1340可以位于导管1327上(例如，关于图5a描述的导管524)，和/或在样品室中(例如，关于图5g和5h描述的样品室510中)。
装置1300还包括在基底的底表面1315中的开口或沟槽1355，其延伸到第二电化学传感器1325下方的基底1305中的区1360。开口或沟槽1355包括复合材料1365，其包括粘合剂(例如，粘合剂由聚酰亚胺或聚乙烯醇组成)和颗粒磁材料(例如，颗粒磁材料由钕铁硼(ndfeb)合金或铝镍钴(alnico)合金组成)，其任选地填充开口或沟槽1355。复合材料1365被配置成呈现开口或沟槽1355的形状(例如，实质上为三角形、梯形、柱形、矩形、正方形、圆形、金字塔形等形状(实质上在本文中，本领域普通技术人员将理解，其意味着视觉上形状总体上是三角形、梯形、柱形、矩形、正方形、圆形、金字塔形等))。
在一些实施方案中，开口或沟槽1355的形状包括实质上三角形的横截面，实质上三角形横截面的基部1370与基底1305的底部表面1315共面，并且实质上三角形横截面的顶点1375在第二电化学传感器1325下方。开口或沟槽1355可具有约200μm至约1500μm，例如500μm至1000μm的直径。开口的实质上三角形的横截面形状可以选自：锥形、金字塔形、四面体形、圆锥形多边形和v形沟槽。实质上三角形的横截面可以延伸通过从底部表面1315到基底1305的顶部表面1310的距离的至少75％、90％或95％。复合材料1365产生相对于第二电化学传感器1325对准的(例如，在同一垂直平面上)和/或与基底1305的顶表面1310的水平面正交的磁场1380。一旦磁珠与生物样品混合，磁场1380被配置成将磁珠聚焦并将其吸引到第二电化学传感器1325的表面上。
联合免疫测定方法
图14-17显示用于执行本发明的处理步骤的示例性流程图。图14-17的步骤可以使用上述图1-13描述的计算装置和系统来实现。具体地，图14-17的流程图示例根据本发明的几个实施方案的系统、方法和计算机程序产品的可能实现的架构、功能和操作。在这方面，流程图中的每个方框可以表示代码的模块、区段或部分，其包括存储在非暂时性机器可读存储介质上的一个或多个可执行指令，当由一个或多个处理器(例如，分析器的处理器)执行时，使一个或多个处理器在一个或多个可执行指令内执行指定的逻辑功能。还应注意，在一些替代实施方式中，框中提到的功能可以不按图中所示的顺序出现。例如，连续示出的两个方框实际上可以实质上同时执行，或者这些方框有时可以以相反的顺序执行，这取决于所涉及的功能。还应注意，流程图示的每个方框以及流程图示中的方框的组合可以由执行特定功能或动作的专用基于硬件的系统或专用硬件和计算机指令的组合来实现。
图14示例根据本发明一个实施方案的使用传感装置的方法1400(参考如图5a-5j所示的传感装置500)。在步骤1405，可以通过样品进入端口(例如，关于图5b和5c描述的可密封的样品进入端口506)将未计量的生物样品引入到传感装置的样品室(例如，关于图5g和5h描述的样品室510)中。在步骤1410，毛细管止动件(例如，关于图5g和5h描述的毛细管止动件512)可以防止样品在该阶段进入第一导管(例如，关于图5a描述的导管531)，并且样品室充满样品。样品室末端的毛细管止动件界定了生物样品的计量部分。在步骤1415，可以关闭盖(例如，关于图5a和5b描述的可闭合的密封构件508)以防止生物样品从传感装置泄漏。虽然生物样品在样品室内，但是生物样品可以在步骤1420任选地用最初作为室内表面上的干涂层存在的一种或多种化合物(例如，抗体涂覆的磁敏感的珠和酶标记的抗体缀合物等试剂)进行改良。
在步骤1425，根据本发明的一些方面，可以将传感装置插入分析器(例如，关于图3描述的分析器305)中。在步骤1430，将传感装置插入分析器中可以激活第一泵(例如，如关于图5a和5b所述的柔性区536的一部分)或当包装靠着尖钉(例如，如关于图5g和5h所述的尖钉525)按压时刺穿含有流体的包装的机构。因此，流体(例如，底物)可以排出到与第一导管流体连通的第二导管(例如，如关于图5g和5h所述的导管522)中。第二导管中的收缩防止了流体的进一步移动。在步骤1435，由分析器操作第二泵(例如，如关于图5a、5b、5g和5h所述的可移位膜526)向传感装置的气囊施加压力，迫使空气通过第三导管(例如，如关于图5g和5h所述的导管529)并且在预定位置处进入样品室。
在步骤1440，通过在步骤1435中在气囊内产生的气压将生物样品的计量部分通过毛细管止动件排出到第一导管中。在步骤1445，生物样品在第一导管内向前移动到第一导管的一部分(例如，如关于图5a所述的导管524)，通过气囊内产生的空气压力其暴露于传感器芯片(例如，如关于图6b所描述的传感器芯片604)。任选地，在步骤1450，用一种或多种化合物(例如，抗体涂覆的磁敏感的珠和酶标记的抗体缀合物等试剂)修饰生物样品，所述化合物最初作为干涂层存在于传感器芯片的一部分上(即，一个或多个试剂区)。为了促进一种或多种化合物在生物样品中的溶解和/或促进在磁敏感的珠上形成有效的夹心，可以通过气囊内产生的气压在一个或多个试剂区上振荡生物样品。在一个实施方案中，使用介于约0.2hz和约5hz之间的振荡频率，最优选地约0.7hz。在步骤1455，通过气囊内产生的气压，改良的生物样品在第一导管内向前移动到第一传感器(例如，低端灵敏度电流分析传感器)和任选地第二传感器(例如，高端灵敏度电流分析传感器)上方的位置。任选地，在步骤1460，为了便于将磁敏感的珠捕获在第二传感器表面上或附近的磁场内和/或促进在包括生物层的第一传感器的表面上或附近形成有效的夹心，生物样品可以通过气囊内产生的气压在第一和第二传感器上振荡。在一个实施方案中，使用介于约0.2hz和约5hz之间的振荡频率，最优选地约0.7hz。
在步骤1465，通过施加到气囊的进一步压力将生物样品从第一导管移位，并且生物样品进入废物室(例如，如关于图5a和5g所述的废物室516)。在任选步骤1470，可以通过任何合适的手段在第一导管内产生一个或多个空气区段(弯月面)，所述手段包括被动手段，其实施例在美国专利号7,682,833中有详细描述，该专利在此完整地引入作为参考，或者主动手段，包括使用第二泵在第一导管内瞬时降低压力，由此通过阀瓣或阀门将空气吸入第一导管。一个或多个空气区段在清除或漂洗来自第一导管的生物样品污染的流体方面非常有效。例如，一个或多个空气区段的前缘和/或后缘可以在第一和第二传感器上通过多次以漂洗和重悬可能已经从生物样品沉积的外来物质。外来物质包括除特异性结合的分析物或分析物/抗体-酶缀合物复合物之外的任何物质。然而，根据不同的实施方案，使用一个或多个空气区段的清洁或漂洗步骤1470没有充分延长或剧烈，以促进磁敏感的珠的实质上重悬或特异性结合的分析物或分析物/抗体酶从珠或生物层的缀合物复合物中的解离。
在步骤1475，第二导管中的流体通过收缩部移动进入第一导管并通过第一泵产生的空气压力与第一和第二传感器接触。流体可包括底物或信号剂，和保留在第一导管内并固定在第一和第二传感器上或附近的酶或者从电活性底物产生电活性物种或破坏电活性底物。在一些实施方案中，可以将流体施加到第一免疫传感器和第二免疫传感器以从第一第二传感器洗涤生物样品。如果传感装置的操作模式适合，将在第一和第二传感器处的电活性物种的产生或破坏所产生的电流或电位的变化记录为时间的函数并且确定生物样品中存在目标分析物。
图15示例根据本发明一个实施方案的进行免疫测定以确定生物样品(例如全血)中分析物的浓度的方法1500。在步骤1505，将第一干燥试剂溶解到生物样品中。第一干燥试剂可包含酶-生物分子缀合物(例如，信号抗体)，其配置成结合分析物，例如肌钙蛋白i(tni)或心肌肌钙蛋白i(ctni)。酶-生物分子缀合物包括与选择用于结合目标分析物的生物分子缀合的酶。在步骤1510，在包含生物样品的第一液相中形成信号抗体与分析物的第一复合物。在步骤1515，将第二干燥试剂溶解到生物样品中。第二干燥试剂可包含磁珠或微球，其涂覆有捕获生物分子(例如，固定在磁珠上的捕获抗体)，其配置成与分析物结合。在步骤1520，在包含生物样品的第二液相中形成第一复合物(例如，与分析物结合的信号抗体)和固定在磁珠上的捕获抗体的第二复合物。
在步骤1525，使包含第一复合物和第二复合物的生物样品与第一免疫传感器接触。第一免疫传感器包括固定在第一免疫传感器表面上或附近的捕获生物分子(例如，乳胶珠或涂有捕获抗体的微球)。捕获抗体被配置成结合分析物，以形成定位在第一免疫传感器的固相边界(例如，表面)上或附近的第三复合物。第三复合物包括第一复合物(例如，与分析物结合的信号抗体)和第一免疫传感器的固定化捕获抗体。在第一免疫传感器的表面上或附近的分析物的定位或捕获是非均匀反应的结果，包括在第一液相中形成第一复合物和在固相边界上或附近形成第三复合物。因此，第一免疫传感器可以被视为非均匀表面捕获免疫传感器。
在步骤1530，使包含第一复合物和第二复合物的生物样品与定位在第二免疫传感器附近的磁场接触。磁场被配置成吸引生物样品中的磁珠，使得第一复合物(例如，与分析物结合的信号抗体)和固定在磁珠上的捕获抗体的第二复合物定位在第二免疫传感器表面上或附近。在第二免疫传感器的表面上或附近的分析物的定位或捕获是均匀反应的结果，包括在第一液相中形成第一复合物和在第二液相上形成第二复合物。因此，第二免疫传感器可以视为均匀磁珠捕获免疫传感器。
在步骤1535，可以将流体(例如洗涤液)施加到第一免疫传感器和第二免疫传感器，以从第一免疫传感器和第二免疫传感器洗涤生物样品。洗涤液可包含底物或信号剂(例如磷酸化分子，例如氨基苯磷酸)。在步骤1540，在第一免疫传感器处检测并测量第一信号，所述第一信号来自底物与定位在第一免疫传感器上或附近的第三复合物的反应。例如，检测第一电化学信号，并从第一免疫传感器表面上酶促产生的电活性物种(例如4-氨基苯酚)的氧化中测量。电活性物种由底物与第三复合物中的酶-生物分子缀合物的反应酶促产生。在不同的实施方案中，底物是磷酸化分子(例如，氨基苯磷酸)，其配置使得当通过酶-生物分子缀合物(例如，一种或多种与碱性磷酸酶结合的抗体)除去磷酸酯部分时，该分子变为电活性的。在步骤1545，在第二免疫传感器处检测并测量第二信号，所述第二信号来自底物与定位在第二免疫传感器上或附近的第二复合物的反应。例如，检测第二电化学信号，并从第二免疫传感器表面上酶促产生的电活性物种(例如4-氨基苯酚)的氧化中测量。电活性物种是由底物(例如，氨基苯磷酸)与第二复合物中的酶-生物分子缀合物(例如，与碱性磷酸酶结合的一种或多种抗体)反应而酶促产生。
在步骤1550，从第一信号和第二信号中的至少一个确定生物样品中分析物的浓度。在一些实施方案中，第一免疫传感器配置成产生第一信号，作为来自底物与第三复合物的反应的分析物的浓度在第一范围内(例如，大于较低浓度范围的较高浓度范围)的指示，而第二免疫传感器配置成产生第二信号，作为来自底物与第二复合物的反应的分析物的浓度在第二范围内(例如，低于较高浓度范围的较低浓度范围)的指示。
在其中分析物是心肌肌钙蛋白的其他实施方案中，第一免疫传感器配置成产生第一信号，其指示来自底物与第三复合物的反应的心肌肌钙蛋白浓度的浓度在第一范围内高于约1000pg/ml，而第二免疫传感器配置成产生第二信号，其指示来自底物与第二复合物的反应的心肌肌钙蛋白浓度的浓度在第二范围内约为0-约1000pg/ml(其中约为每个范围端点附近的+/-10pg/ml)。这样，第一免疫传感器基于第一信号确定心肌肌钙蛋白的浓度在高于约1000pg/ml的第一范围内，并且第二免疫传感器基于第二信号确定心肌肌钙蛋白的浓度在约0至约1000pg/ml的第二范围内。在替代实施方案中，第一范围高于2000pg/ml，第二范围为0至250pg/ml，并且第一信号和第二信号组合(例如，加权平均)指示心肌肌钙蛋白浓度的浓度范围为250-2000pg/ml(其中约为每个范围端点附近约+/-10pg/ml)。可以基于一个或多个因素对平均值进行加权，所述一个或多个因素包括计算结果与定义的较低交叉点和较高交叉点的接近度，传感器电流的形状与时间图的理想状态(ideality)，以及在传感器之一的错误条件的检测。这样，第一免疫传感器基于第一信号确定心肌肌钙蛋白的浓度在约2000pg/ml以上的第一范围内，第二免疫传感器基于第二信号确定心肌肌钙蛋白的浓度在约0至约250pg/ml的第二范围内，并且第一免疫传感器和第二免疫传感器的组合基于第一信号和第二信号确定心肌肌钙蛋白的浓度在约250至约2000pg/ml的第三范围内。
较低浓度范围(例如，约0至约250pg/ml)可以通过磁珠溶解到样品中与磁珠在均匀磁珠捕获免疫传感器上或附近的磁捕获之间的持续时间来控制。在不同的实施方案中，持续时间为1至20分钟，优选5至10分钟。较低浓度范围可以通过样品中磁珠的溶解浓度进一步控制。在一些实施方案中，样品中磁珠的溶解浓度为每微升约10000至200000个珠，优选每微升10000至40000个珠。较低浓度范围可以通过每种信号抗体的亲和性，每种信号抗体的亲合力，固定在磁珠表面上的每种捕获抗体的亲和性和/或固定在磁珠的表面上的每种捕获抗体的亲合力来进一步控制。在一些实施方案中，每种信号抗体的亲和性在约1x107至约1x1013m-1，优选在1x1010至约1x1013m-1。在一些实施方案中，每种信号抗体的亲合力在约1x107至约1x1013m-1，优选在1x1010至约1x1013m-1。在一些实施方案中，固定在磁珠表面上的每种捕获抗体的亲和性在1x107至约1x1013m-1，优选在1x1010至约1x1013m-1。在一些实施方案中，固定在磁珠表面上的每种捕获抗体的亲合力在1x107至约1x1013m-1，优选在1x1010至约1x1013m-1。正如应理解的，较低浓度范围(例如，约0至约250pg/ml)可以通过任何数量的上述因素单独或组合控制，例如，较低浓度范围可以通过如下的至少一个来控制：磁珠溶解到样品中与磁珠在均匀磁珠捕获免疫传感器上或附近的磁捕获之间的持续时间，每种信号抗体的亲和性，每种信号抗体的亲合力，样品中磁珠的溶解浓度，固定在磁珠表面上的每种捕获抗体的亲和性，以及固定在磁珠表面上的每种捕获抗体的亲合力。
可以通过将样品安置在非均匀表面捕获免疫传感器上的持续时间来控制较高浓度范围(例如，高于约2000pg/ml)。在不同的实施方案中，持续时间为1至20分钟，优选5至10分钟。可以通过每种信号抗体的亲和性，每种信号抗体的亲合力，固定在非均匀表面捕获免疫传感器上或附近的每种捕获抗体的亲和性和/或固定在非均匀表面捕获免疫传感器上或附近的每种捕获抗体的亲合力来进一步控制较高浓度范围。在一些实施方案中，每种信号抗体的亲和性在约1x107至约1x1013m-1，优选在约1x1010至约1x1013m-1。在一些实施方案中，每种信号抗体的亲合力在约1x107至约1x1013m-1，优选在约1x1010至约1x1013m-1。在一些实施方案中，固定在非均匀表面捕获免疫传感器上或附近的每种捕获抗体的亲和性在约1x107至约1x1013m-1，优选在约1x1010至约1x1013m-1。在一些实施方案中，固定在非均匀表面捕获免疫传感器上或附近的每种捕获抗体的亲合力在约1x107至约1x1013m-1，优选在约1x1010至约1x1013m-1。正如应理解的，较高浓度范围(例如，高于约2000pg/ml)可以由任何数量的上述因素单独或组合控制，例如，较高浓度范围可以通过如下的至少一个来控制：样品安置在非均匀表面捕获免疫传感器上的持续时间，每种信号抗体的亲和性，每种信号抗体的亲合力，固定在非均匀表面捕获免疫传感器上或附近的每种捕获抗体的亲和性，和固定在非均匀表面捕获免疫传感器上或附近的每种捕获抗体的亲合力。
图16示例根据本发明一个实施方案的用于在扩展浓度范围内确定样品中分析物的浓度的方法1600。在步骤1605，根据方法1500的步骤1505-1540，在第一免疫传感器处检测并测量第一信号，所述第一信号来自底物与定位在第一免疫传感器上或附近的第三复合物的反应。在步骤1610，根据方法1500的步骤1505-1545，在第二免疫传感器处检测并测量第二信号，所述第二信号来自底物与定位在第二免疫传感器上或附近的第二复合物的反应。在步骤1615，生物样品中分析物的第一浓度从第一信号确定，并且从第二信号确定生物样品中分析物的第二浓度。在任选步骤1620，计算第一浓度和第二浓度的加权平均值。可以基于一个或多个因素对平均值进行加权，所述一个或多个因素包括计算结果与定义的较低交叉点和较高交叉点的接近度，传感器电流的形状与时间图的理想状态，以及在传感器之一的错误条件的检测。在步骤1625，将第一浓度和第二浓度，或任选地加权平均值与预定的交叉浓度点进行比较。在不同的实施方案中，预定的交叉浓度点是1000pg/ml、1200pg/ml、1400pg/ml、1600pg/ml、1800pg/ml或2000pg/ml。在步骤1630，当第一浓度和第二浓度中的一个或两个或任选地加权平均值大于预定交叉浓度点时，将从第一信号确定的分析物的第一浓度报告给装置的用户作为生物样品中分析物的最终浓度。在步骤1635，当第一浓度和第二浓度中的一个或两个或任选地加权平均值小于预定交叉浓度点时，将从第二信号确定的分析物的第二浓度报告给装置的用户，作为生物样品中分析物的最终浓度。
图17示例根据本发明一个实施例的用于在扩展浓度范围内确定样品中分析物的浓度的方法1700。在步骤1705，根据方法1700的步骤1705-1745，在第一免疫传感器处检测并测量第一信号，所述第一信号来自底物与定位在第一免疫传感器上或附近的第三复合物的反应。在步骤1710，根据方法1700的步骤1705-1750，在第二免疫传感器处检测并测量第二信号，所述第二信号来自底物与定位在第二免疫传感器上或附近的第二复合物的反应。在步骤1715，生物样品中分析物的第一浓度从第一信号确定，并且从第二信号确定生物样品中分析物的第二浓度。在可选步骤1720，计算第一浓度和第二浓度的加权平均值。可以基于一个或多个因素对平均值进行加权，所述一个或多个因素包括计算结果与定义的较低交叉点和较高交叉点的接近度，传感器电流的形状与时间图的理想状态，以及在传感器之一的错误条件的检测。在步骤1725，将第一浓度和第二浓度，或任选地加权平均值与预定的交叉浓度区进行比较。在不同的实施方案中，预定的交叉浓度区为400至2000pg/ml、600至1800pg/ml、400至1800pg/ml、800至1600pg/ml或250至2000pg/ml。
在步骤1730，当第一浓度和第二浓度中的一个或两个或任选地加权平均值大于预定交叉浓度区时，将从第一信号确定的分析物的第一浓度报告给装置的用户作为生物样品中分析物的最终浓度。在步骤1735，当第一浓度和第二浓度中的一个或两个或任选地加权平均值小于预定交叉浓度区时，将从第二信号确定的分析物的第二浓度报告给装置的用户作为生物样品中分析物的最终浓度。在步骤1740，当第一浓度和第二浓度两者或任选地加权平均值都在预定交叉浓度区内时，将第一浓度和第二浓度的加权平均值报告给装置的用户作为最终生物样品中分析物的浓度。
图18显示示意图1800，其示例根据本发明的不同实施方案能够在扩展的浓度范围内确定样品中的分析物的浓度的影响。微制造的扩展范围的传感器芯片可以包括如本文所述的第一免疫传感器1805(例如，具有固定的捕获抗体层的低端灵敏度电流分析传感器)和第二免疫传感器1810(例如，具有吸引具有固定的捕获抗体层的磁珠的磁场的高端灵敏度电流分析传感器)。示意图1800显示第一免疫传感器1805特别适用于检测具有较高浓度(例如，大于400pg/ml)的分析物，而第二免疫传感器1810特别良好地适合于检测具有较低浓度，例如，小于2000pg/ml的分析物。因此，通过使用具有如本文所述的传感器芯片的系统，其具有第一免疫传感器1805(例如，具有固定的捕获抗体层的低端灵敏度电流风险传感器)和第二免疫传感器1810(例如，具有吸引具有固定的捕获抗体层的磁珠的磁场的高端灵敏度电流分析传感器)，能够通过使用如上述关于方法1500、1600和1700所述在相应免疫传感器处产生的第一和第二信号扩展可以检测分析物的浓度范围。
尽管已经根据不同的优选实施方案描述了本发明，但是本领域技术人员将认识到，在不脱离本发明的精神的情况下，可以进行各种修改、替换、省略和改变。预期本发明的范围仅受待批权利要求的范围限制。另外，本领域技术人员应理解，如上所述，本发明的多个不同实施方案可以彼此结合并且并入到单一读取装置中。
- 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞！