一种基于酶纳米反应器的内分泌干扰物电化学检测法的制作方法

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种基于酶纳米反应器的内分泌干扰物电化学检测法。

背景技术：

内分泌干扰物(endocrine disrupting chemicals,EDCs)是指能够介入生物体内荷尔蒙的合成、分泌、输送、结合、作用或分解，从而影响生物体的正常性维持，危害生殖、发育或行为的外源性化学物质。EDCs普遍存在于农药、化妆品、塑料、食品、药品等中，常见的有双酚A(BPA)、邻苯二甲酸酯、烷基酚类、多氯联苯(PCBs)等。因而建立一种成本低、操作简单、方便快捷的检测内分泌干扰物的方法显得尤为重要。

大量研究表明CYP450S酶可能会激活某些EDCs，使其代谢产物与体内受体、蛋白酶等生物大分子具有更强的结合力。常用的体外CYP450的体外温孵法主要有肝微粒体体外温孵法、重组CYP450酶体外温孵法、肝细胞体外温孵法等，主要是将一定量的CYP底物和制备好的肝微粒体或重组CYP450S酶或肝细胞在模拟生理环境下温孵。在所有基于CYP450S酶的体外代谢法中，不管是实验室方法还是工业方法，都需要电子供体辅酶NADPH的参与，NADPH价格昂贵、不易保存，来源极不经济。为解决这一问题，人们开始利用电化学手段进行对CYP450s的体外研究。但研究发现如果直接将酶蛋白质固定在电极表面，易导致酶蛋白质的吸附变形，因此其直接电化学是不容易实现的。为解决这一问题，人们一般采用纳米复合材料修饰电极的方法来维持酶蛋白质的生物活性。Gilardi等人将CYP融合CPR形成的蛋白，通过控制CYP的活性呋喃氧基氧化剂的存活时间来增强催化活性。Mie等人设计了具有疏水单元的硫醇化金电极，用来固定重组CYP450s，并证明了其电催化性能。Rusling等人将纯化的CYP450S酶和CPR通过层层组装在PG电极表面构建了PDDA/PSS(CYP450S1A2/CPR+b5)6多层膜，由电极能够先将电子传递给CPR，通过CPR再将电子传递给CYP450S酶血红素中心，这种电子传递过程与实际体内相一致。但是，这些工作都普遍存在底物催化产率低、响应信号微弱的现象。造成以上现象的原因，一方面是由于固定界面不利于固定化酶构象的保持；另一方面是由于固定界面不利于酶活性中心从电极获取催化反应需要的两个电子。因此，构建具有良好生物相容性、优异电子传递性的固定界面，对于构建高催化效率、高灵敏度的活性酶电化学反应器具有重要意义。

目前，基于构建酶反应器用于内分泌干扰物的检测越来越受到关注。Tang等人制备TiO2/CdSe@CdS/葡萄糖氧化酶构建了一种光电化学生物传感器来用于葡萄糖的测定，Li等人合成光敏TNA材料来测定H2O2含量，Liu等人采用大孔硅泡沫来测定睾酮等等。这种方法同时实现了酶纳米反应器的构建和目标物的传感，简化了操作步骤，并且具有较好的选择性和灵敏度。

现有技术未公开基于制备酶纳米反应器的电化学分析法检测内分泌干扰物的技术方案。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种基于模板法制成的酶纳米反应器用于检测内分泌干扰物的简单、廉价、有效、快速的电化学检测方法。所述方法利用尺寸可控的石墨烯泡沫作为酶纳米反应器，并且使用活性酶作为内分泌干扰物代谢的催化剂本发明在解决上述技术问题所采用的技术方案如下：

一种基于酶纳米反应器的内分泌干扰物电化学检测方法，所述方法具体包括如下步骤：

(1)以不同粒径功能化的二氧化硅作为模板，通过疏水性-疏水性作用将其与氧化石墨烯混合:首先将氧化石墨粉末分散到水中并超声4h，再在3000rmp条件下离心30min得到浓度为0.5mg/mL-1mg/mL的氧化石墨烯水溶液，然后按照体积比1:3比例将功能化的二氧化硅和氧化石墨烯水溶液在室温下混合12h得到复合材料；

(2)向步骤(1)中得到的复合材料进行-20℃冻干、冷冻干燥，然后在惰性气体中煅烧，再用5wt％的氢氟酸洗，得到石墨烯泡沫；

(3)向步骤(2)中得到的石墨烯泡沫用水分散，通过加入浓度为1mg/mL的盐酸多巴胺溶液对石墨烯泡沫进行功能化修饰：按照体积比为20：1的比例往盐酸多巴胺溶液中加入石墨烯泡沫得到浓度为0.5mg/mL的PNGF纳米复合材料；

(4)取一定量步骤(3)中得到的PNGF纳米复合材料，并将其作为酶纳米反应器放入离心管中，再往里加入活性酶，并在振荡器上混匀，滴在玻碳电极上待用；利用三电极体系即珀丝电极为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，玻碳电极为工作电极，浓度为0.1M、pH＝7.0的磷酸盐缓冲液作为电解液，通过计时-电流法每次往电解液中加入内分泌干扰物，用于检测内分泌干扰物。

所述步骤(1)中所述的功能化的二氧化硅的合成方法为：先通过溶胶种子法合成二氧化硅小球；然后用DMDMS作为改性剂，盐酸作为催化剂，按照体积比1:100的比例将改性剂和盐酸加入到稀释液中，即15M盐酸、0.6g聚醚F108、0.875mLDMDMS分别添加到75mL浓度为1mg/mL的二氧化硅小球的水溶液中得到甲基化二氧化硅溶液，再氨水中和甲基化二氧化硅溶液，制得步骤(1)中所述的功能化的二氧化硅。溶胶种子法合成不同粒径的二氧化硅小球即利用起始单分散性胶粒作为种子，再通过物理或化学的方法提供二氧化硅，在种子上同步生长，从而得到单分散性的二氧化硅。

所述内分泌干扰物为硝苯地平或者睾酮或者雌酮或者孕酮。

所述步骤(1)中功能化的二氧化硅的孔径为60-250nm，优选为60nm。

所述步骤(2)中的惰性气体为氩气。

所述步骤(3)中的盐酸多巴胺溶液的制备方法是：将Tris-HCl缓冲溶液与多巴胺混合配制成pH值为6-9的盐酸多巴胺溶液，所述pH优选为8.5。所述步骤(3)中功能化修饰的盐酸多巴胺溶液浓度为0.5mg/mL-2mg/mL，优选0.5mg/mL。

所述步骤(4)中活性酶为CYP3A4。

所述步骤(4)中加入作为酶纳米反应器的PNGF纳米复合材料为10μL，待测内分泌干扰物的浓度为5mM。加入活性酶的浓度为10mg/mL，优选活性酶的量为5μL。

本发明所述的电化学检测方法检测睾酮时睾酮的Km^app值是110.70μM。

更具体地，本发明所述的一种基于酶纳米反应器的内分泌干扰物电化学检测方法，包括如下步骤：

(1)以功能化的二氧化硅模板的粒径为60-250nm作为模板，通过疏水性-疏水性作用将其与氧化石墨烯混合；

(2)向步骤(1)中得到的混合液进行-20℃冻干，冷冻干燥，惰性气体中煅烧，用5wt％的氢氟酸洗模板得到石墨烯泡沫；

(3)向步骤(2)中得到的石墨烯泡沫用水分散，通过加入不同浓度的盐酸多巴胺溶液对石墨烯泡沫进行功能化修饰得到PNGF纳米复合材料。

(4)向步骤(3)中得到的PNGF纳米复合材料，取10ul的材料作为酶纳米反应器放入A离心管中，往里加入浓度为10mg/mL的活性酶，振荡器上混匀，滴在玻碳电极上待用,用于检测浓度为5mM的内分泌干扰物。

本发明利用不同粒径功能化的二氧化硅作为模板，通过疏水性-疏水性作用将氧化石墨烯与之混合，冷冻，煅烧得到不同孔径且大小均一的石墨烯泡沫。盐酸多巴胺是一个两性物质，在pH>4时带负电，由于盐酸多巴胺会自聚合成聚多巴胺，聚多巴胺具有超亲水性的性质，因此通过π-π作用可与石墨烯泡沫复合得到亲水性的PNGF纳米反应器。同时利用静电吸附和共价键法将活性酶固定在石墨烯泡沫(NGF)孔中从而构建CYP3A4/PNGF酶纳米反应器。因此能够用于对硝苯地平，睾酮，雌酮，孕酮等内分泌干扰物的灵敏检测。

本发明所述的技术方案所采用的石墨烯泡沫，由于它的溶解性能好，作为活性酶的纳米反应器利用限域空腔效应能够有效的保证酶的催化活性，更加充分地简化了操作步骤，实现了酶纳米反应器构建和目标物传感的一步化。此外，本发明基于电化学分析法传感，可视化适用于高通量检测，模板法合成的石墨烯泡沫比较稳定，受到外界因素的干扰小，可用于实际体系中内分泌干扰物的检测，适宜推广应用。

附图说明

图1(A)、图1(B)分别为功能化二氧化硅(粒径60nm)模板法合成石墨烯泡沫(孔径66nm左右)的场发射扫描电镜图和透射电镜图，图1(C)、图1(D)为功能化二氧化硅(粒径250nm)模板法合成石墨烯泡沫(孔径260nm左右)的场发射扫描电镜图和透射电镜图；

图2为分别为不同孔径的石墨烯泡沫纳米反应器，图2中曲线a为孔径66nm石墨烯泡沫纳米反应器、图2中曲线b为孔径250nm石墨烯泡沫纳米反应器、图2中曲线c为未加入石墨烯泡沫纳米反应器，加入活性酶(10mg/mL)形成酶纳米反应器的循环伏安图。

图3为孔径为66nm纳米反应器与活性酶形成酶纳米反应器对内分泌干扰物代谢的动力学研究：图中曲线a的测试条件为无氧，5mL浓度为0.1M、pH＝7.0的PBS缓冲溶液作为电解液；图中曲线b的测试条件为有氧条件下，5mL浓度为0.1M、pH＝7.0的PBS缓冲溶液作为电解液；图中曲线c的测试条件为有氧，5mL浓度为0.1M、pH＝7.0的PBS缓冲溶液作为电解液，往电解液里加入25ul浓度为5mM的底物，图中曲线d的测试条件为有氧，5mL浓度为0.1M、pH＝7.0的PBS缓冲溶液作为电解液，往电解液里加入50ul浓度为5mM的底物。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明，但有必要指出以下实施例只用于对发明内容的描述，并不构成对本发明保护范围的限制。

实施例1：

(1)以粒径为60nm功能化的二氧化硅作为模板，通过疏水性-疏水性作用将其与氧化石墨烯混合(二氧化硅小球的制备方法是TEOs水解、缩合的过程即：将80mL乙醇、4.85mL水、3.6mL氨水添加到烧瓶中，在不断搅拌下，逐渐加热到一定温度，然后快速加入TEOS和乙醇的混合液(体积比为0.3875:1)，反应5h即可得到粒径为60nm的二氧化硅小球)；

功能化的二氧化硅的合成方法为：将15M盐酸、0.6g聚醚F108、0.875mLDMDMS分别添加到75mL浓度为1mg/mL的二氧化硅小球的水溶液中得到甲基化二氧化硅溶液，再氨水中和甲基化二氧化硅溶液，制得所述的功能化的二氧化硅。

以功能化的二氧化硅作为模板，通过疏水性-疏水性作用将其与氧化石墨烯混合:首先将氧化石墨粉末分散到水中并超声4h，再在3000rmp条件下离心30min得到浓度为0.5mg/mL-1mg/mL的氧化石墨烯水溶液，然后按照体积比1:3比例将功能化的二氧化硅和氧化石墨烯水溶液在室温下混合12h得到复合材料；

(2)向步骤(1)中得到的复合材料进行-20℃冻干、冷冻干燥，惰性气体中煅烧，用5wt％的氢氟酸洗模板得到石墨烯泡沫；通过用场发射扫描电镜和透射电镜对制成的石墨烯泡沫进行形貌测试(图1a)。

(3)向步骤(2)中得到的石墨烯泡沫用水分散，通过加入浓度为1mg/mL的盐酸多巴胺溶液对石墨烯泡沫进行功能化修饰：按照体积比为20：1的比例往盐酸多巴胺溶液中加入石墨烯泡沫得到浓度为0.5mg/mL的PNGF纳米复合材料；

(4)取一定量步骤(3)中得到的PNGF纳米复合材料，作为酶纳米反应器放入离心管中，往里加入活性酶，振荡器上混匀，滴在玻碳电极上待用；利用三电极体系即珀丝电极为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，玻碳电极为工作电极，电解液为0.1M、pH＝7.0的PBS缓冲溶液，在一定的扫速和无氧条件下进行循环伏安测试。再向步骤(4)中制备的玻碳电极上加入不同浓度的内分泌干扰物睾酮对其动力学进行研究。

图1(A)、图1(B)分别为是甲基化二氧化硅(60nm)模板法合成石墨烯泡沫(孔径66nm左右)的场发射扫描电镜图和透射电镜图；图1(C)、图1(D)分别为甲基化二氧化硅(250nm)模板法合成石墨烯泡沫(孔径260nm左右)的场发射扫描电镜图和透射电镜图，从场发射扫描电镜图中可以看出合成石墨烯泡沫的孔径大小均一，这与透射电镜图结果相一致。这些现象说明了石墨烯泡沫纳米反应器构建是可行的，且可以为活性酶提供一个限域空腔的环境，有利于保证酶活。因此，验证了此技术方案可用于内分泌干扰物的检测。

图2为分别为不同孔径的石墨烯泡沫纳米反应器，图2中曲线a为孔径66nm石墨烯泡沫纳米反应器、图2中曲线b为孔径250nm石墨烯泡沫纳米反应器、图2中曲线c为未加入石墨烯泡沫纳米反应器，加入活性酶(10mg/mL)形成酶纳米反应器的循环伏安图。由此图可以得知在组装66nm石墨烯泡沫孔中的CYP3A4的直接电化学研究可以通过循环伏安法(CV)进行(图2中曲线a)。在除氧的PBS(0.1M，pH＝7.0)电解质溶液中，CYP3A4/PNGF/GCE的CV曲线中有一对稳定的、峰形对称的氧化还原峰，氧化还原峰电位分别为-0.380V和-0.355V(vsAg/AgCl)(图2中曲线c)。而对于CYP3A4/GCE或CYP3A4/PNGF/GCE(孔径为260nm)则没有明显的氧化还原峰出现(图2中曲线b和c)，这证明了CYP3A4/PNGF电化学响应是因为CYP3A4的电活性位点与PNGF电极之间的直接电子传递，也就是说，组装在PNGF中的CYP3A4具有较好的电化学活性。

图3为孔径为66nm纳米反应器与活性酶形成酶纳米反应器对内分泌干扰物代谢的动力学研究：图中曲线a测试条件为无氧，5mL浓度为0.1M、pH＝7.0的PBS缓冲溶液作为电解液；图中曲线b测试条件为有氧条件下，5mL浓度为0.1M、pH＝7.0的PBS缓冲溶液作为电解液；图中曲线c测试条件为有氧，5mL浓度为0.1M、pH＝7.0的PBS缓冲溶液作为电解液，往电解液里加入25ul浓度为5mM的睾酮，图中曲线d测试条件为有氧，5mL浓度为0.1M、pH＝7.0的PBS缓冲溶液作为电解液，往电解液里加入50ul浓度为5mM的睾酮。

图3曲线a和b是在无氧和有氧条件下，CYP3A4/PNGF/GCE的CV对比图。由图可以看出，氧气的存在使CYP3A4/PNGF/GCE在-0.376V处的还原电流明显增加。由此说明CYP3A4/PNGF/GCE上增加的还原电流是基于氧分子与还原型亚铁CYP快速结合而产生的。该过程由电极驱动，首先电极上的电子转移到还原酶CPR，然后再转移到CYP3A4血红素中心。而PNGF优异的电子传递性能、生物兼容性和大比表面积对该电子转移过程的实现发挥了重要作用。进一步，选择睾酮作为模型底物，用于验证修饰电极上CYP3A4对底物的催化活性。由图3中曲线c、d可以看出，随着底物睾酮的加入，CYP3A4/PNGF/GCE在-0.376V处的还原电流明显增加。由此说明负载在PNGF孔内的CYP3A4对底物具有电化学驱动的催化活性。

这说明有氧条件下，在电解液溶液中加入底物睾酮，会引起PNGF中CYP3A4还原峰电流的增加，随着睾酮加入量的增加，还原峰电流也随之增加(图3)，说明PNGF中的CYP3A4对睾酮的代谢有明显的电化学驱动催化作用，将睾酮代谢成6β-羟基睾酮。

CYP3A4/PNGF/GCE对连续加入的睾酮的电流响应可以用时间-电流曲线进行表征。如图4A所示，当睾酮加入到0.1M pH 7.0PBS缓冲溶液以后，CYP3A4/PNGF/GCE于-0.376V处的还原电流快速增加，并且在3s之内很快达到一个稳定值。图4B给出的是-0.48V处的稳态电流与底物浓度的曲线关系。进一步，如图4C所示，作稳态电流与底物浓度的双倒数曲线，得到线性回归方程为Y(nA^-1)＝0.048+5.348X(mM^-1)(R²＝0.997).根据Michaelis-Menten方程:

式中Iss为加入底物后的稳态电流，C为本体溶液中底物的浓度，Imax为底物浓度饱和时的最大电流，Km^app为表观米氏常数。在该体系中，求得平均Imax(等效于Vmax)和Km^app分别为0.245μA和110.70μM。这进一步证明PNGF作为一个酶纳米反应器，为活性酶提供了良好的生物微环境，很好地保持了活性酶的生物活性。

实施例2：

(1)以粒径为250nm功能化的二氧化硅作为模板，通过疏水性-疏水性作用将其与氧化石墨烯混合；二氧化硅小球的制备是TEOs水解、缩合的过程即：取10mL种子分散液、70mL乙醇、13mL水、7.5mL氨水添加到烧瓶中，室温下搅拌均匀后，然后用恒压滴液漏斗加入TEOs和乙醇的混合液(体积比为1:10)，反应5h，此过程不断重复四次即可得到粒径为250nm的二氧化硅小球

功能化的二氧化硅的合成方法为：将15M盐酸、0.6g聚醚F108、0.875mL DMDMS分别添加到75mL浓度为1mg/mL的二氧化硅小球的水溶液中得到甲基化二氧化硅溶液，再氨水中和甲基化二氧化硅溶液，制得所述的功能化的二氧化硅。

以功能化的二氧化硅作为模板，通过疏水性-疏水性作用将其与氧化石墨烯混合:首先将氧化石墨粉末分散到水中并超声4h，再在3000rmp条件下离心30min得到浓度为0.5mg/mL-1mg/mL的氧化石墨烯水溶液，然后按照体积比1:3比例将功能化的二氧化硅和氧化石墨烯水溶液在室温下混合12h得到复合材料；

(2)向步骤(1)中得到的复合材料进行-20℃冻干、冷冻干燥，惰性气体中煅烧，用5wt％的氢氟酸洗模板得到石墨烯泡沫；通过用场发射扫描电镜和透射电镜对制成的石墨烯泡沫进行形貌测试(图1b)。

(3)向步骤(2)中得到的石墨烯泡沫用水分散，通过加入浓度为1mg/mL的盐酸多巴胺溶液对石墨烯泡沫进行功能化修饰：按照体积比为20：1的比例往盐酸多巴胺溶液中加入石墨烯泡沫得到浓度为0.5mg/mL的PNGF纳米复合材料；

(4)向步骤(3)中得到的PNGF纳米复合材料，取一定量的材料作为酶纳米反应器放入A离心管中，往里加入活性酶，振荡器上混匀，滴在玻碳电极上待用。利用三电极体系即珀丝电极为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，玻碳电极为工作电极，电解液为浓度为0.1M、pH＝7.0的PBS缓冲溶液，在一定的扫速和无氧条件下进行循环伏安测试。再通过加入不同浓度的内分泌干扰物睾酮对其动力学进行研究。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。