本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种prrsvn蛋白的原核可溶性表达方法及间接elisa抗体检测方法。
背景技术：
猪繁殖与呼吸综合征(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，prrs)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsvirus，prrsv)引起的一种高度接触性传染病，其能引起母猪繁殖障碍及育肥猪呼吸系统疾病，并伴有轻度神经症状，严重时可造成全身病毒血症。近年来，由于基因重组导致不断有新毒株(例如nadc30，nadc30-like)出现，使得对prrs防控的难度增加。根据病毒基因特征和全球范围内流行状况可将prrsv分为1型(欧洲型)和2型(美洲型)，在我国主要流行的是2型，prrsv基因组长15.2kb，含有10个开放阅读框(openreadingframe,orf)，分别为orf1a、orf1b、orf2a、orf2b、orf3、orf4、orf5、orf5a、orf6和orf7，相邻开放阅读框之间存在短的重叠序列。其中由orf7编码的核衣壳蛋白n占病毒总蛋白的20-40％，具有强免疫原性，在prrsv感染猪一周左右即可刺激机体产生特异性抗体，并持续数月之久。所以，n蛋白在prrsv的流行病学监测和诊断等方面具有重要意义。
由于操作相对简便和制备成本低廉，使得大肠杆菌成为体外表达外源基因的首选系统，但表达的外源蛋白大都是以非可溶性的包涵体形式存在，与天然活性蛋白差距甚远，限制了其应用。目前，原核表达系统中常用的促溶标签有谷胱甘肽s转移酶(gts)、麦芽糖结合蛋白(mbp)和硫氧还蛋白。其中mbp是大肠杆菌k12的male基因编码蛋白，分子量42kda，研究表明其可以行使分子伴侣的作用，提升蛋白正确折叠率，对难以表达的膜蛋白和某些病毒蛋白都具有很好的促溶作用。此外，mbp能与直链淀粉树脂发生特异性结合，利用麦芽糖竞争性抑制原理可以分离mbp融合蛋白，采用factorxa将mbp标签切除即可获得纯的目的蛋白。虽然mbp标签分子量比较大，但研究表明，mbp表达并不影响目的蛋白生物学性质。prrsvn蛋白是一种碱性蛋白，局部亲水性较好，通过调整表达条件和添加促溶标签等方式可以实现大肠杆菌的可溶性表达。目前采用mbp作为促溶标签实现n蛋白的原核高效可溶性表达尚鲜有报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种prrsvn蛋白的原核可溶性表达方法及间接elisa抗体检测方法，旨在解决上述背景技术中提出的问题。
本发明是这样实现的，一种prrsvn蛋白的原核可溶性表达方法，包括如下步骤：
(1)根据大肠杆菌密码子偏嗜性特征，人工优化并合成prrsvn蛋白编码基因，所述prrsvn蛋白编码基因序列如seqidno.1所示；
(2)以mbp作为促溶标签，构建n蛋白原核表达载体
设计pcr引物，对所述合成的prrsvn蛋白编码基因进行pcr扩增，所述引物序列如下：
上游引物为f：5'-cggaattcatgccaaataacaacggcaag-3'，下划线为ecorⅰ酶切位点；
下游引物为r：5'-aactgcagtcatgctgagggtgatgctgtg-3'，下划线为pstⅰ酶切位点；
pcr扩增反应体系为：按体积百分含量计，ex-taq预混酶50％、上游引物和下游引物各3％、模板2％、余量为蒸馏水；
利用ecorⅰ和pstⅰ分别双酶切pcr产物和带有mbp标签的pmal-c4x载体，反应体系为：按体积百分含量计，胶回收产物12.5％，线性化后pmal-c4x载体50％，10xbufferh10％，ecorⅰ5％，pstⅰ5％，余量为ddh2o；筛选阳性重组质粒；
(3)mbp融合n蛋白表达与纯化
将(2)中筛选的阳性重组质粒转入培养液中诱导表达；再进行裂解、离心，将直链淀粉树脂加入到层析柱中，用缓冲液洗涤树脂，然后将离心收集的上清液加入到层析柱中进行分离纯化，最后加入麦芽糖溶液洗脱目的蛋白，将麦芽糖用pbs置换。
优选地，步骤(2)中，所述上游引物和下游引物的浓度各为20μm。
优选地，步骤(3)中，所述诱导表达采用iptg作为诱导剂。
优选地，步骤(3)中，所述诱导表达时诱导温度为22-28℃，诱导时间为10-12h。
优选地，步骤(3)中，所述麦芽糖溶液的浓度为10mmol/l。
本发明进一步提供了一种prrsv间接elisa抗体检测方法，该方法包括以下步骤：
包被抗原：将纯化后的mbp融合n蛋白以碳酸盐缓冲液稀释后加入elisa板中，4℃包被过夜；
洗涤：弃去包被液并用pbst洗三遍；
封闭：每孔加入150μl5％pbst，37℃封闭2小时，弃去封闭液并洗涤三遍；
孵育一抗：以一定的血清稀释度将猪血清与血清稀释液混匀，150μl/孔，37℃孵育1小时，弃去并洗涤三遍；
孵育二抗：加入pbst稀释的hrp标记的抗猪igg抗体，100μl/孔，37℃孵育40分钟，弃去并洗涤五遍；
显色与读值：以100μl/孔加入tmb底物溶液，室温反应10min后加入1.25m硫酸终止液，酶标仪读取od450nm吸收值。
优选地，所述血清稀释度1：200。
优选地，所述抗原包被浓度为1μg/ml。
相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：
本发明以带有mbp标签的pmal-c4x作为表达载体，实现了prrsvn蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达，融合n蛋白能被抗mbp的单抗和prrsvn蛋白兔多抗特异识别。本发明以融合n蛋白为包被抗原建立的间接elisa抗体检测方法不与猪圆环病毒2型(pcv2)、古典猪瘟病毒(csfv)、伪狂犬病毒(prv)、猪细小病毒(ppv)等猪血清发生交叉反应。田间样品检测结果表明，本发明建立间接elisa抗体检测方法与idexx同类试剂盒的总符合率为90％左右。
本发明以mbp作为促溶标签，实现了prrsvn蛋白在大肠杆菌内的高效可溶性表达，诱导表达时采用接近室温22-28℃进行，无需加热或降温设备，目的蛋白洗脱时采用低浓度麦芽糖溶液，其浓度仅为10mmol/l，需求量少，节约成本；重组蛋白具有良好的免疫反应性，这为深入研究n蛋白功能以及开发prrs相关诊断制剂奠定了基础。
附图说明
图1是本发明实施例提供的prrsvqh08毒株orf7基因的pcr扩增结果图；图中：m-dl2000dna分子质量标准；1-prrsvqh08毒株orf7基因pcr扩增产物。
图2是本发明实施例提供的pmal-c4x-prrsv-mbp-orf7重组质粒的双酶切鉴定结果图；图中：m-dl2000dna分子质量标准；1-未酶切pmal-c4x-prrsv-mbp-orf7重组质粒；2-ecorⅰ和pstⅰ双酶切pmal-c4x-prrsv-mbp-orf7重组质粒。
图3是本发明实施例提供的prrsvqh08mbp重组n蛋白sds-page检测结果图；图中：m-蛋白分子质量标准；1-pmal-c4x-prrsv-mbp-orf7bl21(de3)宿主菌诱导后超声破碎菌体上清液；2-pmal-c4x-prrsv-mbp-orf7bl21(de3)宿主菌诱导前菌体上清液；3-直链淀粉树脂吸附mbp融合n蛋白后流穿液；4-直链淀粉树脂洗脱下的mbp融合n蛋白。
图4是本发明实施例提供的以抗mbp鼠源单克隆抗体为检测抗体进行mbp融合n蛋白的westernblot分析结果图；图中：m-标准蛋白分子量；1-pmal-c4x-prrsv-mbp-orf7bl21(de3)宿主菌iptg诱导后超声破碎菌体上清液；2-pmal-c4x-prrsv-mbp-orf7bl21(de3)宿主菌未诱导的破碎菌体和上清混合物。
图5是本发明实施例提供的以抗2型prrsvn蛋白兔血清为检测抗体进行mbp融合n蛋白的westernblot分析结果图；图中：1-未经过factorxa处理的mbp融合n蛋白；2-factorxa处理后mbp融合n蛋白；3-纯化的prrsvqh08病毒粒子阳性对照。
图6是本发明实施例提供的prrsvn蛋白抗体间接elisa方法的特异性试验结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
参照图1-图6。
1、材料
(1)pcr扩增模板和血清
含有2型prrsvqh-08株(全基因组genbank登录号：ku201579)orf5/6/7的pmd-18t-prrsv-qh08-orf5/6/7质粒，抗2型prrsvn蛋白兔血清、1型和2型prrsv阳性猪血清和prrsv阴性猪血清、猪圆环病毒2型(pcv2)阳性猪血清、古典猪瘟病毒(csfv)阳性猪血清、伪狂犬病毒(prv)阳性猪血清、猪细小病毒(ppv)阳性猪血清以及纯化的prrsvqh-08病毒粒子。
(2)试剂
pmal-c4x载体、抗mbp鼠源单克隆抗体和factorxa购自neb公司；hrp标记的抗鼠igg抗体、hrp标记的抗猪igg抗体以及hrp标记抗兔igg抗体购自sigma公司；bl21(de3)感受态细胞购自北京全式金生物公司；t4dna连接酶、extaqdna聚合酶和dna限制性内切酶购自neb公司；质粒小提试剂盒及dna纯化回收试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；x-gal和直链淀粉树脂(amyloseresin)购自北京索莱宝生物有限公司；血清稀释液购自山东百迪泰生物技术公司；免疫印迹化学发光试剂(pierceeclwesternblottingsubstrate)购自thermo公司；prrsx3抗体检测试剂盒购自美国idexx公司；iptg、蛋白胨、酵母提取物和葡萄糖购自oxoid公司；氨苄霉素购自上海晶都生物技术有限公司；其余试剂皆为国产分析纯。
2、prrsvn蛋白的原核可溶性表达方法
(1)pcr引物设计
采用primer3.0软件设计引物，并引入ecorⅰ和pstⅰ酶切位点，引物由上海生工生物工程技术有限公司合成，上、下游引物序列如下：
上游引物为f：5'-cggaattcatgccaaataacaacggcaag-3'，下划线为ecorⅰ酶切位点；
下游引物为r：5'-aactgcagtcatgctgagggtgatgctgtg-3'，下划线为pstⅰ酶切位点。
(2)根据大肠杆菌密码子偏嗜性特征，人工优化并合成prrsvn蛋白编码基因，所述prrsvn蛋白编码基因序列如seqidno.1所示；
(3)prrsvn蛋白编码基因orf7的克隆
以pmd-18t-prrsv-qh08-orf5/6/7质粒为模板，采用50μl反应体系：按体积百分含量计，ex-taq预混酶25μl、上游引物和下游引物各1.5μl，其浓度均为20μm，模板1μl、补加蒸馏水至50μl，进行pcr扩增反应，反应条件为：95℃预变性8min；95℃40s，59℃1min，72℃30s，进行35个循环；72℃延伸8min；扩增结果如图1所示。对扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，胶回收目的片段测序待用。
(4)重组pmal-c4x-prrsv-mbp-orf7原核表达载体的构建及鉴定
利用ecorⅰ和pstⅰ分别双酶切胶回收产物和带有mbp标签的pmal-c4x载体，反应体系为：按体积百分含量计，胶回收产物5μl，线性化后pmal-c4x载体20μl，10xbufferh4μl，ecorⅰ2μl，pstⅰ2μl，补加ddh2o至总体积为40μl，振荡混匀后37℃酶切5h，切胶纯化双酶切产物，t4dna连接酶16℃过夜连接，连接产物转化dh5ɑ感受态细胞，然后将转化产物涂在含有x-gal及氨苄抗性的固体lb平板上，37℃培养过夜，挑取白色单菌落至液体lb培养基培养12h，富集菌体。扩增获得380bp的目的片段，空载体对照没有扩增出相应分子量大小的条带(图中省略)；进一步采用ecorⅰ和pstⅰ双酶切鉴定，电泳结果显示除了6980bp左右的pmal-c4x载体片段外，还释放出预计片段大小的目的条带(如图2所示)。测序结果也表明我们成功制备了含有n蛋白编码基因orf7的重组质粒，命名为pmal-c4x-prrsv-mbp-orf7。
鉴定正确的pmal-c4x-prrsv-mbp-orf7重组质粒转入bl21(de3)感受态中，纯化单菌落，提取质粒，将阳性重组质粒测序待用。
(5)mbp融合n蛋白表达与纯化
将bl21(de3)阳性重组质粒转接到100mllb培养基中，37℃摇床振荡培养3h，培养液中加入iptg使其终浓度为1mmol/l，接近室温进行诱导培养，诱导温度优选22-28℃，诱导时间为10-12h，选择接近室温的诱导温度，无需加热或降温设备；4℃、6000r/min离心5min收集菌体，再加入10ml预冷pbs，该pbs中含有体积分数为1％的pmsf，重悬菌液，冰浴超声裂解30min，条件为功率220w，工作3s，间隔5s，裂解后4℃、12000r/min离心15min，将上清液置于4℃备用；将1ml直链淀粉树脂加入到10ml层析柱中，用3个柱体积的缓冲液即ph＝7.2的tris-hcl、0.3mol/lnacl、1mmol/ledta洗涤树脂；将20％的乙醇清洗干净，然后加入7ml超声裂解的上清液，轻轻混匀，4℃摇床孵育2h自然滤出并收集流穿液；加入3至5倍柱体积的所述缓冲液清洗杂蛋白；最后加入麦芽糖溶液洗脱目的蛋白，麦芽糖溶液的浓度优选10mmol/l，使得其保证洗脱效果的前提下减少需求量，节约成本；进一步用截留量3kd的超滤管将麦芽糖用pbs置换。纯化后的融合蛋白以bca法测定蛋白浓度，计算出每升菌液中融合蛋白的含量。
(6)westernblot分析
经过摸索优化表达条件后，确定在iptg终浓度为1mmol/l、诱导温度28℃、诱导时间10-12h的条件下，重组n蛋白的表达量最高。纯化后的mbp融合n蛋白进行sds-page检测，结果如图3所示，经sds-page电泳分析，在56ku处出现了与理论值蛋白分子量一致的蛋白。经过直链淀粉树脂亲和层析纯化后获得了较高纯度的mbp融合蛋白。电泳图谱显示除了与56ku预计分子量大小相一致的mbp融合n蛋白外，还有一条分子量约50ku的蛋白带，推出为融合n蛋白的降解产物，因为n蛋白具有不稳定性。纯化后每升菌液可得到纯度约为85％的融合蛋白20mg左右。然后进行westernblot分析，一抗分别选用抗mbp鼠单克隆抗体，稀释度为1：4000和抗2型prrsvn蛋白兔血清，稀释度为1：2000，选择相应二抗反应后，以ecl化学发光法在暗室曝光，同时以纯化的prrsvqh-08病毒粒子作为阳性对照，未诱导的重组菌作为阴性对照。
sds-page电泳分离mbp重组n蛋白后转印至pvdf膜，然后分别以mbp鼠源单克隆抗体及抗n蛋白兔血清做一抗，检测重组n蛋白的反应原性。结果如图4所示，以mbp鼠源单克隆抗体作为一抗时，在56ku处出现明显的特异性目的条带，而未诱导菌体的重组n蛋白条带很弱，分析为本底表达。以抗n蛋白的兔血清做一抗检测，在56ku处也出现了明显特异的目的条带，表明mbp标签不影响n蛋白的反应原性。mbp融合n蛋白经factorxa在37℃裂解4小时后在56ku及14ku处均出现目的条带，56ku处可能为未裂解完全的融合蛋白(如图5所示)。在14ku条带下方一些有一条清晰的反应条带，分析为降解的n蛋白产物。蔗糖密度梯度纯化的prrsvqh08病毒在14ku处也呈现出特异反应条带，与预计n蛋白大小相一致，这表明以mbp为促溶标签，获得的重组n蛋白具有与天然病毒相似的反应特性。
3、prrsv间接elisa抗体检测方法
包被抗原：将纯化后的mbp融合n蛋白以碳酸盐缓冲液稀释至1μg/ml后加入elisa板中，每孔加100μl，即每孔100ng，4℃包被过夜；
洗涤：弃去包被液并用pbst洗三遍，每次加入300μl/孔，吸水纸上轻轻拍干残留液体；
封闭：每孔加入150μl5％pbst，37℃封闭2小时，弃去封闭液并洗涤三遍；
孵育一抗：以一定的血清稀释度将猪血清与血清稀释液混匀，150μl/孔，37℃孵育1小时，弃去并洗涤三遍；
孵育二抗：加入pbst稀释的hrp标记的抗猪igg抗体，100μl/孔，37℃孵育40分钟，弃去并洗涤五遍；
显色与读值：以100μl/孔加入tmb底物溶液，室温反应10min后加入1.25m硫酸终止液，酶标仪读取od450nm吸收值。
4、确定包被抗原浓度及血清稀释度
以方阵滴定法确定包被抗原浓度和血清稀释度，将mbp融合n蛋白分别稀释至0.5、1、2、4、8μg/ml，按着100ng/100μl/孔加入96孔elisa板中，4℃过夜包被。prrsv阴性和阳性猪血清分别按照1：100、1：200、1：400、1：800梯度稀释，37℃孵育1h，洗涤后加入二抗，二抗暂时按推荐范围浓度1：10000使用，孵育40min后加入tmb显示读值，结果如表1所示。
表1抗原包被浓度及血清稀释度确定
p：代表prrsv阳性猪血清；n:代表prrsv阴性猪血清
由表1可知，当包被抗原浓度8μg/ml、血清稀释度1：800时，阳性血清(p)od450nm吸收值为3.37，阴性血清(n)od450nm值为0.19，p/n值为17.73，倍比最大。但综合实际工作条件考虑，选择最佳抗原浓度为1μg/ml、最佳血清稀释度1：200，此时阳性血清(p)od450nm值为3.56，阴性血清(n)od450nm值为0.41，p/n值达到8.68。
5、确定抗猪igg二抗的稀释度
按照确定的适宜抗原浓度包被elisa板和稀释猪血清样品，抗猪igg二抗按照1：5000、1：10000、1：20000、1：40000、1：80000梯度稀释，洗涤5遍后加入tmb显色终止读值。以阳性血清值大于1，阴性血清值小于0.2，弱阳性血清值0.4左右作为判断标准，确定抗猪igg二抗稀释度为1：40000，结果如表2所示。
表2抗猪igg二抗的稀释度确定
6、阴阳性临界值的确定
经过优化后，最终确定反应体系为100μl，mbp融合n蛋白的包被浓度为每孔100ng，猪血清稀释度1：200，兔抗猪二抗的工作浓度为1：40000，以此建立了间接elisa抗体检测方法。采用20份prrsv阴性猪血清按上述条件进行elisa检测，其od450nm平均吸收值为0.15，阳性对照血清od450nm大于1.0，经过与idexxp3prrsv抗体检测试剂盒进行比较，综合考虑，最终确立以阴性血清od450nm平均值的3倍作为阴、阳性血清判断的临界值。
7、间接elisa抗体检测方法特异性分析
在确定间接elisa抗体检测方法适宜的抗原包被浓度、猪血清稀释度和抗猪igg二抗浓度等条件后，检测了该方法与猪圆环病毒2型(pcv2)、古典猪瘟病毒(csfv)、伪狂犬病毒(prv)、猪细小病毒(ppv)、1型prrsv这些能够导致猪繁殖障碍性疫病的猪血清的交叉反应性，结果表明(如图6所示)，本发明建立的prrsvn蛋白抗体间接elisa检测方法不与、ppv、prv和csfv血清发生交叉反应，与1型prrsv血清发生较强反应，这表明该方法能够特异性地检测prrsv血清抗体，但不适合区分1型和2型prrsv血清抗体。
8、田间猪血清样品检测
采用上述条件建立的间接elisa方法检测36份田间猪血清，并与idexxprrsx3试剂盒的检测结果进行比较，初步判断新建立的间接elisa抗体检查方法的有效性。结果如表3所示。
表3prrsmbp-n间接elisa抗体检测方法与idexxprrsx3试剂盒符合率分析
表3结果表明，本发明建立的prrsv抗体elisa检测方法与idexxprrsx3的阳性符合率为90.91％，阴性符合率为92％，总符合率为91.66％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>中国农业科学院兰州兽医研究所
<120>prrsvn蛋白的原核可溶性表达方法及间接elisa抗体检测方法
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>372
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
atgccaaataacaacggcaagcagcagaaaaaaaaaaaaggtaacggtcagccggtgaat60
cagctgtgtcagatgctgggtaaaattattgcacagcagaaccagagccgtggtaaaggt120
ccgggtaaaaaaaatcgtaaaaaaaaccctggtaaacctcacttcccgctggcaaccgaa180
gatgatgttcgtcatcattttaccccgagcgaacgtcagctgtgtctgagtagcattcag240
accgcatttaatcagggtgcaggtacctgtgcactgagcgatagcggtcgtattagctat300
accgttgaatttagcctgccgacccagcataccgttcgtctgattcgtgccacagcatca360
ccctcagcatga372