本发明属于组织脱钙
技术领域：
，具体涉及一种鱼类组织病理切片脱钙液。
背景技术：
：鱼类的骨骼是其支持身体，保护柔软器官的主要构造。骨组织是一种坚硬的结蹄组织，由骨细胞和骨基质组成，骨基质内含有大量无机盐，主要是羟磷灰石-磷酸钙和碳酸钙。由于骨组织的硬度大，在切片时极易脱片。因此在切片制作过程中特别是鱼脑、鳃、肌肉组织切片制作中通常会使用脱钙液进行脱钙处理，其作用主要是使结蹄组织膨胀，骨组织软化以方便制作染色切片。目前用于处理鱼类组织的市售脱钙液价格昂贵且脱钙时间长，给很多基础实验造成了经济负担增加了时间成本。约一千克体重的鱼，其鱼头彻底脱钙时间为三天左右，从组织固定到完成切片染色需一周以上，经常延误疾病诊断和治疗。脱钙的化学方法有酸性试剂法、螯合物法、螯离子交换树脂法，还有与物理方法相结合以加快脱钙过程的电解法、微波辐射法等。酸类脱钙是传统的经典脱钙方法，其试剂配置方便，脱钙技术成熟，操作简单，在病理技术应用最为广泛。骨组织中的无机盐在酸性条件下易溶解，常用的市售酸性试剂一般分为无机酸类(硝酸、盐酸、硫酸)和有机酸类(甲酸、乙酸)。强酸能缩短脱钙时间，但时间太短对于不同组织脱钙效果不一致，会造成明显“刀痕”。另外，现有的脱钙液脱钙后组织透明性较差，做成切片后，不能清楚的观察骨组织结构，对病理分析造成巨大困难。技术实现要素：针对上述现有技术，本发明提供一种鱼类组织病理切片脱钙液，以解决现有脱钙液脱钙时间慢以及透明性差的技术问题。为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：提供一种鱼类组织病理切片脱钙液，包括以下组分：甲醛4～5v/v％，甲醇50～60v/v％，甲酸10～15v/v％，盐酸15～20v/v％，组织透明剂5～6v/v％，氯化钠1～2wt％，余量为蒸馏水；其中，组织透明剂包括二甲基亚砜、果糖、碳酸氢钠和十二烷基磺酸钠。在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。进一步，鱼类组织病理切片脱钙液包括以下体积份的组分：甲醛4v/v％，甲醇50v/v％，甲酸15v/v％，盐酸20v/v％，组织透明剂5v/v％，氯化钠1wt％，余量为蒸馏水。进一步，组织透明剂包括：二甲基亚砜50～55v/v％，果糖15～20wt％，碳酸氢钠为1～2wt％，十二烷基磺酸钠的10～15wt％，余量为水。进一步，组织透明剂包括：二甲基亚砜50v/v％，果糖20wt％，碳酸氢钠为1wt％，十二烷基磺酸钠的15wt％，余量为水。本发明的有益效果是：1.本发明的脱钙液中包括强酸盐酸和弱酸甲酸，不仅脱钙效果好，而且不会对组织造成损伤。甲酸是一种有机弱酸，具有一定的固定作用，可以较好地保存染色体结构，清楚地显示细胞核；而且甲酸分子量小，能迅速渗入组织中，并且甲酸酸性较乙酸强，刺激性也小于乙酸；同时，甲酸在冬天不容易结冰，脱钙时对温度要求不高，不容易收环境温度影响。盐酸具有酸性强，可快速溶解骨组织中的盐类，大幅度提高脱钙效率；而且盐酸渗透速度快，还能使组织收缩以抵消甲酸对组织的膨胀影响。甲醛可持续固定组织使组织略微硬化，不仅是优良的固定剂，还可适度保护组织免受酸的侵蚀；甲醇可收缩组织抵消甲酸的过度膨胀；氯化钠作为强电解质可以显著增加溶液离子强度，根据难溶电解质的盐效应，溶液中离子强度的增加可使正负离子结合生成沉淀的机会减小，使难溶电解质的溶解度增加，同时氯化钠还具有降低胶原的酸解程度，保证脱钙骨组织的结构完整性的特点。2.本发明的脱钙液中包含组织透明剂，组织透明剂中包含二甲基亚砜，二甲基亚砜具有极强的渗透性，可携带碳酸氢钠、果糖和十二烷基磺酸钠等组分进入组织，不仅能缩短脱钙时间，而且能带来更好的透明效果。组织透明剂中的果糖和十二烷基磺酸钠可有效保护组织中胶原蛋白的空间结构不受损坏。组织透明剂可使组织内部折射率均一化，降低组织内部散射，使骨组织变得对光透明，制成切片后，可清楚的观察内部结构，对病理分析带来巨大便利。具体实施方式为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实施例仅用于说明发明而不用于限制本发明的范围。选取原材料将暂养鲇鱼按相同方式和部位取其鳃丝，并从颈部剪断，削去脑部颅顶骨使脑组织暴露，剪去下颌和鳃，并沿眼睛下缘去掉鳃盖骨，所有组织在中性福尔马林中固定12小时。脱钙组织固定充分后，取出头部和其鳃组织适当冲洗，称量总体积，记录后拭干放入各个实验瓶中。每瓶放入同一条鱼的所有组织，每组3个重复。放置完后各瓶加入等同于其体积20倍的脱钙液，密封，放置于28℃环境中开始脱钙。充分脱钙后(以刀片能较容易切开为准)，用刀片从头部修下脑组织和眼睛，并取适量鳃和上颌骨一同放入包埋盒中，用流水充分冲洗。本发明设置了八组实施例，每组实施例脱钙方法完全相同，区别在于所用脱钙液不同，每组实施例所用脱钙液配方如表1所示。表1脱钙液配方注：①、②表示不同配方的组织透明剂表2中列出了两种不同配方的组织透明剂。表2组织透明剂的配方二甲基亚砜(ml)果糖(g)碳酸氢钠(g)十二烷基磺酸钠(g)蒸馏水(ml)①20.70.050.82.5②2.510.10.52脱钙完成后，统计脱钙时间并观察脱钙效果，脱钙时间与组织外观表征列于表3。表3各实施例中组织脱钙时间以及外观形态脱钙时间(h)表观实施例一5.5组织颜色正常，透明性较好实施例二5.3组织颜色正常，透明性较好实施例三5.6组织颜色正常，透明性较好实施例四5.1组织颜色正常，透明性较好实施例五6.1组织略微泛白，透明性差实施例六4.9组织颜色正常，透明性较好实施例七2.4组织泛白且收缩严重，透明性差实施例八8.1组织膨胀，透明性好实施例一到实施例三，脱钙液配方适中，脱钙后组织颜色正常，透明性较好，便于内部结构的观察。实施例四与实施例三相比，氯化钠增多，脱钙时间缩短，这是因为氯化钠作为强电解质可以显著增加溶液离子强度，根据难溶电解质的盐效应，溶液中离子强度的增加可使正负离子结合生成沉淀的机会减小，使难溶电解质的溶解度增加，提高脱钙效率。实施例五与实施例二相比缺少组织透明剂，脱钙后，组织略微泛白，透明性差，严重影响内部形态结构的观察。实施例六与实施例二相比，组织透明剂增多，脱钙后，组织形态差别不大，但脱钙时间缩短，这是因为组织透明剂中的二甲基亚砜具有极强的渗透性，可携带碳酸氢钠、果糖和十二烷基磺酸钠等组分进入组织，缩短脱钙时间。实施例七与实施例二相比，全部采用强酸，虽然可大幅度缩短脱钙时间，但脱钙后组织泛白且收缩严重，即使有组织透明剂的存在，组织透明性也较差，因此，不适合全部采用强酸进行脱钙，会对组织产生严重的破坏，影响结构的观察。实施例八与实施例二相比，全部采用弱酸，脱钙后组织膨胀严重，虽然透明性没有受到影响，但是内部结构会受到严重破坏，也会影响结构的观察。当前第1页12