本发明涉及荧光检测领域，尤其涉及一种荧光氧探针及其制备方法和用途。
背景技术：
氧气是生活中不可或缺的物质，与人类的生命生活息息相关，如何快速、准确地检测氧气浓度，在渔业、食品安全、环境检测、生物医药等方面具有重大意义。
目前为止，检测氧气浓度的方法很多，具体的检测方法如化学滴定检测、电化学检测、荧光法检测等，传统的化学滴定法检测的准确度最高，但是，传统的化学滴定法需要配置标准浓度溶液，步骤繁琐、耗时较长、操作复杂，仅适用于某些精密测试，电化学检测法通过检测氧气在阳极还原电位，从而得到氧气浓度，在检测溶解氧中有着良好的应用，但是其电流容易受到电磁干扰等诸多因素影响，检测结果具有一定的偶然误差，而且，受限于设备体积问题，该方法不能应用于某些狭小区域，荧光检测法是一种新兴的检测法，由于其具有高效、选择性好、检测方便、响应时间短等诸多优点，受到分析化学、生物分析化学、环境科学等领域的亲睐。
荧光检测法通常需要荧光探针的参与，当荧光探针与待测样品结合时，其荧光强度或荧光发射峰需要产生较大幅度变化，且变化能够被荧光检测器检测到，但是现有技术中采用荧光检测法检测氧气浓度通常面临一个问题，即大部分能够作为荧光探针检测氧气的荧光物质稳定性比较差，容易出现光漂白现象，导致荧光效率下降，对检测结果造成很大的偏差，而且，由于各型荧光光谱仪的荧光强度单位不统一，使得荧光探针通常仅能与特定型号的荧光光谱仪配套使用，当更换仪器时，对荧光探针重新进行校准会产生一定的误差，需要重新作出标准曲线才能进行使用，上述缺点限定了荧光检测法的进一步推广。
因此，在现有技术的基础上，本领域的技术人员需要研究一种新的用于氧气检测的具有自参比能力的荧光探针，自参比能力即在使用不同型号的荧光光谱仪进行检测时无需校准操作，能够自行校准,而且，该荧光探针需要具有较高的荧光稳定性和酸碱稳定性，能够适用于多种检测环境。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种荧光氧探针，所述荧光氧探针包括共聚有参比探针化合物的聚合物微球以及均匀分散在共聚有参比探针化合物的聚合物微球中的荧光氧探针化合物。
相比于仅含有荧光氧探针化合物的荧光氧探针，在荧光氧探针中添加参比探针化合物利用了参比探针化合物的氧惰性，在所述荧光氧探针的荧光发射谱图上，参比探针化合物的荧光发射峰与荧光氧探针化合物的发射峰之间能够显著区别，以不受氧气浓度影响的参比探针化合物的荧光发射峰强度为基准，荧光氧探针化合物的荧光发射峰强度与参比探针化合物的荧光发射峰强度之比能够随着氧浓度变化，使得所述荧光氧探针具有无需校准即可实现自参比的能力。
通过将参比探针化合物以共聚物的形式掺入至所述聚合物微球中，能够固定所述荧光氧探针中参比探针化合物的重量分数，使得参比探针化合物的荧光发射峰强度与荧光氧探针化合物的荧光发射峰强度之间具有定量关系，使得所述荧光氧探针能够稳定长期存放，同时降低其检测误差，同时，以微球的形式将参比探针化合物和荧光氧探针化合物相结合也能够防止参比探针和荧光氧探针化合物的代谢分解，赋予了所述荧光氧探针动态检测生物体内、含有微生物的水体等动态环境中的氧浓度的能力。
优选地，所述参比探针化合物为对氧气浓度变化不敏感的荧光化合物中的任意一种，所述对氧气浓度变化不敏感的荧光化合物为荧光吸收峰、发射峰和荧光强度不受氧气浓度影响的具有荧光效应的化合物。
优选地，所述参比探针化合物为修饰有一个双键的荧光发射峰不受氧气浓度影响的荧光化合物中的任意一种。
优选地，所述参比探针化合物为修饰有一个双键的如下种类的化合物中的任意一种：罗丹明类化合物、香豆素类化合物、奎宁类化合物、硫氰酸类化合物、镧系金属类化合物，进一步优选为修饰有一个双键的罗丹明类化合物。
优选地，所述修饰有一个双键的罗丹明类化合物为丙烯酸罗丹明酯中的任意一种。
优选地，所述丙烯酸罗丹明酯为丙烯酸罗丹明b酯，其结构式为：
优选地，所述荧光氧探针化合物为卟啉类化合物或稀土金属类化合物中的任意一种。
优选地，所述荧光氧探针化合物为八乙基卟吩铂，其结构式为：
优选地，所述聚合物微球通过对参比探针化合物和聚合单体进行自由基共聚得到。
优选地，所述聚合单体包括苯乙烯、甲基丙烯酸酯或丙烯酸酯中的任意一种或至少两种的混合物。
优选地，所述共聚有参比探针化合物的聚合物微球中的聚合物与参比探针化合物的质量比为1000:(1～50)，例如为1000:2、1000:4、1000:10、1000:20、1000:30、1000:35、1000:40、1000:45、1000:48等。
优选地，所述共聚有参比探针化合物的聚合物微球与荧光氧探针化合物的质量比为1000:(1～200)，例如为1000:2、1000:10、1000:40、1000:60、1000:100、1000:140、1000:160、1000:180、1000:196等。
优选地，所述共聚有参比探针化合物的聚合物微球的粒径为0.1～20μm，例如为0.2μm、0.5μm、1μm、2μm、4μm、8μm、12μm、16μm、19μm等。
本发明的目的之二在于提供一种所述荧光氧探针的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
步骤(1)，将分散剂溶于水-醇混合液(即水与甲醇、乙醇、丙醇等任意一种易溶于水的醇类以任意比例组成的混合液)中，加入聚合物的聚合单体、引发剂溶液，搅拌进行聚合反应，待聚合反应进行至反应溶液由澄清转为乳白色时，向其中加入参比探针化合物溶液继续共聚反应，共聚反应开始后的1～2h内，向反应溶液中加入荧光氧探针化合物溶液，继续进行共聚反应；
步骤(2)，待反应完成后将反应溶液冷却、抽滤，滤液离心，去除上清液后干燥，得到所述荧光氧探针。
其中，步骤(1)中需要在共聚反应开始后1～2h内向反应溶液中加入荧光氧探针化合物溶液，间隔过长微球结构形成，使得荧光氧探针化合物无法均匀分散在微球内部，间隔过短容易终止反应，使得微球结构不能形成。
本领域的技术人员可以选用任意一种不影响反应进行的悬浮聚合用表面活性剂作为分散剂，优选地，步骤(1)中所述的分散剂为水溶性聚合物、烷基磺酸盐、烷基苯磺酸盐或烷基磺酸琥珀酸盐中的任意一种或至少两种的混合物。
优选地，所述水溶性聚合物为聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚醚或聚乙二醇中的任意一种或至少两种的混合物。
优选地，所述的水溶性聚合物的重均分子量为10～100kda，例如11kda、15kda、20kda、40kda、60kda、80kda、90kda、95kda、98kda等。
优选地，步骤(1)中所述的分散剂与聚合单体的重量比为1:(10～200)，例如1:11、1:15、1:20、1:30、1:50、1:90、1:140、1:160、1:180、1:195等。
优选地，步骤(1)中所述的引发剂与聚合单体的重量比为(1～30):1000，例如1:1000、41000、6:1000、10:1000、14:1000、18:1000、22:1000、26:1000、29:1000等。
优选地，步骤(1)中所述的引发剂溶液的溶剂为乙醇、甲醇、乙醚、甲苯或n，n-二甲基甲酰胺中的任意一种或至少两种的混合物。
优选地，步骤(1)中所述的引发剂为偶氮类引发剂或过氧化物类引发剂中的任意一种。
优选地，步骤(1)中所述的参比探针化合物溶液的溶剂为乙醇、甲醇、乙醚、甲苯或n，n-二甲基甲酰胺中的任意一种或至少两种的混合物。
优选地，步骤(1)中所述的聚合反应和共聚反应的温度为60～80℃，例如为62℃、64℃、66℃、69℃、72℃、75℃、77℃、79℃等。
优选地，步骤(1)中所述的搅拌的转速为300～800转/min，例如为310转/min、350转/min、400转/min、450转/min、550转/min、650转/min、700转/min、750转/min、790转/min等。
优选地，步骤(1)中所述的荧光探针化合物溶液的溶剂为乙醇和苯乙烯中的混合物。
优选地，步骤(1)中所述的共聚反应的反应时间为10～38h，例如为11h、13h、15h、19h、22h、25h、28h、32h、35h、37h等。
本发明的目的之三在于提供一种所述荧光氧探针的用途，所述荧光氧探针能够用于对氧气的浓度进行定量的荧光检测。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种创造性的制备方法，得到了一种新型的荧光氧探针，通过将参比探针化合物与聚合单体共聚，制备分散有荧光氧探针化合物的微球，该微球能够作为荧光氧探针使用，而且具有自参比效果，避免了传统荧光检测中更换检测设备需要对荧光探针重新校准的问题，而且，本发明所制备的荧光氧探针在使用时对于检测环境要求不高，适用于含有微生物的水体等动态生物环境中溶解氧浓度的检测，检测结果相较于传统电化学检测设备的检测结果误差≤5％。
附图说明
图1为实施例1得到的荧光氧探针1的扫描电镜照片。
图2为实施例1得到的荧光氧探针1在氧浓度分别为0％、20％、100％时其中的参比探针化合物和荧光氧探针化合物在荧光发射峰处的荧光强度的变化。
图3为实施例1得到的荧光氧探针1和对照例1得到的荧光氧探针7中的荧光氧探针化合物的荧光发射峰强随着波长为535nm的光线光照时间的变化曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
通过如下步骤制备荧光氧探针1：
参比探针化合物丙烯酸罗丹明b酯的合成：将400mg罗丹明b与261mg三乙胺溶解于20ml的四氢呋喃中，得到罗丹明b溶液，之后将2ml溶解有135mg甲基丙烯酰胺的四氢呋喃在0～5℃的冰浴下缓慢滴入罗丹明b溶液中，室温下搅拌过夜进行反应，反应结束后将产物倾倒至过量水中，用二氯甲烷萃取，得到有机相，有机相用纯水洗三次，无水mgso4干燥得到粗产品，粗产品通过硅胶柱层析，以体积比为95:5的二氯甲烷和甲醇作为洗脱剂层析分离，得到300mg深红色粘稠状物质，即为所述丙烯酸罗丹明b酯，反应产率为70.10％。
所述丙烯酸罗丹明b酯的氢原子核磁共振谱(1hnmr)数据如下：1hnmr(d，ppm，cdcl3)：7.63(m，3h)，7.38(d，1h)，6.96(m，6h)，5.64(s，1h)，5.38(s，1h)，4.92(s，2h)，3.60(m，8h)，1.96(s，3h)，1.16(t，12h)，证明已经成功获得了目标产物丙烯酸罗丹明b酯。
步骤(1)，将0.5g重均分子量为10kda的分散剂聚乙烯吡咯烷酮溶于10ml水-乙醇(其中水和乙醇的体积比为1:1)混合液中，搅拌混合均匀后加入5g聚合单体苯乙烯，升温至50℃后通氮气除氧，加入30ml含有150mg偶氮二异丁腈的乙醇溶液，继续升温至62℃，以300转/min的转速搅拌反应溶液进行聚合反应，待聚合反应进行至反应溶液由澄清转为乳白色时，保持反应条件不变，向其中加入含有5mg参比探针化合物丙烯酸罗丹明b酯乙醇溶液进行共聚反应，共聚反应开始后的1.5h后，向反应溶液中加入含有5mg荧光氧探针化合物八乙基卟吩铂的乙醇-苯乙烯溶液(其中乙醇和苯乙烯的体积比为2:1)，继续进行共聚反应36h；
步骤(2)，待反应完成后将反应溶液冷却至室温、抽滤，滤液置于离心机中以5000转/min的转速离心，离心后去除上清液，剩余固体物质干燥，得到所述荧光氧探针1。
实施例2
通过如下步骤制备荧光氧探针2：
与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中的参比探针化合物选用丙烯酸(7-羟基香豆素)酯，参比探针化合物加入量为250mg，参比探针化合物的溶剂选用n，n-二甲基甲酰胺。
实施例2得到荧光氧探针2。
实施例3
通过如下步骤制备荧光氧探针3：
与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中的荧光氧探针化合物选用三(1,10-邻菲罗啉)钌(ⅱ)，且荧光氧探针化合物加入量为1g。
实施例3得到荧光氧探针3。
实施例4
通过如下步骤制备荧光氧探针4：
与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中的分散剂选用对十二烷基苯磺酸钠，且分散剂的加入量为25mg。
实施例4得到荧光氧探针4。
实施例5
通过如下步骤制备荧光氧探针5：
与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中的分散剂选用重均分子量为100kda的聚乙二醇。
实施例5得到荧光氧探针5。
实施例6
通过如下步骤制备荧光氧探针6：
与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中的引发剂选用过氧化二苯甲酰，引发剂的加入量为5mg，聚合反应的温度为80℃，搅拌的转速为800转/min，共聚反应的时间为12h。
实施例6得到荧光氧探针6。
对照例1
通过如下步骤制备荧光氧探针7：
将5mg参比探针化合物丙烯酸罗丹明b酯与5mg荧光氧探针化合物八乙基卟吩铂溶于10ml乙醇中，混合均匀，40℃下真空干燥除去乙醇，得到的固体混合物即为荧光氧探针7。
对照例2
通过如下步骤制备荧光氧探针8：
与实施例1的不同之处仅在于，加入的参比探针化合物为未经修饰的罗丹明b。
对照例2得到荧光氧探针8。
对照例3
通过如下步骤制备荧光氧探针9：
与实施例1的不同之处仅在于，步骤(1)中在共聚反应开始之后立刻向反应溶液中加入荧光氧探针化合物。
对照例3得到荧光氧探针9。
对照例4
通过如下步骤制备荧光氧探针10：
与实施例1的不同之处仅在于，步骤(1)中在共聚反应开始4h后再向反应溶液中加入荧光氧探针化合物。
对照例4得到荧光氧探针10。
通过如下测试对各实施例和对照例中得到的荧光氧探针1～10进行表征测试，测试结果列于表1。
(1)形貌表征
将荧光氧探针1～10配置成浓度为0.1mg/ml的乙醇分散液，滴在铜网上，自然风干，通过tescanmira3型扫描电子显微镜观察其形貌和平均粒径，其中，扫描电镜的测试参数为：电压30kv，放大倍率35000000倍。
(2)荧光强度随溶解氧浓度的变化测试
将荧光氧探针1～10配置成浓度为1mg/ml的乙醇分散液，置于ls-55型荧光光谱仪中，对其荧光强度进行测试，在仪器内部分别通入氧浓度为0～100％(v/v)的氮氧混合气体，观察参比探针化合物和荧光氧探针化合物在荧光发射峰处的荧光强度随溶解氧浓度的变化，并研究其变化规律，计算出荧光强度之比与溶解氧浓度的标准曲线，其中，荧光光谱仪的狭缝宽度设置为3nm。
(3)光稳定性测试
将荧光氧探针1～10配置成浓度为1mg/ml的乙醇分散液，置于ls-55型荧光光谱仪中，分别测试样品在未经光照条件下和经过5400s波长为荧光氧探针化合物激发波长的光线照射下，荧光氧探针化合物在荧光发射峰处的荧光强度变化，观察其荧光强度的下降程度，其中，荧光光谱仪的狭缝宽度设置为3nm。
(4)动态生物环境稳定性测试
分别将荧光氧探针1～10与含有大肠杆菌的溶液混合，配成浓度为0.25mg/ml的分散液，分别测试样品在不存在大肠杆菌和与大肠杆菌混合4800s后的荧光强度变化，观察其荧光强度的下降程度，荧光测试条件与荧光稳定性测试中所述的测试条件相同。
(5)电化学传感器对照试验
分别各取1ml荧光氧探针1～10配置成浓度为2mg/ml的乙醇分散液，各与1ml取自同一地点的湖水混合均匀，通过荧光强度随溶解氧浓度的变化测试中所述的测试方法和测试参数分别得到荧光氧探针1～10中的参比探针化合物和荧光氧探针化合物在荧光发射峰处的荧光强度之比，利用荧光强度随溶解氧浓度的变化测试中得到的标准曲线计算湖水中溶解氧的浓度，计算结果与奥利龙公司生产的vd-01型电化学溶解氧浓度传感器得到的数值进行比较，计算检测误差。
表1荧光氧探针1～10性能指标比较
表1中“-”代表无法得到该数值。
以实施例1中得到的荧光氧探针1为例，图1为其扫描电镜图像，从中可以看出其形貌规整且粒径均匀。
图2为荧光氧探针1在氧浓度分别为0％、20％、100％时参比探针化合物和荧光氧探针化合物在荧光发射峰处的荧光强度的变化，可以看出，参比探针化合物的荧光发射峰强度不受氧浓度的影响，而荧光氧探针化合物的荧光发射峰强度受氧浓度变化的影响明显，二者之比与氧浓度的关系符合stern-volmer(斯特林-沃尔姆)动态猝灭曲线，相关系数≥0.988。
图3为实施例1中得到的荧光氧探针1和对照例1中得到的荧光氧探针7中的荧光氧探针化合物的荧光发射峰强随着波长为535nm的光线光照时间的变化曲线，可以看出，失去了聚合物微球的保护，荧光氧探针7中的荧光氧探针化合物的光稳定性很差，在长时间光照下荧光强度下降率达到23％，能够带来极大的检测误差，因此不适用于作为荧光氧探针使用。
综上所述，本发明提供了一种创造性的制备方法，得到了一种新型的荧光氧探针，通过将参比探针化合物与聚合单体共聚，制备分散有荧光氧探针化合物的微球，该微球能够作为荧光氧探针使用，而且具有自参比效果，避免了传统荧光检测中更换检测设备需要对荧光探针重新校准的问题，而且，本发明所制备的荧光氧探针在使用时对于检测环境要求不高，适用于含有微生物的水体等动态生物环境中溶解氧浓度的检测，检测结果相较于传统电化学检测设备的检测结果误差≤5％。
本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。