本发明属于荧光分析检测领域，特别涉及一种dna结合铽离子的荧光传感器，用免标记的时间分辨荧光及荧光寿命的方法实现了对大规模金属离子的区分及检测。
背景技术：
生化物种的检测不仅是生物化学分析领域的关键，同时也在环境监测、食品安全、临床诊断等领域起着重要的作用。为此，荧光传感器因具有简单快速、实时监控、简单易懂、重现性好等优点而成为有效的检测工具。然而大多数的荧光传感器都会遭遇背景荧光的干扰，从而影响检测的灵敏度和响应范围。为有效消除背景荧光，理想方法就是时间分辨技术。时间分辨技术是利用时间域来把短寿命的自发光从长寿命的荧光中区分出来。目前，镧系金属衍生的荧光探针已经吸引了人们广泛的关注，由于其独特的光学性质，例如长的荧光寿命、狭窄的发射峰以及大的斯托克斯位移。这些性质都让稀土离子掺杂的荧光探针适用于时间分辨检测以此来消除背景荧光。
在传统的传感方法中，每分析一种检测物就需要一个传感器，从而就需要密集的劳动力开发很多种靶标特异性响应的传感器。考虑到这个问题，人们开始致力于基于模式识别的“化学鼻子/舌头”数组或微分集成的阵列传感器，通过一组传感元件的响应实现大量靶标的区分和检测。
金属离子与生命体有着千丝万缕的联系。金属离子的检测属于生化物种检测中重要的一部分。碱金属和碱土金属是很活泼的金属元素，这些生命元素在生物体内各司其职，维持着生命体的正常活动和推动着生命体的发展。例如，人体内的钾离子分布在细胞内液的，维持细胞内液和外液的的渗透压，稳定细胞的内部结构，参与神经信息的传递，维持心血管系统的正常功能，以及作为某些酶的激活剂参与许多重要的生理生化反应等。钠以离子的形式分布在细胞外液中，钾和钠共同作用，调节体内水分的平衡并使心跳规律化。锂离子可以引起肾上腺素及神经末梢的胺量降低，能明显影响神经递质的量。而重金属如铬，铅和汞等离子在体内的富集会严重威胁生命体的健康，如造成记忆丧失，学习缺陷，失明和耳聋，肾脏损伤和癌症等一系列严重问题，如铁离子，作为人体必需的微量元素，发挥着至关重要的作用，涉及血液中氧的运输，dna合成，细胞扩散等众多重要的生命过程。铁离子的缺少或过量存在都会导致一些生理功能的缺失和疾病的发生，例如缺铁性贫血、高血压、不孕不育、中风等。稀土(re)金属包括镧系元素和重金属元素越来越多的在工业中被使用，被这些金属离子污染的废水等的排放不仅会对人类和生态造成毁灭性的伤害，也会引发突变和癌症，其放射性对人类和生态造成毁灭性的伤害。因此，高灵敏度、高选择性的大规模监测和区分金属离子是至关重要的。
目前常规的方法如下所示：
原子吸收光谱法(aas)；电感耦合等离子体原子发射光谱法(icp-aes)；电感耦合等离子体质谱法(icp-ms)；比色法；基于氧化石墨烯或者金纳米颗粒的荧光法等。
传统的金属离子区分和检测的方法一般需要昂贵的大型仪器，如icp-aes来完成；而这个过程需要复杂的前期准备，对样品具有破坏性同时也会造成检测物的损失，在实时原位高通量快速检测方面存在着局限性，检测成本一般较高。除了大型仪器外，比色法、荧光法也被用到。但是目前这些方法只可以同时区分几种或者十几种金属离子，并不能做到大规模的区分的检测，同时也需要复杂的探针制备工作，不符合方法简单快速的趋势。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种dna结合铽离子的荧光传感器(dna/tb)，用时间分辨荧光的方法实现了大规模金属离子的区分及检测。用一种经济实惠的方式实现了几乎覆盖整个元素周期表范围的检测。克服了现有区分、检测金属离子的方法中复杂的前期准备，需要昂贵的大型仪器，难以实现原位实时高通量快速检测，不利于大规模推广的缺陷以及需要复杂的探针制备、无法大规模区分检测金属离子的不足。
实现本发明目的的具体技术方案是：
一种基于dna结合铽离子构成的荧光传感器，其特征在于，采用三段富含鸟嘌呤(g)和胸腺嘧啶(t)脱氧核糖核苷酸的寡链dna，在缓冲溶液中分别与铽离子结合，形成[g3t]3/tb、[g3t]5/tb、[g3t]6/tb；其中，[g3t]3、[g3t]5、[g3t]6为所述三段dna，tb为铽离子；dna作为天线配体敏化tb发出荧光构成所述荧光传感器记作dna/tb；所述三段dna浓度均为1～100μm；tb的浓度为0.5～200μm；缓冲液为tris-hcl，其浓度为50～200mm，ph值为7.0～9.0；反应温度为10～40℃；反应时间为5～20分钟；溶液的体积比为1∶1∶1。
一种上述荧光传感器的制备方法，包括以下具体步骤：
步骤1：制备dna/tb荧光传感器
从十段长度不同的富含鸟嘌呤(g)和胸腺嘧啶(t)脱氧核糖核苷酸的寡核苷酸链[g3t]n筛选了三段与稀土铽离子(tb)反应荧光效果最好的[g3t]n([g3t]3,[g3t]5,[g3t]6)，组成了荧光传感器的三部分；所述荧光传感器，[g3t]3,[g3t]5,[g3t]6的浓度为1～100μm。铽离子的浓度为0.5～200μm，所用的缓冲液为tris-hcl，反应浓度为50～200mm，所述缓冲液的ph值为7.0～9.0；优选地，ph＝7.4。所述反应温度为室温。溶液的体积比为1∶1∶1。
一种上述荧光传感器在区分及检测金属离子上的应用，具体包括：
步骤1：检测方法的选取
向获得的dna/tb光传感器中加入分别待测的金属离子标准溶液或者金属离子混合液，孵育5分钟。通过时间分辨荧光分析方法和检测荧光寿命的方法实现对金属离子或者金属离子混合样加入后荧光和荧光寿命的检测；所述金属离子为碱金属、碱土金属、过渡/后过渡金属、稀土金属离子；
步骤2：检测数据的处理
每组实验重复5次，用主成分分析(pca)的方法分析获得的荧光数据和寿命数据(3dna/tb传感元件×靶标个数×5个平行样)，进行金属离子的区分和检测；其中，
所述碱金属为li、na、k、rb和cs；所述碱土金属为ca、sr、ba和mg；所述过渡/后过渡金属为co、mn、cu、cr、hg、al、ni、cd、zn、pb、ag、feⅱ、feⅲ、ti、v,zr、mo、ru、pd、ir、crⅵ、snⅱ、snⅳ、bi；所述稀土金属为tb、la、ce、y、eu、pr、ho、nd、er、yb、dy、gd、sm、lu、tm和sc。
与现有技术相比，本发明有益效果包括如下：
本发明改变了目前常用的金属离子的检测模式，无需复杂的前期样品准备，不需要使用昂贵的大型仪器，节约了成本。同时也改变了金属离子的区分方法，无需复杂的探针制备过程，所需dna序列均可通过商业化的化学合成获得。纯度高，成本低。同时又扩大了金属离子的检测范围，覆盖范围几乎是整个元素周期表。实现了金属离子大规模的区分及检测。本发明是目前第一次报道一种dna结合铽离子(tb)的模式识别体系，采用三段不同长度的寡链dna敏化稀土铽离子组成通用的“化学鼻子/舌头”传感器，并利用无标记的时间分辨荧光分析方法实现对其荧光的分析和检测。最后结合主成分分析方法和聚类分析方法进行荧光数据的分析实现金属的区分和检测。本发明检测方法用量少，整个反应体系仅需微量级的即可，节约了探针的使用量，实现了微量低成本的检测。本发明检测方法使用敏化后的稀土铽离子的荧光作为信号，具有很长的荧光寿命(达到ms级)，从而可以采用时间分辨荧光分析的方法，能够有效消除检测过程中的背景荧光和散射荧光的影响，可以显著提高灵敏度和信噪比，同时本发明也证明了基于dna/tb荧光寿命的模式识别也可以完成金属离子的区分和检测。
附图说明
图1为本发明制备及检测流程图；
图2为本发明三段dna筛选结果示意图；
图3为三段不同长度的dna的浓度确定图；
图4为本发明的预实验结果图；
图5是dna，dna/tb的圆二色谱图结果图；
图6分别是干扰离子对dna/tb影响情况图；
图7是用pca方法进行金属离子大规模区分的结果图；
图8是用dna/tb识别体系对不同浓度的金属离子，不同浓度的金属离子混样的区分结果图；
图9是同一金属的不同价态的区分结果图；
图10是五种金属分别两个数量级的浓度的区分结果图；
图11是用pca方法对河水中金属离子混样的区分结果图。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1
从10段不同长度的dna中进行筛选，把10μm的[g3t]n(n＝1-10)(如表1)分别加入到10μm的tb溶液孵育10min后，用时间分辨荧光分析的方法进行检测。如图2所示，[g3t]3，[g3t]5和[g3t]6展现出更好的敏化能力。选择这三段dna作为天线配体敏化tb构成荧光传感器dna/tb，接着进行dna与tb之间的化学计量比探索，把不同浓度的dna([g3t]3，[g3t]5和[g3t]6)分别加入到10μm的tb溶液中，得到不同浓度的dna敏化tb，孵育10min后，用时间分辨荧光分析的方法进行检测。结果见图3。如图3所示，[g3t]3，[g3t]5和[g3t]6的天线敏化比率([g3t]n/tb)分别是4:5,2:5,1:5。除非特作说明，在接下来的实验中，选择[g3t]3，[g3t]5和[g3t]6的终浓度分别为8μm，4μm，2μm。实现本发明的传感器。
表1
实施例2
选取银离子(ag)和铬离子(cr)和空白(水)作为预实验，取10μl不同金属离子待测溶液，加入到传感器溶液中，混合后室温放置5min，然后用时间分辨荧光分析的方法进行检测。用主成分分析的方法实现对荧光数据处理，如图4a-e所示，ag会使dna/tb荧光增强，而cr会引发dna/tb荧光淬灭。每组实验重复5次，用pca的方法分析荧光矩阵(3dna/tb传感器组成×靶标个数×5个平行样)，结果如图4f所示，这三种靶标(2种金属和空白)可以通过基于荧光传感器dna/tb区分。为了进一步探究作用机理，测定了这三种情况下的dna/tb荧光寿命，如图4g-i所示，dna/tb荧光传感器的荧光寿命均超过0.4ms，证明了该传感器可以用作无背景干扰的时间分辨(trl)金属离子荧光分析检测。在典型的trl实验中，在脉冲激发下，设置一个延迟时间和收集时间，从而在延迟时间中消除短寿命的背景荧光在收集时间中仅仅收集到长寿命的dna/tb信号。而当加入cr,ag之后，其荧光寿命发生改变，如图4j-k所示。随后，pca也对荧光传感器在空白，ag，cr的情况下的荧光寿命进行分析，发现基于荧光寿命的模式识别也可以很好的进行荧光区分，如图4l所示。圆二色谱广泛的被用于表征dna结构，如图5所示，单纯的dna([g3t]3，[g3t]5和[g3t]6)分别在260nm处展现出一个正峰，而在240nm左右出呈现倒峰；当加入tb与dna结合后，导致一些峰形的改变，意味着dna空间构型的变化从而导致dna/tb有着不同荧光强度和不同的荧光寿命。
实施例3
为了更广泛的评估dna/tb荧光传感器区分能力，分别加入49种金属离子作为靶标，包括碱金属，碱土金属，过渡/后过渡金属以及稀土金属，选择其最常见或者稳定的状态。由于碱金属具有较低的电荷密度，因其很难通过荧光方法检测和区分，所以选择较高的浓度。碱金属浓度为500μm，其他金属均为5μm，分别加入3个dna/tb荧光传感元件中，检测方法如上述预实验所述。pca分析方法评估金属离子诱导的dna/tb荧光传感器响应情况。如图6a,c,e,f所示，5种碱金属、4种碱土金属、24种过渡/后过渡金属、16种稀土金属可以被很清楚的区分开且具有很高的区分准确度。值得注意的是，虽然只有三个dna/tb荧光传感器组成部分，但这简单的dna/tb荧光传感器可以区分相似度很高的稀土金属离子。除了上述的基于trl的模式识别外，基于荧光寿命的模式识别也可以实现金属离子的区分(以碱金属和碱土金属为例)，如图6b,d，这与trl结果有很大的相似之处(图6a,c)。因此本发明提出的dna/tb荧光传感器可在trl和荧光寿命两种模式下均可实现大规模的金属离子区分。作为对照实验，对一些与金属离子抗衡离子(f-,cl-,no3-,so42-,nh4+)加入后的荧光响应也进行了检测，如图7所示，即使在终浓度为100μm的情况下，荧光改变也微乎其微，进而证明了荧光信号的改变确实是由于这些金属离子引起的。
实施例4
为了检测dna/tb荧光传感器的灵敏度，本发明选择了四种金属(k,sr,pb,tb)作为碱金属，碱土金属，过渡/后过渡金属以及稀土金属的代表，进行灵敏度分析。如图8所示，由于第二个判别因子(pc2)小于40％，所以第一个判别因子(pc1)即可描述荧光响应情况与金属浓度的关系(图8a,c,e,g)。从图中可以看出，荧光响应元件在浓度为亚微摩尔级时也有良好的响应(图8b,d,f,h)，线性范围为0-0.1mm(k)和0-5μm(sr,pb,tb)。在稀土离子很难区分的情况下，成功区分了16种稀土离子的同时，也实现了对tb灵敏度的检测(图8h)。
实施例5
进行混合样品的区分。测试了不同摩尔浓度比的k/rb，ba/ca，ru/ti，lu/la，如图8i-l所示，通过pca分析后，这些混合样品可以很清楚的被区分出来。如图9所示，不同浓度比的不同价态的fe(feii,feiii)通过pca可以很好的区分。同时也证明了的荧光传感器对于同一种金属的不同价态也是非常敏感的，五种金属两个不同浓度经过pca分析同样得到了理想的结果(图10)。另外，一系列未知的标准金属样品加入到荧光响应元件中，进行盲测，49个样品成功率达100％(如表格2)。
表2
实施例6
为了证明dna/tb荧光传感器可以在环境当中区分混合样品，准备了一系列的混合样品。在丽娃河水中分别加入不同摩尔比的cu/pb溶液(cu/pb＝1:0,0.75:0.25,0.4:0.6,0.25:0.75,0:1,都是μm)，和eu/ce溶液(eu/ce＝0:1,0.3:0.7,0.4:0.6,0.75:0.25,1:0,都是μm)以及六组检测样品a)0.8μmcu+0.2μmpb,b)0.5μmcu+0.5μmpb),c)0.3μmcu+0.7μmpb),d)0.8μmeu+0.2μmce,e)0.5μmeu+0.5μmce,andf)0.25μmeu+0.75μmce。将上述样品分别加入到荧光传感器中孵育5分钟，测定其荧光强度。pca结果如图11所示。同时用icp-aes分析检测组的金属含量，如表3所示，可以发现检测组的pca范围与icp-aes测得的结果一致。例如，样品a的pca点落在了cu/pb摩尔比为1:0和0.75:0.25之间，证明cu的浓度为0.75-1μm，pb的浓度为0-0.25μm。这与icp-aes结果一致。证明了dna/tb荧光传感器可以实现复杂环境体系中金属离子的半定量检测。这种简单无标记的荧光分析方法在低成本的情况下实现混合样品的测量，可以与高灵敏的icp-aes相媲美。
表3
本发明第一次提出了用dna/tb作为荧光传感实现了金属离子的大规模区分及检测。而这种应用依赖于dna敏化tb的协同作用，以及金属/dna之间的相互作用诱导的天线配体效应的改变。只需三段dna敏化tb即可构成荧光传感，而金属离子与dna的相互作用会不同程度的改变天线配体效应从而产生trl和荧光寿命的模式信号实现了包括碱金属，碱土金属，过渡/后过渡金属以及稀土金属在内的49种金属离子的区分。
综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明范围。凡依本发明内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明保护范畴。