一种盐酸帕洛诺司琼注射液有关物质的检测方法与流程

本发明涉及分析化学领域，具体涉及一种盐酸帕洛诺司琼注射液中有关物质的检测方法。

背景技术：

盐酸帕洛诺司琼为亲和力较强的5-ht3受体选择性拮抗型止吐剂，用于预防高度致吐化疗引起的急性恶心、呕吐(cinv)及预防中度致吐化疗引起的恶心、呕吐。是首个也是目前唯一一个批准的可用的5-ht3受体拮抗剂。美国综合癌症网络的临床指南已推举盐酸帕洛诺司琼注射液作为首选药物。盐酸帕洛诺司琼化学名称为：2-[1-氮杂双环(2.2.2)辛-3s-基]-2,3,3as,4,5,6-六氢-1h-苯并[de]异喹啉-1-酮盐酸盐，其结构式为：

分子式为：c19h24n2o.hcl，分子量为：332.87。

盐酸帕洛诺司琼注射液常见规格为5ml：0.25mg，活性物质浓度低，辅料量大，使用目前通用技术手段测定该浓度注射液的有关物质尤其对映异构体限度灵敏度难以实现。目前传统方法使用旋转蒸发和干燥蒸发的方法进行浓缩。旋转蒸发存在操作耗时长，使用溶剂量大，多次有机溶剂提取富集对人员操作要求高，使用大量有机溶剂对环境不友好，同时，旋转蒸发前需要使用溶剂进行多次萃取，对于样品中脂溶性和水溶性的杂质无法实现一次提取检测。干燥蒸发存在蒸发时间长，蒸发后仍然存在大量辅料影响测定的问题。

而usp39药典方法中，进样浓度为0.7mg/ml，大大高于盐酸帕洛诺司琼注射液(1.5ml：0.075mg、5ml：0.25mg)的浓度(0.05mg/ml)，因此不适用于盐酸帕洛诺司琼注射液的有关物质检测。专利cn104764840a公开了杂质a、b、c、d的分离方法，但未涉及到对映异构体，没有达到一次分离的效果，专利cn102207494b仅报道了盐酸帕洛诺司琼与对映异构体、非对映异构体的分离方法，未涉及杂质a、b、e。因此，目前尚无一种能同时完全分离盐酸帕洛诺司琼注射液有关杂质的方法报道，故开发一种一次性分离，耗时较短，有机溶剂用量少，且重现性和耐用性较好的方法成为了必要。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决以上现有技术的不足而提供一种盐酸帕洛诺司琼注射液有关物质的检测方法。

本发明的技术方案为：

一种盐酸帕洛诺司琼注射液有关物质的检测方法，采用固相萃取小柱富集盐酸帕洛诺司琼注射液，洗脱，再进行液相色谱分析，液相色谱条件为：

色谱柱：填充剂为键合万古霉素；

检测波长：235～245nm；

柱温：30～40℃；

流速：1.4～1.6ml/min；

流动相：乙酸铵溶液与四氢呋喃混合溶液。

所述有关物质为杂质a、杂质b、杂质c、杂质d、杂质e及对应异构体中的一种或几种，其中杂质a、b、c、d、e及对映异构体的分子式如下所示：

所述固相萃取小柱的填充剂是c8。

控制固相萃取小柱富集盐酸帕洛诺司琼注射液的流速为0.6～6ml/min；优选流速为0.75～1.5ml/min。

示例性地，将10～20ml盐酸帕洛诺司琼注射液分次加入固相萃取小柱富集，流速为0.6～1ml/min。

所述洗脱的洗脱剂为甲醇、乙醇、丙酮、水、三氟乙酸缓冲液、磷酸盐缓冲液中的一种或几种。

示例性地，盐酸帕洛诺司琼注射液富集后洗脱，使用洗脱剂的体积为0.5～2ml；优选用0.8～1.2ml乙醇洗脱；更优选用1.0ml乙醇洗脱。

色谱流动相中乙酸铵溶液浓度为15～25mmol/l，优选乙酸铵溶液浓度为20mmol/l；乙酸铵溶液ph为5.0～7.0，优选乙酸铵溶液ph为6.0；乙酸铵溶液占流动相混合溶液体积百分比为85％～95％，优选乙酸铵溶液占流动相混合溶液体积百分比为92％。

优选的，所述的色谱条件为：

色谱柱：填充剂为键合万古霉素；

检测波长：238nm；

柱温：35℃；

流速：1.5ml/min；

流动相：乙酸铵溶液与四氢呋喃混合溶液。

具体的，本发明提供了一种盐酸帕洛诺司琼注射液有关物质的检测方法，还包括以下一个或多个步骤：

固相萃取小柱预处理；

盐酸帕洛诺司琼注射液预处理；

固相萃取小柱洗脱前处理；

收集洗脱液进行后处理。

所述固相萃取小柱的填充剂是c8。优选的固相萃取小柱为buldelut-c8。

所述的固相萃取小柱预处理包括：使用前将固相萃取柱用1～2倍柱体积的溶剂i活化，再用1～2倍柱体积水或质量百分含量为70％～90％的乙醇清洗。

所述溶剂i为甲醇、乙醇、乙腈、丙酮或异丙醇中的一种或几种。

示例性地，固相萃取小柱使用前用1～2倍柱体积的乙腈活化，再用1.5倍柱体积水清洗小柱。

所述的盐酸帕洛诺司琼注射液预处理包括：用ph调节剂将盐酸帕洛诺司琼注射液ph调节至碱性；优选ph调节至9～12；更优选ph调节至10.5～12.0。

所述的ph调节剂为磷酸盐、柠檬酸盐、氢氧化钠或氨水；优选氢氧化钠。

示例性地，所述ph调节剂为1mol/l的氢氧化钠溶液。

所述的固相萃取小柱洗脱前处理包括：先用水清洗固相萃取小柱，再用溶剂ii处理固相萃取小柱，所述溶剂ii为甲醇、乙腈、丙酮、水、三氟乙酸、20～30mmol/l磷酸盐缓冲液、20～30mmol/l醋酸盐缓冲液中的一种或几种。

优选的溶剂ii为乙腈、水、三氟乙酸的混合物，其中乙腈、水、三氟乙酸的体积比为(220～300)：(700～780)：(0.5～1.0)。

示例性地，固相萃取小柱洗脱前处理包括：用1.0～2.0ml水清洗小柱，再用0.8～1.2ml溶剂ii处理固相萃取小柱；溶剂ii优选乙腈、水、三氟乙酸的混合物，其中乙腈、水、三氟乙酸的体积比为250：750：0.5或220：780：1.0或280：720：0.7。

收集洗脱液进行后处理包括：将洗脱液与溶剂iii混匀后冷却过滤，所述溶剂iii为甲醇、乙醇、丙酮、无水乙醇、乙腈、水、15～25mmol/l乙酸铵溶液、三氟乙酸、20～30mmol/l磷酸盐缓冲液中的一种或几种。

示例性地，收集洗脱液后处理：将洗脱液与等体积的20mmol/l乙酸铵溶液(溶剂iii)混匀，于4度冰箱冷藏10min，滤膜过滤。

本发明检测方法的原理：固相萃取小柱对盐酸帕洛诺司琼及待测有关物质进行富集，去除注射液中绝大部分辅料后，用适量溶剂洗脱待测物质，收集洗脱液处理后hplc测定，从而达到浓缩后提高检测灵敏度的效果。

有益效果：

1、本发明方法富集的盐酸帕洛诺司琼有关物质可以浓缩10倍以上，可以准确的检测有关物质，解决了供试液浓度低，hplc检测灵敏度不够的问题；

2、本发明通过固相萃取小柱富集盐酸帕洛诺司琼注射液，使用溶剂量小，对人体和环境友好，同时可去除辅料影响，可实现样品中脂溶性和水溶性的杂质的一次性提取检测；

3、本发明方法耗时短、灵敏度高、操作简便、结果准确，同样适用于该类低规格产品有关物质的分析测定。

附图说明

图1为系统适用性色谱图；编号1～7的色谱峰保留时间分别为16.442、21.858、45.772、57.602、60.327、67.477、77.017分钟，相对峰面积分别为0.35％、0.64％、97.06％、0.17％、0.26％、0.35％、1.17％，分别代表杂质a、杂质b、盐酸帕洛诺司琼、杂质c、杂质d、对映异构体、杂质e。

图2为各杂质及对映异构体和盐酸帕洛诺司琼定量限色谱图，其中各杂质及对映异构体浓度相对于供试液主峰浓度的0.05％；编号1～7的色谱峰保留时间分别为10.940、14.397、33.372、36.000、39.228、42.997、48.268分钟，相对峰面积分别为8.85％、23.70％、12.10％、11.13％、7.94％、9.62％、26.67％，分别代表杂质a、杂质b、盐酸帕洛诺司琼、杂质c、杂质d、对映异构体、杂质e。

具体实施方式

以下实施例是对本发明进行的进一步的阐述，而不是对本发明保护范围的限制。如无特别说明，所用的原料和试剂均为普通市售产品，所采取的方法和操作方式均为本领域常规方式。

固相萃取小柱(agilenttechnologies)，partno:12102026，buldelut-c8，200mg3ml(柱体积)；盐酸帕洛诺司琼注射液(江苏奥赛康药业股份有限公司)；hplc色谱柱(sigma-aldrich)，astecvcat#:11024ast25cm×4.6mm，5μm。

实施例1

本实施例采用如下具体步骤：

(1)固相萃取小柱预处理：3ml溶剂i(乙腈)加入小柱后，再将3ml水加入小柱清洗，控制流速为1.5ml/min。

(2)盐酸帕洛诺司琼注射液预处理：向待测溶液按限度浓度(杂质a和杂质b的质量百分含量为0.1％，杂质c、d、e和对映异构体的质量百分含量为0.5％)加入杂质a、b、c、d、e和对映异构体后，用1mol/lnaoh调节ph至11.0，作为供试液。

(3)盐酸帕洛诺司琼注射液经固相萃取小柱富集：精密移取15ml供试液，分次加入小柱，流速为1.5ml/min。

(4)固相萃取小柱洗脱前处理：固相萃取小柱富集供试品后，精密量取1.5ml水加入小柱，精密移取1.0ml溶剂ii(乙腈、水、三氟乙酸的体积比为250：750：0.5)加入小柱，流速为1.5ml/min。

(5)盐酸帕洛诺司琼注射液浓缩后洗脱：精密移取无水乙醇1.0ml加入小柱洗脱盐酸帕洛诺司琼有关物质，1.0ml量瓶收集洗脱液后，加无水乙醇定容至刻度。

(6)收集洗脱液与等体积溶剂iii(20mmol/l乙酸铵水溶液，冰乙酸调ph6.0)混匀，于4度冰箱冷藏10min后，滤膜过滤。

(7)hplc法测定，其色谱条件为：色谱柱以键合万古霉素为填充剂；流动相为20mmol/l的乙酸铵溶液与四氢呋喃的混合溶液，其中乙酸铵溶液(用冰乙酸调节ph至6.0)与四氢呋喃的体积比为92：8；检测波长为238nm；柱温为35℃；流速为1.5ml/min。

将6份供试液重复实施例1的操作，测定6份重复性结果，各杂质及对映异构体和主成分rsd％在2.01％-3.59％之间，上述数据表明本发明测定方法的重现性好。并且，主峰与各杂质及对映异构体峰能够达到基线分离，表明使用本发明方法分离良好，专属性强。

实施例2

按照实施例1的检测方法，其中将供试液的ph调节至10.5。各杂质及对映异构体的回收率在90.0％～110％，表明本发明测定方法的准确度高。

实施例3

按照实施例1的检测方法，其中将供试液的ph调节至12.0。各杂质及对映异构体的回收率在90.0％～110％，表明本发明测定方法的准确度高。

实施例4

本实施例采用如下具体步骤：

(1)固相萃取小柱预处理：3ml溶剂i(乙腈)加入小柱后，再将3ml水加入小柱清洗，控制流速为1ml/min。

(2)盐酸帕洛诺司琼注射液预处理：向待测溶液按限度浓度(杂质a和杂质b的质量百分含量为0.1％，杂质c、d、e和对映异构体的质量百分含量为0.5％)加入杂质a、b、c、d、e和对映异构体后，用1mol/lnaoh调节ph至11.0，作为供试液。

(3)盐酸帕洛诺司琼注射液经固相萃取小柱富集：精密移取10ml供试液，分次加入小柱，流速为1ml/min。

(4)固相萃取小柱洗脱前处理：固相萃取小柱富集供试品后，精密量取1.5ml水加入小柱，精密移取1.0ml溶剂ii(乙腈、水、三氟乙酸的体积比为220：780：1.0)加入小柱，流速为1ml/min。

(5)盐酸帕洛诺司琼注射液浓缩后洗脱：精密移取无水乙醇1.0ml加入小柱洗脱盐酸帕洛诺司琼以及所加杂质，1.0ml量瓶收集洗脱液后，加无水乙醇定容至刻度。

(6)收集洗脱液与等体积溶剂iii(水，冰乙酸调ph6.0)混匀，于4度冰箱冷藏10min后，滤膜过滤。

(7)hplc法测定，其色谱条件为：色谱柱以键合万古霉素为填充剂；流动相为20mmol/l的乙酸铵溶液与四氢呋喃的混合溶液，其中乙酸铵溶液(用冰乙酸调节ph至6.0)与四氢呋喃的体积比为92：8；检测波长为238nm；柱温为35℃；流速为1.5ml/min。

测定结果：各杂质及对映异构体的回收率在90.0％～110％。

实施例5

按照实施例4的检测方法，将富集的供试液体积调整为20ml，各杂质及对映异构体的回收率在90.0％～110％。

实施例6

按照实施例4的检测方法，其中溶剂iii选用30mmol/l磷酸盐缓冲液。各杂质及对映异构体的回收率在90.0％～110％。

实施例7

空白辅料对照试验：按照处方量配置空白辅料溶液，与供试液采用相同的方法，经过固相萃取小柱富集洗脱等步骤后进行检测，结果表明空白辅料对供试液和各杂质及对映异构体的检测没有干扰，本发明方法专属性好。

经过本发明方法富集的盐酸帕洛诺司琼有关物质可以浓缩10倍以上，可以准确的检测有关物质，解决了供试液浓度低，hplc检测灵敏度不够的问题。

本领域技术人员容易理解，实施例中盐酸帕洛诺司琼注射液的预处理步骤中，加入低限度杂质是为了解释说明本发明方法的有效性，该方法可用于同时检测盐酸帕洛诺司琼的多种有关物质。实际检测时不必加入杂质。本发明的方法重复性、灵敏度、耐用性、准确度均良好，为控制盐酸帕洛诺司琼的药品质量提供了准确有效的检测方法。