本发明涉及医药，特别是一种基于苦度阈值浓度的药物分子苦度测量方法。
背景技术：
药物分子苦度是一个抽象的概念。人们对药物苦味本身的评价多是通过定性的描述来表达，如无法忍受的苦、有点苦、几乎没有苦味等，缺乏对其客观测量的表达。已有的药物分子苦度测量化方法多存在测量标准不统一、适用范围窄等问题，没有一套科学、可行、规范的测试体系，这对开展药物的掩味研究是非常不利的。因此，采用一定的方法对药物分子苦度进行测量，使其可以用准确的数学指标进行表达，是非常必要的。
在食品领域，人们曾尝试测量描述苦度。如啤酒苦度的测量，常通过量化所含全部异构化α-酸(啤酒苦味的主要来源)来测量其苦度，其表示方式有欧洲苦度单位(Europe Bitterness Units,EBU)等。一个IBU相当于一毫克异构α-酸在一升啤酒里的苦味，其计算公式为IBU＝(啤酒花重量*这种啤酒花的α-酸百分比*这种α-酸在某个比重的麦芽汁中煮过时间的异构率)/啤酒体积。然而，在药学领域，尤其在中药学领域，由于苦味成分类别多、通过计算单位体积内某种特定苦味成分的的量的方法，很难应用于药物的分子苦度测量化测量。
味道的产生，本质上是物质分子溶于唾液，与舌头上的味蕾受体相结合，产生不同的电信号，从而感应出不同的味道。1972年Kier对甜味AH/B系统理论进行了扩展，提出著名的AH/B.X甜味三角理。与甜味受体模型非常相似，苦味物质分子与受体之间的结合也可以用AH/B结构来表示，苦味助味基取决于其疏水性结构而非亲脂性结构。许多化学结构迥异的化合物都具有苦味，如羟化脂肪酸、氮杂环化合物、酰胺、糖基化合物、酚、生物碱、萜、糖苷以及金属离子等，苦味的产生除了与苦味分子的形状、大小有关，也与所含官能团的性质及其在分子中的位置相关。与药物浓度无关、仅与药物分子的属性相关的苦度，我们称之为分子苦度(Molecule Bitterness，MB)。
所以，目前系统阐述药物苦度测量化方法的研究尚未见报道，本发明旨在建立一种基于苦度阈值浓度的药物苦度的测量方法，为药物的苦度评价提供量化指标，并为药物掩味研究奠定基础，开拓药物的商业价值，提高药物的服用效果是十分必要的，那么，如何定量的检测药物分子苦度，至今未见有公开报道。
技术实现要素：
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明的目的就是提供一种基于苦度阈值浓度(Bitterness Threshold，BT)的药物分子苦度测量方法，可以有效解决测量中药单体成分的分子苦度，从而更加准确客观定量比较不同药物苦味的苦度问题。
本发明解决的技术方案是，一种基于苦度阈值浓度的药物苦度测量方法，配制标准苦味物质和待测单体的系列低浓度溶液；37℃下，采用“经典心理物理学最小极限法”进行标准苦味物质和待测单体的系列低浓度溶液经典人群口尝实验；测得不同浓度下尝到苦味的人数，进行离群值剔除，计算能尝到苦度的最终人数比；将所得人数比与不同浓度之间建立威布尔方程；令人数比等于50％带入所建立的威布尔方程，分别得到37℃下标准苦味物质和待测苦味单体样品水溶液的苦度阈值浓度(BT)，此时二者的苦度阈值浓度(BT)浓度分别记为，标准苦味物质苦度阈值浓度(Cr)，待测单体苦度阈值浓度(Cs)，再将标准苦味物质的分子苦度(MBr)定为1，则待测苦味药物的分子苦度(MBs)等于标准苦味物质苦度阈值浓度与待测单体苦度阈值浓度之商再乘以标准苦味物质的分子苦度(MBs＝(Cr/Cs)×MBr)。
本发明利用经典人群口尝实验、经典心理物理学最小极限法，建立一种苦度阈值浓度，即半数志愿者尝到苦味的最低浓度，简称苦度阈值浓度(Bitterness Threshold，BT)，对苦味单体的苦度，称为分子苦度，基于所得药物阈值浓度及能尝到苦度的人数比利用生物学中公认的韦伯-费希纳定律建立威布尔方程，进行药物分子苦度测量。能够测量单体药物的分子苦度从而测量药物苦味的苦度，取得了准确客观的测量结果，为药物的苦度评价提供量化指标，并为药物掩味提供技术支撑，开拓药物的商业价值，提高药物服用效果，有显著的经济和社会效益。
附图说明
图1、图2为本发明盐酸小檗碱的对数方程的对数曲线图和威布尔方程的威布尔曲线图；
图3、图4为本发明苦参碱的对数方程的对数曲线图和威布尔方程的威布尔曲线图；
图5、图6为本发明穿心莲内酯的对数方程的对数曲线图和威布尔方程的威
布尔曲线图；
图7、图8为本发明氧化苦参碱的对数方程的对数曲线图和威布尔方程的威布尔曲线图；
图9、图10为本发明槐定碱的对数方程的对数曲线图和威布尔方程的威布尔曲线图。
具体实施方式
以下结合具体情况对本发明的具体实施方式做详细说明。
本发明在具体实施时，一种基于苦度阈值浓度(Bitterness Threshold，BT)
的药物分子苦度测量方法，包括以下步骤：
1、配制标准苦味物质和待测单体系列低浓度溶液，标准苦味物质可为任一种苦味药物，系列低浓度溶液是指由第一个参与试验者尝到的苦度到所有参与试验者尝到的苦度范围的系列浓度，是由苦味药物的药粉加入水稀释成的不同浓度溶液，单位为M/L；
2、37℃下，对标准苦味物质和待测单体的系列低浓度溶液经经典人群口尝法，按照浓度由低到高顺序进行编号并置于口尝杯中，并在样品序列中随机加入一个纯水阴性样品，然后按编号顺序将样品含于试验者口中15s，同时口腔做漱口动作，使舌根和舌侧的苦味感受区能够充分感受药物是否有苦味，有苦味的记为1，无苦味的记为0，填入表1所示的苦味结果统计表中，
经典人群口尝实验的人数结果统计表1
表1中c1，c2，c4…cn为苦味物质配置的系列浓度比，操作者依据需要配置不同浓度；N1，N2，N4…Nn为系列不同浓度各浓度下尝到苦度的总人数，P01，P02P04…P0n为系列不同浓度各浓度下尝到苦度的人数占总口尝人数的人数比；
然后吐出样品，漱口5次，至口腔内无苦味，1-2min后测定下一个样品；此外，对于有色样品，加入柠檬黄，使其颜色一致，减少颜色带来的误差；
3、测得不同浓度下尝到苦味的人数，进行离群值剔除，根据国家标准GBT 12315-2008中8.2.1个人表现判定Spearman相关系数的规定，对所有的数据进行统计处理，当对阴性样品的评价仍为“1”，或者违反韦伯-费希纳定律的刺激量与刺激强度成正比的规律，则剔除该样品的数值(数据)；
4、对口尝到的数据进行统计处理，苦味单体浓度的对数与感知到到苦味的人数比例成正相关关系，与生物学中的韦伯-费希纳定律(Weber-Fechner)一致，即感觉强度和刺激的对数呈比例关系，采用“规划求解”对苦味单体感知到苦味的人数比例为0-100％的范围内对不同浓度c下感知苦味的人数比例P0之间P＜ 0.05建立威布尔方程及对数方程，如下：
P0＝alnC+b
其中，p为统计学处理差异度值，a、b、α、β、m、k为不同浓度的待定参数；
5、对比上述威布尔方程及对数方程的R2，得出威布尔方程均优于对数方程，因此，选用威布尔方程采用“经典心理物理学最小极限法”，在人数比(P0)等于 50％，带入所建立的威布尔方程，分别得到37℃下标准苦味物质和待测苦味单体样品水溶液的苦度阈值浓度；
6、37℃下标准苦味物质和待测苦味单体样品水溶液的苦度阈值浓度，分别记为，标准苦味物质苦度阈值浓度Cr，待测单体苦度阈值浓度Cs，再将标准苦味物质的分子苦度MBr定为1，则待测苦味药物的分子苦度MBs等于标准苦味物质苦度阈值浓度与待测单体苦度阈值浓度之商再乘以标准苦味物质的分子苦度，即：MBs＝(Cr/Cs)×MBr，即测得样品的分子苦度。
本发明方法经实地应用，效果非常好，有关试验如下：
以盐酸小檗碱(Berberine，BBR)为标准苦味物质，在BBR的苦度阈值浓度(BT)浓度(0.0153mM)下，其分子苦度定为1；按照上述方法分别测得4 种单体苦参碱、穿心莲内酯、氧化苦参碱、槐定碱苦味单体的苦度阈值浓度并计算出其分子苦度；
1、5种苦味单体不同浓度的配制
(1)将盐酸小檗碱配制为浓度，单位为M·L-1，分别为3.83×10﹣6、7.65×10 ﹣6、1.15×10﹣5、1.53×10﹣5、2.30×10﹣5、3.06×10﹣5、6.12×10﹣5的溶液；
(2)将苦参碱配制为浓度，单位为M·L-1，分别为1.02×10﹣4、2.04×10﹣4、 3.06×10﹣4、4.07×10﹣4、6.11×10﹣4、8.14×10﹣4、1.63×10﹣3的溶液；
(3)将穿心莲内酯配制为浓度，单位为M·L-1，分别为1.15×10﹣3、1.38×10 ﹣3、1.73×10﹣3、2.07×10﹣3、2.60×10﹣3、3.11×10﹣3、3.89×10﹣3的溶液；
(4)将氧化苦参碱配制为浓度，单位为M·L-1，分别为3.641×10﹣6、4.870×10 ﹣6、7.281×10﹣6、9.740×10﹣6、1.456×10﹣5、1.948×10﹣5、2.913×10﹣5的溶液；
(5)将槐定碱配制为浓度，单位为M·L-1，分别为6.867×10﹣6、9.044×10﹣6、 1.373×10﹣5、1.809×10﹣5、2.747×10﹣5、3.618×10﹣5、5.494×10﹣5的溶液；参考文献采用预实验确定苦味单体的浓度；
2、经典人群口尝法评价方法
选择15-22名志愿者，将样品按照浓度由低到高的顺序进行编号并置于口尝纸杯中，并在样品序列中随机加入纯水阴性样品，然后志愿者按编号顺序将样品含于口中，计时15s，此间口腔做漱口动作，使舌根和舌侧的苦味感受区能够充分感受药物是否具有苦味，将结果填入“药物苦味评价表”2中，然后吐出样品，漱口5次，至口腔内无苦味，1-2min后测定下一个样品；此外，对于有色样品，加入柠檬黄，使其颜色一致，减少颜色带来的误差；
表2药物苦味评价表
所得人群口尝结果记录如表3-1、3-2、3-3、3-4、3-5：
盐酸小檗碱经典人群口尝实验的人数结果统计表3-1
苦参碱经典人群口尝实验的人数结果统计表3-2
穿心莲内酯经典人群口尝实验的人数结果统计表3-3
氧化苦参碱经典人群口尝实验的人数结果统计表3-4
槐定碱经典人群口尝实验的人数结果统计表3-5
4、离群值的剔除
对所有志愿者的数据进行统计处理，根据GBT 12315-2008中8.2.1个人表现判定Spearman相关系数的规定对所有志愿者的数据进行统计处理，若对阴性样品的评价仍为“1”，或者违反韦伯-费希纳定律：刺激量与刺激强度成正比的规律，则剔除该志愿者对该组样品的口尝数据。如填入上述各表中。
5、测定苦味单体的分子苦度
对上述5种苦味单体的口尝评价结果进行统计处理，结果表明，5种苦味单体浓度的对数与感知到到苦味的人数比例成正相关关系，与公认生物学中的韦伯-费希纳定律一致；因此，采用“规划求解”对苦味单体感知到苦味的人数比例为0-100％的范围内对不同浓度C下感知苦味的人数比例P0建立威布尔方程(P ＜0.05)及对数方程，如下：
P0＝alnC+b
其中，c表示浓度，a、b、α、β、m、k为待定参数，P0为不同浓度下感知苦味的人数比例。
5种苦味单体浓度的对数与感知到到苦味的人数比例成正相关关系，与公认生物学中的韦伯-费希纳定律一致，
采用Excel中插入散点图建立盐酸小檗碱的对数曲线；采用“规划求解”建立威布尔方程的威布尔曲线如图1、2所示；采用Excel中插入散点图建立苦参碱的对数曲线；采用“规划求解”建立威布尔曲线如图3、4所示；采用Excel中插入散点图建立穿心莲内酯的对数曲线；采用“规划求解”建立威布尔曲线如图5、6所示；采用Excel中插入散点图建立氧化苦参碱的对数曲线；采用“规划求解”建立威布尔曲线如图7、8所示；采用Excel中插入散点图建立槐定碱的对数曲线；采用“规划求解”建立威布尔曲线如图9、10所示；
由上述拟合方程的R2可知，5种苦味物质的威布尔模型均优于对数模型，以BBR为标准苦味物质，因此，采用威布尔方程建立5种苦味物质不同浓度下感知到苦味的人数比例模型。
采用Excel中的“规划求解”建立威布尔曲线和对数曲线，5种苦味单体不同的浓度(c)与感知到苦味的人数比例(P0)(0-100％的范围内)之间的威布尔方程分别如下：
5种苦味单体不同的浓度与感知到苦味的人数比例拟合方程
其中P0代表感知到苦味的人数比例，c代表浓度，e是自然数对，n为样品浓度个数
采用“经典心理物理学最小极限法”令P0等于50％带入上述所建立的威布尔方程，分别得到37℃下标准苦味物质和待测苦味单体样品水溶液的苦度阈值浓度(即为Cs)；以盐酸小檗碱(Berberine，BBR)为标准苦味物质，在BBR 的苦读阈值浓度(BT)(0.0153mM)即为Cr，其分子苦度定为1，带入待测苦味药物的分子苦度(MBs)等于标准苦味物质苦度阈值浓度与待测单体苦度阈值浓度之商再乘以标准苦味物质的分子苦度MBs＝(Cr/Cs)×MBr。
5种苦味单体不同浓度与感知到苦味的人数比例,按照实例所述方法分别计算5种苦味单体的BT浓度及MB，结果见下表。
5种苦味单体的分子苦度及分子苦度指数
由实验结果可知，本申请方法能够感知样品苦味的人数比例与样品的浓度呈威布尔关系，这符合韦伯-费希纳定律(Weber-FechnerLaw，WFL)关于中等强度刺激条件下人类的感官强度与刺激物理量呈对数关系的规律(S＝KlgR)，采用所建立的威布尔方程，能够准确计算出样品溶液的苦度阈值浓度(BT)，基于预测的苦度阈值浓度(BT)，本申请共预测出5苦味单体的分子苦度(MB)。
因此，本发明基于苦味阈值浓度，能够预测单体药物的分子苦度从而测量药物苦味的苦度，取得了准确客观的测量结果，有效解决了药物分子苦度客观、准确、稳定的定量测定，从而实现对药物掩味，利于服用，提供疗效，经济和社会效益显著。