一种通用性免疫层析试纸的制作方法

本发明涉及一种侧向层析免疫检测试纸，具体涉及一种通用性免疫层析试纸，属于生物医学技术领域。

背景技术：

基于色谱分离原理的小分子免疫层析试纸，其检测原理多是将待测物特异性抗体预先固定到试纸测定区。在毛细管作用下，样品中的待测小分子与金标垫上的金标抗体流动到测定区位置，金标抗体与固定化抗体竞争结合溶液中小分子。测定区显色强度或者信号强度与待测小分子含量呈反比。

由于测定迅速、信号响应直观、成本低廉，易于现场使用，层析检测法在食品安全、临床医疗等多个领域已经得到越来越广泛的应用。目前市场上存在的侧向层析检测试纸以胶体金为主要载体，通过肉眼判断测定结果。但是，该类试纸技术上存在一定的不足：1、待测物抗体固定化不利于竞争结合反应充分进行，限制了检测灵敏度。2、另一方面，同一待测指标或不同待测指标，不同试纸测定结果受检测区固定化抗体来源、浓度影响很大，结果可比性差。

技术实现要素：

本发明针对上述现有侧向层析产品的不足，公开了一种通用性免疫层析试纸，目的是同时实现信号响应的灵敏度与可比性的提高。为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

通用性免疫层析试纸的结构和用途，该检测试纸由底板、样品垫、结合垫1、结合垫2、反应膜、测定线、质控线、吸水纸垫组成。所述结合垫1含有标记的待测物(以下简称t)分子抗体(以下简称为物质a)；所述结合垫2含有可识别测定区固定化元件的物质与t的复合物(以下简称为物质b)；测定线与质控线位于反应膜上，与试纸长轴垂直分布，检测区包被可识别物质b的识别元件c，质控区包被可识别物质a的识别元件d。

所述物质a的制备，通过蛋白与标记分子的理化反应实现；所述物质b可以通过t分子化学基团改造后与测定线识别元件偶联，也可以直接与测定线识别元件偶联，也可以通过双功能分子实现与测定线识别元件偶联；所述标记分子可以是胶体金，也可以是荧光染料、拉曼分子、上转化粒子等；所述化学基团改造可以是羧基化，也可以是氨基化、羟基化、羰基化等，依据具体待测小分子理化特性不同而不同；所述双功能分子，通常是含有两个羧基的分子，也可以是含有两个氨基的分子，也可是羧基氨基各含有一个的分子等；所述可识别物质b的识别元件c，是一种通用型识别元件，可以是抗原/抗体，也可以是生物素/亲和素、受体/配体、金黄色葡萄球菌蛋白a(spa)、链球菌蛋白g(spg)等之一，与物质b的识别不因t种类的改变而改变；所述识别元件d可实现对物质a的识别，是一种通用型识别元件，可以是抗原/抗体，也可以是生物素/亲和素、受体/配体、金黄色葡萄球菌蛋白a、链球菌蛋白g等之一，与物质a的识别不因t种类的改变而改变；

进一步地，随着层析过程的进行，依次发生下列反应：

1)溶液中待测物(以下简称为t)与物质b竞争结合溶液中一定含量的物质a，形成“t+a”与“a+b”两种物质的混合物；t含量越多，形成的“t+a”含量越多于“a+b”；

2)检测区识别元件c通过对b的识别形成物质“a+b+c”并固定于检测区；

3)质控区识别元件d通过对a的识别形成物质“t+a+d”与“d+a+b”，并固定于质控区；

由于物质a含有标记物，a含量的多少决定信号响应的强度，而检测区a信号的强度与t含量呈反比，质控区a信号的强度与t含量呈正比。因此，可以通过对比检测区与质控区信号的相对强度判断t的含量。

相比在测定区固定化抗体与t及标记t竞争结合反应，本专利中竞争结合反应在层析溶液向t测定区层析时已经在进行，具有更加充分的反应时间。另一方面，抗体在溶液中而固定化，可以更充分的暴露表面抗原，竞争反应可以更充分的进行。更充足的反应时间与更充分的表位暴露，使得该竞争结合反应灵敏度更高。另一方面，检测区与质控区固定的是通用性识别元件，不因待测物的改变而改变，不同层析试纸的测定区物质成份完全一致，层析反应后信号可比性强。因此，该层析试纸的设计，将免疫反应的灵敏度、特异性与通用性有机的进行了融合。

所述底板为不吸水材料，pvc或其它硬质材料；所述样品垫为吸滤纸；所述吸水纸垫为吸水纸。

本发明所述一种通用性免疫层析试纸通过检测区固定通用性识别元件，以及参与竞争结合反应的元件均在溶液中进行反应，不仅提高信号可比性，同时使得竞争反应进行更充分，测定灵敏度更高。

本发明可用于食品安全、临床诊断、检验检疫等诸多领域，具有广阔的市场前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，根据这些附图获得的其它附图都属于本发明保护的范围。

图1为本发明所述的一种通用性免疫层析试纸原理图

附图中，各标号所代表的材料列表如下：1、底板1；2、样品垫；3、结合垫1；4、结合垫2；5反应膜；6、测定线；7、质控线；8、吸水纸垫；

具体实施方式

下面将对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1所述一种一种通用性免疫层析试纸的制备方法

试纸条的制备(以检测雌二醇为例)

试纸条的制备方法主要包括以下步骤：

1)制备检测区包被亲和素、质控区包被spg的反应膜，包被过程：用0.01mol/lph7.4的磷酸盐缓冲液分别将亲和素、spg稀释到1mg/ml，用isoflow点膜仪将其分别包被于硝酸纤维膜上的检测区、质控区，包被量为1.0μl/cm；将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥16h，备用。

2)通过物理吸附作用制备含有雌二醇抗体与胶体金复合物并制备成结合垫1；

所述胶体金制备采用柠檬酸钠还原法。胶体金与雌二醇抗体的结合通过物理吸附的作用实现。所述结合垫制备方法如下：雌二醇抗体与胶体金复合物喷涂于结合垫，室温下干燥15min，37℃条件下干燥20min，放入冷冻干燥机中，在冷阱温度为-50℃条件下，预冻3h，再真空干燥15h，即可取出，将得到的结合垫1放入塑封袋，加入干燥机，密封保存。

3)通过二胺法制备含有雌二醇与生物素复合物并制备成结合垫2；

所述羧基化雌二醇与羧基化生物素均为商品化产品，二者通过己二胺经活性酯法在低温条件下分步偶联制得。所述结合垫2制备方法如下：雌二醇与生物素的复合物喷涂于结合垫，室温下干燥15min，37℃条件下干燥20min，放入冷冻干燥机中，在冷阱温度为-50℃条件下，预冻3h，再真空干燥15h，即可取出，将得到的结合垫1放入塑封袋，加入干燥机，密封保存。

4)在底板上依次组装反应膜、结合垫、样品垫、吸水纸垫制备成试纸条；在2～8℃的环境中储存，有效期12个月。

所述样品垫制备方法如下：将样品吸收垫置于含卵清蛋白0.5％的0.01mol/lph7.2的磷酸盐缓冲液中浸泡2h，37℃烘2h备用。室温条件下，干燥保存。

实施例2，乳品中雌二醇的检测

所需材料：①针对雌二醇的一种通用性免疫层析试纸(自备)；②雌二醇加标纯牛奶1份(自备)

操作步骤：①试纸平衡至室温；②雌二醇加标的纯牛奶混匀滴加到样品垫；③恒温条件下等待5min；在毛细管作用下，溶液中雌二醇及从结合垫上溶解的雌二醇-生物素复合物与金标记雌二醇抗体竞争结合生成雌二醇与金标雌二醇抗体复合物以及雌二醇-生物素复合物与金标雌二醇抗体的复合物；溶液经过反应膜测定区时，雌二醇-生物素复合物与金标雌二醇抗体的复合物与测定区固定化亲和素相结合；经过质控区时，雌二醇与金标雌二醇抗体复合物与质控区固定化spg相结合；④根据测定区与质控区显色条带的相对信号强度进行可视化判读结果，分析记录结果。

分析检测结果

阳性：当质控区显示条带，检测区不显色或显色明显弱于质控区，判为阳性，用“+”表示。

阴性：当质控区和检测区均显示出条带且颜色强度接近，判为阴性，用“-”表示。

无效：当质控区不显示条带，试纸失效。

定量：依据质控区与检测区信号相对强度，精确测定待测物含量。

以上实施例对本发明所提供的通用性免疫层析试纸制备和一种检测雌二醇的方法进行了详细介绍。本发明所述通用性免疫层析试纸主要针对激素、抗生素、农药等小分子，可用于食品安全、临床诊断等领域。

本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。