本发明涉及一种特定分子量透明质酸分离纯化的方法。主要是涉及半制备高效液相色谱法，属于透明质酸分离纯化领域。
背景技术
透明质酸(hyaluronicacid,ha)，是一种天然的黏多糖，由n-乙酰基-d-葡糖胺和d-葡萄糖醛酸的重复二糖单元通过交替的β-1,3-糖苷键和β-1,4-糖苷键连接而成。广泛分布于结缔组织中，也是细胞外基质的主要成分之一。在多种生物过程中起着关键的作用，如胚胎发育、伤口愈合、肿瘤生长和转移、维持肺结构完整等。由于透明质酸具有生物相容性和生物可降解性的特点，在医药、保健品以及化妆品等领域得到了广泛的应用。目前，透明质酸分离纯化的方法主要有过滤法、乙醇分级沉淀法、凝胶层析法、离子交换层析法等。过滤法能够有效除去蛋白质等杂质，但纯化效果相对较低，仅仅适合初期提纯。乙醇分级沉淀法是分离透明质酸最为常用的方法，但对于浓度较低的透明质酸的沉淀效果较差，且乙醇损耗量大。凝胶层析法是根据透明质酸分子量大小选择合适的分子筛，对透明质酸进行有效分离，但纯化的效率低，成本高。离子交换色谱法是基于带电溶质分子吸附到固定相带相反电荷的离子交换基团上，通过改变流动液浓度或ph来进行洗脱实现化合物的。此技术离子交换树脂化学修饰比较难，不能分离获得特定分子量的透明质酸。
技术实现要素：
本发明是为了解决现有透明质酸分离纯化方法存在不足的技术问题，提供一种特定分子量透明质酸的分离纯化方法，主要涉及半制备高效色谱法分离纯化，超滤离心管浓缩，冷冻干燥等工艺环节。
本发明采用的技术方案如下：
一种特定分子量透明质酸的分离纯化方法，所述方法包括如下步骤：
(1)原料准备：以分子量分布为130kda-2000kda的透明质酸为原料，配制成浓度为0.1～1mg/ml的透明质酸溶液，磁力搅拌16～20h，使透明质酸溶解；
(2)流动相配制：配制0.05～0.5mol/ml的氯化钠溶液，0.45um的滤膜抽滤，超声波超声脱气10～15min；
(3)分离纯化：半制备液相色谱仪进行分离纯化；色谱条件：选用凝胶色谱柱；示差折光检测器；流动相为0.05～0.5mol/ml的氯化钠溶液；流速为0.5～5ml/min；柱温为40℃；进样量为500～1500ul；检测时间为40min；
(4)馏分收集：收集不同时间间隔的馏分；时间间隔以2～4min为宜，收集获得馏分采用不同标记，如馏分a、馏分b、馏分c、馏分d等；
(5)馏分浓缩：使用超滤离心管，将不同时间间隔的馏分分别放入离心机中高速离心1～5min，转速为2000～6000rmp；
(6)干燥：采用冷冻干燥法，分别获得不同分子量的透明质酸冻干粉；
(7)分子量测定：高效液相凝胶色谱法测定其相对分子量；以聚苯乙烯磺酸钠盐为标准品，gpc软件分析法得结果，绘制标准曲线(标准曲线以保留时间为横坐标，以mp峰位分子量为纵坐标)。
优选的，所述步骤(3)半制备液相色谱仪分离纯化，选用凝胶色谱柱；流动相为0.1mol/ml的氯化钠溶液；流速为3ml/min。
所述步骤(5)选用100kda超滤离心管进行浓缩，转速为5000rmp。
优选的，所述方法如下：
(1)原料准备：以分子量130kda～1800kda的透明质酸为原料，配制成浓度为0.1～1mg/ml的透明质酸溶液，磁力搅拌16～20h，使透明质酸溶解；
(2)流动相配制：配制0.05～0.5mol/ml的氯化钠溶液，0.45um的滤膜抽滤，超声波超声脱气10～15min；
(3)分离纯化：半制备液相色谱仪进行分离纯化；色谱条件：选用凝胶色谱柱；示差折光检测器；流动相为0.05～0.5mol/ml的氯化钠溶液；流速为0.5～5ml/min；柱温为40℃；进样量为500～1500ul；检测时间为40min；
(4)馏分收集：收集16～18min，18～20min这两个时间段的馏分，分别记为馏分a、馏分b；
(5)馏分浓缩：使用超滤离心管，将馏分a、馏分b分别放入离心机中高速离心1～5min，转速为2000～6000rmp；
(6)干燥：采用冷冻干燥法，由浓缩后的馏分a、馏分b分别获得分子量分别为1419.494kda(重均分子量)和845.329kda(重均分子量)的透明质酸冻干粉。
本发明的有益效果主要为：采用本发明方法，可以收集到特定分子量的透明质酸，重复性强，操作简单，大大减少有机溶剂用量，绿色环保。
附图说明
图1为实施例1标准曲线；
图2为实施例1馏分a产物的分子量分析结果；
图3为实施例1馏分b产物的分子量分析结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明技术方案进行进一步描述，但本发明的保护范围不仅限于此：
实施例1：特定分子量透明质酸分离纯化工艺条件较佳的一例
试剂与仪器准备：以130kda～1800kda分子量分布较宽的透明质酸为待分离纯化样品，分析纯氯化钠，聚苯乙烯磺酸钠盐标准品，超纯水，半制备色谱仪，超声波，离心机，超滤离心管。
本发明提供的特定分子量透明质酸分离纯化方法，详细的工艺流程如下描述：
(1)称量透明质酸(分子量130kda～1800kda)5.00mg溶解于10ml流动相中，磁力搅拌18h，配制成0.5mg/ml透明质酸溶液。
(2)称量11.90mg氯化钠溶解于1000ml超纯水中，震荡摇匀，配制成0.1mol/ml氯化钠溶液。使用0.45um滤膜抽滤除去不溶物杂质后，超声脱气15min。
(3)半制备色谱法分离纯化上述溶解的透明质酸。具体的色谱条件如下：凝胶色谱柱ohpaksb-2006(20mm×300mm，20um)；示差折光检测器rid-20a；0.1mol/ml氯化钠溶液作为流动相；3ml/ml流速；40℃柱温；进样量为1000ul；检测时间为30min。
(4)收集16～18min，18～20min这二个时间段的馏分，分别记为馏分a、馏分b。
(5)将上述收集到的馏分分别装入分子截留量为100kda超滤离心管中，然后放入离心机中高速离心2min，转速为4000rmp。
(6)采用冷冻干燥技术对以上浓缩的样品进行干燥，得到无色透明的特定分子量透明质酸粉末。
(7)高效液相色谱法分析上述分离纯化的透明质酸。将冻干粉溶解于0.1mol/ml氯化钠溶液中配制成溶度为0.1mol/ml透明质酸溶液，以0.1mol/ml氯化钠溶液为流动相，流速为0.5ml/l，柱温为35℃，色谱柱为tskg6000pwxl凝胶柱。
(8)以聚苯乙烯磺酸钠盐为标准品，绘制标准曲线(参见图1)。采用gpc软件对分析数据进行处理，测定上述获得透明质酸的相对分子量，馏分a和馏分b的分子量分别为1419.494kda和845.329kda。