本发明涉及中药质量控制
技术领域：
，特别是涉及一种木香对照提取物及其制备方法和应用。
背景技术：
：现行中药质量控制模式基本上是沿着天然药物化学的发展，对中药某一种或几种有效成分为目标的分析方法和既有定性又可定量的质量标准的构思，参照国外植物药的质量控制方法，借鉴化学药品质量控制的模式，并借助文献报道建立相应的简单理化鉴别，再发展到以光谱、色谱为主的鉴别和含量测定的质量标准。每一味中药材都是多成分的综合体，这决定了其特有的整体性和模糊性，也表明以药材中一两个甚至几个成分作为药材质量的评价方法存在很大的局限性。1990版《中国药典》增加了对照药材的薄层色谱鉴别，使得中药及中成药的鉴别有了很大的进展。目前中药和国外的草药越来越重视多成分或多组分的检测，例如德国银杏叶提取物的质量控制。指纹图谱的分析方法，可以从整体上对药材进行质量控制，现在仍然有很大的研究价值。目前中国药典在控制药材质量方面有两种“对照品”，化学对照品和中药对照药材。其中化学对照品可用于药材的定性鉴别和定量分析，中药对照药材则用于显微鉴别和薄层鉴别。然而，化学对照品和中药对照药材在中药质量控制上都有其局限性。这种局限性表现在，一、中药中化学成分多样化，单一或者几个化合物并不能反映药材的全貌，而现有的标准往往有很多漏洞，以次充好的现象时有发生；二、中药对照药材受到产地、生长环境的影响，很难保证每一批的质量一致，而且只能用于定性鉴别，无法反映药材成分含量的高低。中药对照提取物是用中药材制备的性状及成分稳定，可以用于定性或者定量分析的提取物，谢培山先生对中药对照提取物提出了四个基本要求(ascs)，也是对照提取物应具备基本条件：authenticity，药材来源可靠，具有代表性；specificity，使用的检测方法专属性；con-sistency，不同批次对照提取物应保持一致；stability，性状稳定、均匀、便于使用。运用高效薄层色谱指纹图谱以及高效液相指纹图谱等方法，可以用于药材的定性鉴别，经过外标法标化的对照提取物，可以进一步用来半定量及定量分析检测。中药对照提取物将对中药质量控制有重要的意义。技术实现要素：鉴于此，有必要提供一种木香对照提取物及其制备方法和应用。本发明的木香对照提取物的制备方法操作简便、成本低、重复性好且提取率高，用此制备方法制备的木香对照提取物一致性好、性状稳定、均匀且便于使用，能够反映药材的全貌。本发明采用以下技术方案：一种木香对照提取物，其中木香烃内酯和去氢木香内酯总含量不得低于3.5％且不高于9.0％，含水量不高于5.0％。一种木香对照提取物的制备方法，包括分别对多批木香药材粉末进行多次提取，得到不同批次的木香提取物，然后对不同批次的木香提取物进行调配，得到木香对照提取物；所述对木香药材粉末进行多次提取，是使其含有木香烃内酯和去氢木香内酯的成分的纯度和/或浓度提高，从而得到木香提取物。进一步的，所述的木香对照提取物的制备方法，包括以下步骤：步骤一、ⅱ类石油醚提取：采用ⅱ类石油醚对样品进行多次提取，合并提取液，制得提取物ⅰ，滤渣备用；步骤二、乙醇提取：用乙醇对步骤一中的滤渣进行多次提取，制得提取物ⅱ；步骤三、混合：将步骤一所得的提取物ⅰ和骤二所得的提取物ⅱ混合，制得木香提取物；步骤四、按照步骤一至步骤三的操作，分别将各批次的木香药材制备成木香提取物；步骤五、调配：将步骤四制得的各批次的木香提取物调配成木香对照提取物。进一步的，所述的木香对照提取物的制备方法，具体包括以下步骤：步骤一、ⅱ类石油醚(同下文中的“石油醚(ⅱ)”)提取：取木香药材粉末过2号筛与石油醚(ⅱ)混合，超声提取后过滤，得到滤液ⅰ1和滤渣ⅰ1，滤渣ⅰ1重复所述操作，所得的滤渣ⅰ2再重复所述操作；以此循环n次，分别收集每次的滤液ⅰ1-ⅰn和滤渣ⅰn；将滤液ⅰ1-ⅰn合并得提取液ⅰ,将提取液ⅰ回收石油醚(ⅱ)后得到提取物ⅰ；步骤二、乙醇提取：将步骤一的滤渣ⅰn与体积浓为50％-80％(优选60％)的乙醇混合，闪式提取后过滤，得到滤液ⅱ1和滤渣ⅱ1，滤渣ⅱ1重复所述操作，所得的滤渣ⅱ2再重复所述操作；以此循环x次，分别收集每次的滤液ⅱ1-ⅱx和滤渣ⅱx；将滤液ⅱ1-ⅱx合并得滤液ⅱ；将滤液ⅱ蒸干得到干膏，将干膏溶解于60％乙醇，得到木香干膏乙醇溶液，再加入辅料，蒸干过筛得到提取物ⅱ。步骤三、混合：将步骤一得到的提取物ⅰ用石油醚(ⅱ)溶解，加入步骤二得到的提取物ⅱ，混匀，蒸干，过筛得到木香提取物。步骤四、将多批次木香药材粉末中的各批次木香药材粉末分别按步骤一至步骤三的操作制得不同批次的木香提取物。步骤五、调配：将不同批次的木香提取物进行取等量混合调配，得到木香对照提取物。进一步的，所述步骤一中的木香药材粉末(g)与石油醚(ⅱ)(ml)的重量体积比为1:5～1:50，优选1：5；进一步的，所述步骤一中的超声时间为30～60min，功率为100w～3kw；优选为30min，功率为500w。进一步的，所述步骤一中的过滤是用中速滤纸或者2000目筛网过滤。进一步的，所述步骤一中6≥n＞0，且n为整数；优选n为3。进一步的，所述步骤二中6≥x＞0，且x为整数；优选x为5。进一步的，所述步骤二中的滤渣ⅰn(g)与乙醇(ml)的重量体积比为1:5～1:50，优选为1：5；进一步的，所述步骤二中的闪式提取时间为1～2min，功率为100w～3kw；优选为1min，功率为500w。进一步的，所述步骤二中的过滤是用中速滤纸或者2000目筛网过滤。进一步的，所述步骤二中木香干膏(g)与60％乙醇(ml)的重量与体积比1:5-1:10；优选1:8。进一步的，所述步骤二中在木香干膏乙醇溶液加入的辅料重量为木香干膏的乙醇溶液重量的20％～60％；优选50％。优选的，所述辅料为微孔硅胶。进一步的，所述步骤二蒸干后是过90～200目筛网过滤；优选110目筛网。进一步的，所述步骤三中提取物ⅰ(g)和石油醚(ⅱ)(ml)的重量体积比为1:8-1:50；优选为1:20。进一步的，所述步骤三蒸干后是过90～200目筛网过滤；优选110目筛网。进一步的，步骤五在调配之前还包括以薄层色谱法和/或高效液相色谱法对不同批次的木香提取物的木香烃内酯和去氢木香内酯进行检测的调配前处理。进一步的，所述步骤五中调配的标准为：应使最终得到的对照提取物中木香烃内酯和去氢木香内酯总含量不得低于3.5％且不高于9％；本发明方法制得的木香对照提取物在木香、含木香、含木香有效成分的药材或中药制剂的成分检测或质量控制中的应用。一种检测木香、含木香、含木香有效成分的药材或中药制剂的成分方法，包括采用薄层色谱法和/或高效液相色谱法对木香对照提取物、药材或中药制剂中的木香烃内酯和去氢木香内酯进行检测，对比判断。进一步的，采用所述检测方法检测时，需要将木香对照提取物、待检产品配制成溶液再进行。进一步的，所述薄层色谱法中木香对照提取物溶液的配制方法为：精密称取所述木香对照提取物0.23g-1.15g，用甲醇配制成浓度为0.115g/ml-0.575g/ml的溶液，过0.12-0.32μm滤膜即得木香对照提取物溶液；优选所述称取木香对照提取物0.23g，用甲醇配制成浓度为0.115g/ml的溶液，过0.22μm滤膜，即得木香对照提取物溶液。进一步的，所述薄层色谱法中待检产品溶液配制方法为：取待检产品过二号筛后称取0.5g-5g,加入10ml-100ml氯仿，功率为100w～3kw，超声30～60min后用中速滤纸或者2000目筛网过滤，滤渣重复提取一次，合并两次滤液，60℃-80℃水浴挥去氯仿，滤液蒸干后的残渣加甲醇定溶解并容至2-20ml，过0.12-0.32μm滤膜即得待检产品溶液；优选称取待检产品0.5g，加入氯仿10ml,超声30min，功率为500w，中速滤纸过滤，60℃水浴挥去氯仿，滤液蒸干后的残渣加甲醇定溶解并定容至2ml,过0.22μm滤膜，即得待检产品溶液。进一步的，所述薄层色谱法检测条件为：薄层板：hptlcg60预制板；点样：3μl，条带状点样长7mm；展开剂：甲苯、氯仿、乙酸乙酯及甲醇展开步骤如表1：表1薄层板的干燥：点样后的薄层板置于薄层加热板上，50℃加热15min，保证薄层板的干燥；检视:约喷5ml2％的对二甲氨基苯甲醛、含20％磷酸和20％硫酸的乙醇溶液，105℃加热1.5min，置于uv366nm下检视。进一步的，所述高效液相色谱法检测中，木香对照提取物溶液的配制方法为：精密称取所述木香对照提取物5mg-50mg，用甲醇配制成浓度为2.5mg/ml-25mg/ml的溶液，过0.12-0.32μm滤膜即得木香对照提取物溶液；优选所述称取木香对照提取物5mg，用甲醇配制成浓度为2.5mg/ml的溶液，过0.22μm滤膜，即得木香对照提取物溶液。进一步的，所述高效液相色谱法检测中，待检产品溶液的配制方法为：取待检产品过二号筛后精密称取0.3g-3g,置具塞锥形瓶中，加入50ml-500ml甲醇，密塞，称定重量，放置过夜，超声30～60min，功率为100w～3kw，放冷，再称定重量，用甲醇补足失重，摇匀，过0.12-0.32μm滤膜，取续滤液即得待检产品溶液。优选精密称取待检产品0.3g，加入50ml甲醇，超声30min，功率为500w，过0.22μm滤膜。进一步的，所述的高效液相色谱法检测条件：色谱仪器：agilent1260series高效液相色谱仪，配有dad检测器(美国，agilenttechnologies)色谱柱：agilentzorbaxsbc18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：a-甲醇，b-0.1％磷酸水溶液；梯度洗脱程序：0-18min：20％a→40％a，18-40min：40％a→75％a，40-65min：75％a-100％a；65-70min:100％a；检测波长237nm(dad检测器)；流速1ml/min；进样量10μl；柱温25℃；运行时间：70min。本发明具有以下有益效果：本发明的木香对照提取物的制备方法采用了提取、制备木香提取物和调配的步骤，操作简便、成本低、重复性好且提取率高。用此制备方法制备得到的木香对照提取物因是不同批次的提取物进行调配而成，克服了因中药对照药材受到产地、生长环境的影响，很难保证每一批的质量一致的缺陷，从而保证了不同批次的木香对照提取物的一致性，而且其性状稳定、均匀且便于使用；采用本发明的木香对照提取物的制备方法最终得到的对照提取物中木香烃内酯和去氢木香内酯总含量不得低于3.5％且不高于9％，含水量不高于5.0％，且对照提取物薄层色谱指纹图谱、hplc指纹图谱与正品木香药材对应一致。本发明还提供了药材或中药制剂的鉴别方法，或木香或含木香/木香有效成分的药材或中药制剂的质量控制方法，不仅可以对药材或中药制剂进行定性鉴别，而且还可以用于半定量甚至定量分析。本发明方法制得的所述木香对照提取物采用薄层色谱法和/或高效液相色谱法得到的图谱与其对应的原料药材一致；本发明方法制得的所述木香对照提取物采用薄层色谱法检测得到的色谱图中的木香烃内酯和去氢木香内酯位置处的荧光斑点和采用高效液相色谱法检测得到的色谱图在木香烃内酯和去氢木香内酯位置处的色谱峰应分别与其对应的化学对照品或其对应的正品药材一致。附图说明图1是以化学对照品和对照药材为参照物质对木香原料药材用薄层色谱法检测得到的tlc指纹图谱，s由下往上依次对应为对照品木香烃内酯和去氢木香内酯，1为木香对照药材，2-7分别对应木香原料药材1、木香原料药材2、木香原料药材3、木香原料药材4、木香原料药材5和木香原料药材6，8为土木香对照药材。图2是以化学对照品和对照药材为参照物质对木香原料药材用高效液相色谱法检测得到的hplc指纹图谱叠加图，s1木香烃内酯对照品，s2为去氢木香内酯对照品，从上往下1为木香药材的共有模式，2为木香对照药材，3-8分别对应木香原料药材1、木香原料药材2、木香原料药材3、木香原料药材4、木香原料药材5和木香原料药材6，9为土木香对照药材。图3为本发明木香对照提取物制备流程图。图4中4-1是针对以化学对照品、木香对照药材和木香对照提取物为参照物质对市售药材进行薄层色谱法得到的高效薄层色谱图。其中标号s的色谱带由下往上依次对应为对照品木香烃内酯和去氢木香内酯，1对应为本发明木香对照提取物，2对应木香对照药材，3-12依次对应木香1、木香2、木香3、木香4、木香5、木香6、木香7、木香8、木香9和木香10，的药材，13对应土木香对照药材。4-2为图4-1经过“chempattern”软件扫描得到的对应数码扫描图谱。图5是针对以化学对照品和木香对照提取物为参照物质对市售药材进行高效液相色谱法得到的hplc指纹图谱叠加图，s1木香烃内酯对照品，s2为去氢木香内酯对照品，从上至下1对应木香药材共有模式，2对应木香对照提取物，3对应木香对照药材，4-13分别对应为木香1、木香2、木香3、木香4、木香5、木香6、木香7、木香8、木香9和木香10，14对应土木香对照药材。图6是建立的木香药材的指纹图谱共有模式图谱。其中13号色谱峰对应为表木香烃内酯，14号色谱峰对应为去氢木香内酯。具体实施方式为了更好的说明本发明技术方案所要解决的问题、采用的技术方案和达到的有益效果，现结合具体实施方式进一步阐述。值得说明的是，本发明技术方案包含但不限于以下实施方式。本发明实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。经反复试验验证，按照本实施方式的方法，在前述参数范围内任意选择参数制备得到的木香对照提取物的性质相当，其用于检测样本的效果也与本实施方式所例举的效果相当，由于反复试验的实验记录和数据量较大，本实施方式仅以其中一些具体参数为例，不再一一列出。仪器和材料：拟用于制备对照提取物的药材:木香药材购于全国各大药材市场，经鉴定为菊科科植物木香aucklandialappadecne的干燥根。ats4薄层色谱全自动点样仪、薄层色谱双槽展开缸、和tlcvisualizer薄层色谱摄像仪(瑞士，camag)。agilent1260series高效液相色谱仪，配有dad检测器(美国，agilenttechnologies)。甲醇、乙醇、均为分析纯(天津大茂化学试剂厂)。甲苯、乙酸乙酯、氯仿(广州化学试剂厂)。木香烃内酯和去氢木香内酯，标示纯度均≥98％，(宝鸡辰光生物科技有限公司)；测试药材木香：木香药材11批采购于广州各大药店及药材市场,木香1-11。实施例1木香原料药材的筛选本实施例提供了本发明木香对照提取物的原料药材的筛选方法。用薄层色谱法以及高效液相色谱法分别以化学对照品为参照物质对木香原料药材进行分析以及筛选。木香药材购于全国各大药材市场，已鉴定为菊科科植物木香aucklandialappadecne的干燥根。经鉴定9批药材符合标准可以备用。1薄层色谱1.1样品制备化学对照品溶液：精密称取木香烃内酯和去氢木香内酯，分别用甲醇配制成1mg/ml的溶液。木香对照提取物溶液：精密称取实施例1制备得到的木香对照提取物0.23g，置2ml容量瓶中，加入甲醇1.5ml，超声(500w)处理30分钟，放冷，用甲醇定容至刻度，过0.22μm滤膜即得木香对照提取物溶液。药材供试品溶液：取药店木香药材粉末(过二号筛)各0.5g，加入10ml氯仿超声30min，过滤，再加10ml氯仿超声30min，过滤，合并滤液，水浴挥去氯仿，加甲醇定容至2ml，过0.22μm滤膜，即得。1.2薄层色谱检测检测条件如下：薄层板：hptlcg60预制板(merck)；点样：3μl，条带状点样长7mm；薄层板的干燥：点样后薄层板置薄层加热版50℃加热15分钟。展开剂：甲苯、氯仿、乙酸乙酯及甲醇展开方式：amd2展开，展开步骤如下表：表2检视：喷约5ml2％对二甲氨基苯甲醛含20％硫酸和20％磷酸的乙醇溶液，置薄层加热板上105℃加热1min，于uv366nm下检视色谱图像。检测结果如图1，木香烃内酯和去氢木香内酯分离请况很好，各批药材在同一位置都可以显示相同的斑点，各批次间相似度高，初步筛选为标准对照提取物原料药材。2高效液相色谱2.1样品制备化学对照品溶液：精密称取适量木香烃内酯、去氢木香内酯对照品，用甲醇配制成0.1mg/ml的溶液即可。木香对照提取物溶液：精密称取ers5mg，置2ml容量瓶中，加甲醇1.5ml，超声处理30分钟，放冷，加甲醇定容刻度，摇匀，过0.22μm滤膜即得。药材供试品溶液：取各药店木香粉末(过四号筛)约0.3g，精密称定，置具塞锥形中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，放置过夜，超声处理(功率250w，频率50khz)30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液即得。2.2高效液相色谱检测高效液相色谱法检测条件如下：色谱仪器：agilent1260series高效液相色谱仪，配有dad检测器(美国，agilenttechnologies)色谱柱：agilentzorbaxsbc18(4.6mm×250mm,5μm)；流动相：a-甲醇，b-0.1％磷酸水溶液；梯度洗脱程序：0-18min：20％a→40％a，18-40min：40％a→75％a，40-65min：75％a-100％a；65-70min:100％a；检测波长237nm(dad检测器)；流速1ml/min；进样量10μl；柱温25℃；运行时间：70min。高效液相色谱法检测方法：分别精密吸取化学对照品溶液、木香对照提取物溶液和药材供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪。高效液相色谱法检测结果：测定，记录色谱图，即得图2所示的hplc指纹图谱叠加图，s1木香烃内酯对照品，s2为去氢木香内酯对照品，从上往下1为木香药材的共有模式，2为木香对照药材，3-8分别对应木香原料药材1、木香原料药材2、木香原料药材3、木香原料药材4、木香原料药材5和木香原料药材6，9为土木香对照药材。由图2可以看出，木香对照药材和木香1-木香6原料药材的指纹图谱具有高度的一致性，由此建立木香药材的指纹图谱共有模式，并对所有样品进行相似度分析。根据既定的木香药材指纹图谱共有模式，采用夹角余弦算法根据各样品组分及其峰面积对木香对照药材及6批木香药材样品进行相似度评价，结果如表3所示。表3样品相似度木香对照药材0.997木香原料药材10.998木香原料药材20.994木香原料药材30.993木香原料药材40.992木香原料药材50.999木香原料药材60.992共有模式1根据以上相似度分析结果，6批木香原料药材的相似度很高，可选用为木香标准对照提取物提取得原料药材。本实施例仅以6批原材料药材为例，阐述原材料药材的选择鉴定方法。本发明所指的“多批次”包括但不限于本实施例批次。实施例2本发明木香对照提取物的制备从实施例1中的经筛选鉴定的原材料中选择相似度高的4批次，分别制成木香提取物。参照附图3的流程图一：提取选取木香药材，制成粉末，药材粉末过二号筛(850±29μm，24目)，然后加入其质量5倍体积的石油醚(ⅱ)(即固液比为1：5(w/v))，超声(功率500w，常温)提取30min后中速定性滤纸过滤，收集滤渣ⅰ1和滤液ⅰ1，滤渣ⅰ1按相同方法再次提取三次，并将再次提取三次收集的滤液与滤液ⅰ1合并即为提取液ⅰ，将提取液ⅰ回收溶剂后即得提取物ⅰ。取滤渣ⅰ3，加入其质量5倍体积的60％乙醇(即固液比为1：5(w/v)，闪提1min后中速定性滤纸过滤，收集滤渣ⅱ1和滤液ⅱ1，滤渣ⅱ1按相同方法再次提取五次，并将再次提取五次收集的滤液与滤液ⅱ1合并即为提取液ⅱ，将提取液ⅱ蒸干，得到干膏。用干膏8倍(重量体积比)的60％乙醇将干膏溶解，再加干膏重量50％微孔硅胶，用旋转蒸发仪蒸干，粉碎过110目筛，得到提取物ⅱ。二：制备木香提取物用上述制得的提取物ⅰ20倍(重量体积比)的石油醚(ⅱ)将提取物ⅰ溶解，再加入上述制得的提取物ⅱ，用旋转蒸发仪蒸干，粉碎过110目筛，得到木香提取物。按照上述方法，制备4批木香提取物，通过对照品利用高效液相色谱法测定的检测结果如表4所示。表4三：调配将上述的4个批次的木香提取物按1:1:1:1比例混合勾兑得到木香对照提取物，最终产品对应原药材比例大约为1：2(g/g)，其中各成分的含量通过对照品利用高效液相色谱法测定，检测结果如表5所示。表5调配标准为：应使最终的木香对照提取物中木香烃内酯和去氢木香内酯总含量不得低于3.5％且不高于9％(含量以wt％计)。此调配标准中的各成分的含量的范围也是经过多次反复实验综合保持稳定性、一致性以及后面的应用等得出的最佳数据。实施例3木香对照提取物的性状分析1.表观状态：实施例2得到的木香对照提取物为黄色粉末。2.水分测定：按照2015版中国药典附录ixg(减压干燥法)进行。检测结果为木香对照提取物含水量为1.51％。3.一致性测试：按照实施例2的方法制备4批次木香对照提取物，经测定各批次间的针对木香烃内酯和去氢木香内酯的薄层色谱检测结果差异很小，木香烃内酯和去氢木香内酯的荧光斑点均有明显的显示，且分布非常一致；经高效液相色谱检测其木香烃内酯和去氢木香内酯含量均在调配标准范围之内。因此利用本发明的木香对照提取物的制备方法制备得到的木香对照提取物一致性非常好。4.稳定性测试：取4个不同批次的按照实施例2的方法制备的木香对照提取物的供试品，按照国家药典委员会制订的“国家药品标准物质研制技术要求”的相关规定，考察指标包括性状和溶解性。供试品开口置适宜的洁净容器中，60℃温度下放置10天，于第5天和第10天取样，按稳定性重点考察项目进行检测。结果显示，高温试验前后供试品性状无明显变化，高温试验前后薄层色谱图也无明显变化，溶出率测定结果用spss进行独立样本t-检验，计算结果p＞0.05，说明无显著性差异。实施例4本发明实施例2制备得到的木香对照提取物的应用用薄层色谱法以及高效液相色谱法分别以化学对照品和木香对照提取物为参照物质对市售药材进行分析。1薄层色谱1.1样品制备化学对照品溶液：精密称取木香烃内酯和去氢木香内酯，分别用甲醇配制成1mg/ml的溶液。木香对照提取物溶液：精密称取实施例1制备得到的木香对照提取物0.23g，置2ml容量瓶中，加入甲醇1.5ml，超声(500w)处理30分钟，放冷，用甲醇定容至刻度，过0.22μm滤膜即得木香对照提取物溶液。药材供试品溶液：取药店木香药材粉末(过二号筛)各0.5g，加入10ml氯仿超声30min，过滤，再加10ml氯仿超声30min，过滤，合并滤液，水浴挥去氯仿，加甲醇定容至2ml，过0.22μm滤膜，即得。1.2薄层色谱检测检测条件如下：薄层板：hptlcg60预制板(merck)；点样：3μl，条带状点样长7mm；薄层板的干燥：点样后薄层板置薄层加热版50℃加热15分钟。展开剂：甲苯、氯仿、乙酸乙酯及甲醇展开方式：amd2展开，展开步骤如下表：表6检视：喷约5ml2％对二甲氨基苯甲醛含20％硫酸和20％磷酸的乙醇溶液，置薄层加热板上105℃加热1min，于uv366nm下检视并拍照。检测结果如图4-1所示，为uv366nm下检视薄层色谱图(t：20℃)。标号s的色谱带由下往上排依次对应为对照品木香烃内酯和去氢木香内酯，1对应为本发明木香对照提取物，2对应为木香对照药材，3-12依次对应木香1、木香2、木香3、木香4、木香5、木香6、木香7、木香8、木香9和木香10药材，13对应为土木香对照药材。结果分析：由图4-1可知，木香烃内酯和去氢木香内酯分离情况较好，木香对照提取物、木香对照药材和木香药材药材(木香1-木香10)在同一位置都可以显示相同的斑点，从图谱看出木香对照提取物与木香对照药材及木香药材(木香1-木香10)有高度的一致性。将图4-1经过自编软件“digiscan”扫描可以得到其扫描图谱(图4-2)。2高效液相色谱2.1样品制备化学对照品溶液：精密称取适量木香烃内酯、去氢木香内酯对照品，用甲醇配制成0.1mg/ml的溶液即可。木香对照提取物溶液：精密称取ers5mg，置2ml容量瓶中，加甲醇1.5ml，超声处理30分钟，放冷，加甲醇定容刻度，摇匀，过0.22μm滤膜即得。药材供试品溶液：取各药店木香粉末(过四号筛)约0.3g，精密称定，置具塞锥形中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，放置过夜，超声处理(功率250w，频率50khz)30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液即得。2.2高效液相色谱检测高效液相色谱法检测条件如下：色谱仪器：agilent1260series高效液相色谱仪，配有dad检测器(美国，agilenttechnologies)色谱柱：agilentzorbaxsbc18(4.6mm×250mm,5μm)；流动相：a-甲醇，b-0.1％磷酸水溶液；梯度洗脱程序：0-18min：20％a→40％a，18-40min：40％a→75％a，40-65min：75％a-100％a；65-70min:100％a；检测波长237nm(dad检测器)；流速1ml/min；进样量10μl；柱温25℃；运行时间：70min。高效液相色谱法检测方法：分别精密吸取化学对照品溶液、木香对照提取物溶液和药材供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪。高效液相色谱法检测结果：测定，记录色谱图，即得图5所示的hplc指纹图谱叠加图，s1木香烃内酯对照品，s2为去氢木香内酯对照品，从上至下1对应木香药材的共有模式，2对应木香对照提取物，3对应木香对照药材，4-13分别对应为木香1、木香2、木香3、木香4、木香5、木香6、木香7、木香8、木香9和木香10，14对应土木香对照药材。由图5可以看出，木香对照药材与木香1-木香10药材的指纹图谱具有高度的一致性，由此建立木香药材的指纹图谱共有模式，并对所有样品进行相似度分析。共有模式图谱如图6所示，其中13号色谱峰为木香烃内酯，14号色去氢木香内酯。根据ers指纹图谱，采用夹角余弦算法根据各样品组分及其峰面积对木香对照药材、10批木香药材及既定的木香药材指纹图谱共有模式进行相似度评价，结果如表7所示。表7根据以上相似度分析结果，木香对照药材、10批药材和木香对照提取物指纹图谱的相似度在0.953-0.985范围内，相似度很高。木香对照提取物和木香药材指纹图谱共有模式的相似度为0.981，表明本发明的木香对照提取物与药材的一致性良好。根据tlc及hplc指纹图谱的结果可知，对所述木香对照提取物采用薄层色谱法检测得到的色谱图与其对应的原料药材一致，更确切的说，对所述木香对照提取物采用薄层色谱法检测得到的色谱图中的木香烃内酯和去氢木香内酯位置处的荧光斑点和采用高效液相色谱法检测得到的色谱图在木香烃内酯和去氢木香内酯位置处的色谱峰分别与其对应的化学对照品或其对应的原料药材一致，因此本发明的木香对照提取物可应用于药材或中药制剂的定性鉴别，例如对药材或中药制剂的木香烃内酯和去氢木香内酯成分进行定性分析。根据hplc测定结果以及统计分析，建立的木香药材指纹图谱共有模式与木香药材的相似度极高，而本发明的木香对照提取物和木香药材指纹图谱共有模式的相似度又极高，这说明使用本发明的木香对照提取物对药材或中药制剂进行木香烃内酯和去氢木香内酯的含量测定可靠性极高，因此本发明的木香对照提取物可应用于药材或中药制剂的半定量鉴别分析，也可应用于木香及含木香/木香有效成分的药材或中药制剂的质量控制中，例如对药材或中药制剂的药木香烃内酯和去氢木香内酯成分进行半定量鉴别分析，或者对木香及含木香/木香有效成分的药材或中药制剂进行半定量检测进而控制其质量。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页12