本发明属于分析化学技术领域，特别涉及一种银杏内酯原料成分1H NMR定量检测方法及其1HNMR指纹图谱构建方法。
背景技术：
自从1926年Pauli发现了核磁共振现象以来，研究人员对于核磁共振技术(NuclearMagnetic Resonance，NMR)的探索一直没有停止过。作为一门现代分析方法，核磁共振光谱(NMR)在化合物的结构解析及确证中已经具有无可替代的地位。而定量核磁技术(quantitative NuclearMagnetic Resonance,qNMR)在近年来，随着仪器和实验技术的发展，如磁场强度的提高、超低温碳头等设备的出现，在药物质量控制中的应用也取得较大进展，已在中国药典、美国药典、英国药典等作为法定标准收载于附录中。目前，1H-qNMR的研究最为充分，灵敏度和测试效率最高，应用范围最广。同时1H-qNMR法相对于传统中药分析方法如高效液相色谱法(1H NMR)，具有快速、简便、准确、重现性好、专属性高、样品可回收，且不需要使用特殊对照品引进任何校正因子或绘制工作曲线等优势。
银杏叶为银杏科植物银杏(Ginkgo biloba L.)的干燥叶。性甘、苦、涩、平，归心、肺经，具有活血化瘀、通经活络、敛肺平喘、化浊降脂等作用。银杏内酯主要成分是二萜内酯，现已分离得到的有银杏内酯A、B、C、K等。研究表明，该类成分可特异性拮抗血小板活化因子(PAF)受体，对动脉粥样硬化性血栓性脑梗死具有较好的治疗作用，主要用于缺血性中风的治疗。
目前，关于银杏内酯原料药及其制剂的质量控制方法多基于传统的中药分析方法如1HNMR-UV、1H NMR-ELSD等。有文献采用计算机辅助光谱分析和1D定量1H NMR(qHNMR)法进行银杏提取物，但方法较为复杂，含量测定需要采用计算机信号模拟技术且没有证实有较好的准确性。有专利采用1H NMR法进行银杏萃取物以不同氘化溶剂系统同时定性与定量分析银杏内酯，但该方法采用C6D6-MeOD混合溶剂，提取率较低，且银杏内酯定量峰化学位移较为接近，容易造成重叠，影响含量测定准确度。
技术实现要素：
本发明旨在寻找一种新的银杏内酯定量以及构建指纹图谱的方法。
有鉴于此，本发明提出了一种银杏内酯原料成分定量检测方法，其特征在于，选取DMSO-d6为测量的溶解测试溶剂。
本发明提出了一种银杏内酯原料成分定量检测方法，其特征在于，选取3-环丁烯砜为内标物，对银杏内酯原料成分及其含量进行检测。
进一步地，上述定量检测方法包括：
供试品溶液制备：取3-环丁烯砜，加入DMSO-d6，再加入银杏内酯原料使之溶解，待测；银杏内酯原料可含有银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯K或其任意组合；
1H NMR检测条件设置：设定脉冲序列，扫描50-100次，温度为295K-310K，弛豫时间8.87s-10s，中心频率δ2.00-2.10ppm；
选取具体成分标的信号或其组合：其中银杏内酯K：δ7.15(1H，d，J＝5.5Hz)，银杏内酯A：δ6.78(1H，d，J＝5.1Hz)，银杏内酯B：δ5.31(1H，d，J＝4.1Hz)；
含量计算：根据1HNMR检测结果，计算银杏内酯原料成分及其含量。
具体地，所述脉冲序列为zg30。
进一步地，1H NMR检测谱宽为4000K-7000K。
具体地，1H NMR检测数据点为32K-64K。
优选地，1H NMR检测谱宽为6410K，数据点32K，扫描次数64次，温度303K，采样时间5.33s，弛豫时间8.87s，中心频率δ2.03ppm。
本发明还提出了一种银杏内酯指纹图谱的建立方法，其特征在于，DMSO-d6为1H NMR测量的溶解测试溶剂，对银杏内酯原料指纹图谱进行检测。
具体地，上述银杏内酯指纹图谱的建立方法包括：
供试品溶液制备：取银杏内酯原料加入DMSO-d6溶解，待测；优选地，该供试品溶液还包括3-环丁烯砜；
1H NMR检测条件设置：zg30脉冲序列，谱宽4000K-7000K，数据点32K-64K，扫描次数50-100次，温度295-310K，弛豫时间1-3s，中心频率δ＝2.00-2.10ppm；
峰指认：用DMSO-d6分别制备一定浓度的银杏内酯A，银杏内酯B，银杏内酯C，银杏内酯K对照品溶液，按上述条件测定，并与供试品比对，得到银杏内酯原料各单体的特征峰以及共流出峰。其中，银杏内酯原料各单体包括银杏内酯A，银杏内酯B，银杏内酯C，银杏内酯K。
优选地，1H NMR检测谱宽为4801K，数据点32K，扫描次数64次，温度303K，采样时间6.66s，弛豫时间1s，增益35，中心频率δ＝2.04。
本发明还提出了3-环丁烯砜作为内标在银杏内酯原料1H NMR定量或建立指纹图谱中的应用。
本发明提出的银杏内酯原料成分定量检测方法方法具有良好的线性关系、精密度、稳定性、回收率，该法能够准确检测银杏内酯原料的成分含量。运用本发明提出的方法所构建的银杏内酯指纹图谱能较全面的反映银杏内酯原料中的化学成分，获得的对照指纹图谱能够客观评估样品的质量。
本发明利用1H NMR定量以及建立指纹图谱的方法相对于传统液相方法具有以下几点优势：
1、操作简单，含量测定中，1H NMR法采用绝对定量法，在应用过程中只需要使用一种内标而无需所有待测物的对照品即可对多种单体成分同时完成含量测定，无需所有待测物的对照品来进行标准曲线的绘制。
2、检测较为快速，指纹图谱的检测时间在10min以下。
3、1H NMR法的样品前处理简单，且样品不会被破坏，可回收。
4、1H NMR法重现性较好，且检测更加综合全面，不受待测物理化性质影响，另外可提供待测物的结构信息。
因此，1H NMR法可以用于银杏内酯原料的质量控制，并为该类产品的质量控制方法提供新的思路。
附图说明
图1为本发明的银杏内酯A，B，K和内标的化学结构图；
图2为本发明的银杏内酯原料定量检测供试品溶液的1H NMR图谱；
图3为本发明的银杏内酯原料的1H-1H COSYNMR图谱；
图4为本发明的银杏内酯原料的1H NMR指纹图谱；
图5为本发明的银杏内酯原料指纹图谱构建的供试品溶液和对照品溶液的1H NMR图；
图6为本发明的10批银杏内酯原料样品的1H NMR指纹图谱。
图7为本发明的银杏内酯原料在MeOD-C6D6(65:35)下的1H NMR谱图。
具体实施方式
本发明公开了一种银杏内酯原料成分的1H NMR定量检测方法及其指纹图谱构建方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的银杏内酯原料成分定量检测方法及其指纹图谱构建方法中所用药品、试剂、仪器，未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。未注明具体实验条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
仪器：Bruker AV-500型核磁共振仪(瑞士布鲁克公司)、METTLER XS-205微量分析天平(梅特勒-托利多上海仪器有限公司)、KH2200B型超声清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)。
试剂：DMSO-d6(Aldrich Chemical Company,Inc.USA)、MeOD-d4(Aldrich Chemical Company,Inc.USA)、D2O(Aldrich Chemical Company,Inc.USA)、3-环丁烯砜(上海晶纯生化科技股份有限公司)。
药材：银杏内酯原料(江苏康缘药业股份有限公司，批次160301、160401、160801、160802、161106、161107、161201、161202、161205、170101)；银杏内酯A(批号：110862-201310)，银杏内酯B(批号：110863-201209)，银杏内酯K(批号：111936-201201)，银杏内酯C(批号：110864-201508)均购于中国食品药品检定研究院。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述：
实施例1银杏内酯原料成分1H NMR定量检测方法
1、供试品溶液的制备：精密称取适量的3-环丁烯砜(IS，内标)对照品，用DMSO-d6配制成浓度为1.8mg/ml的溶液。取银杏内酯原料约40mg，精密称定，溶解于0.5mL的上述溶液中，室温下超声处理10min使完全溶解，然后转移到5毫米的NMR核磁共振分析管中。
2、1H NMR检测条件：zg30脉冲序列，谱宽6410K，数据点32K，扫描次数64次，温度303K，采样时间5.33s，弛豫时间8.87s，中心频率δ2.03ppm。
3、测定：实验采用银杏内酯A，银杏内酯B，银杏内酯K对照品和银杏内酯原料进行1H NMR图谱的比对，确定各成分含量测定的定量峰，具体选用如下信号：银杏内酯K：δ7.15(1H，d，J＝5.5Hz)，银杏内酯A：δ6.78(1H，d，J＝5.1Hz)，银杏内酯B：δ5.31(1H，d，J＝4.1Hz)，内标(IS)：δ3.78(4H，s)。各成分的结构和定量特征峰质子见图1(*为定量峰质子)，供试品溶液的1HNMR图谱见图2。
采用绝对定量法，以环丁烯砜为内标，计算各成分含量，结果如表1所示。计算公式如下：
上述公式中，I,N,M,W和P分别表示积分峰面积，质子数，分子量，质量和纯度；其中下标X为待测物的，下标std为内标物的。
表1银杏内酯原料供试品溶液各成分含量测定
实施例2专属性考察
取银杏内酯原料40mg，用0.5mL DMSO-d6溶解，通过1H-1H COSY法验证定量峰的专属性，结果显示所有定量峰均无杂质峰干扰(图3)，表明该方法的专属性较好。
实施例3线性关系考察
精密称取适量的银杏内酯A(4.12mg，8.01mg，12.55mg，16.18mg，20.33mg，24.59mg)，银杏内酯B(8.55mg，13.17mg，18.06mg，23.23mg，28.51mg，33.6mg)，银杏内酯K(0.100mg，0.200mg，0.401mg，0.602mg，0.802mg，1.604mg)与内标物(0.94mg)，分别精密加入0.5mL的DMSO-d6，进行线性关系考察。以银杏内酯A，银杏内酯B，银杏内酯K与内标定量峰的峰面积比值(Ix/Istd)为纵坐标，以银杏内酯A与内标的质量比值为横坐标(Mx/Mstd)进行线性回归，得其回归方程分别为：Y＝0.0779X+0.0078(r＝0.9996)，Y＝0.0762X+0.0077，Y＝0.0781X+0.0007。结果表明，在选择的浓度范围内，NMR仪器的线性关系良好。
实施例4精密度试验
取同一份供试品溶液，按实施例1方法连续进样6次，计算各成分与内标定量峰的峰面积比值Ix/Istd及RSD值。结果显示，银杏内酯A，银杏内酯B，银杏内酯K与内标的定量特征峰的峰面积比值RSD分别为0.44％，0.73％，0.81％，表明仪器的精密度良好。
实施例5稳定性试验
取同一份供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24h按实施例1方法测定，计算各成分与内标定量峰的峰面积比值Ix/Istd。结果表明，24h内样品中并未出现新的特征峰，银杏内酯A，银杏内酯B，银杏内酯K与内标峰的峰面积比值RSD分别为2.85％，2.33％，2.51％，说明供试品溶液在24h内的稳定性较好。
实施例6重复性试验
取同一批次样品，按实施例1方法制备6份供试品溶液，实施例1下方法进行测定，计算各成分的含量及RSD值。结果表明，6份供试品溶液中银杏内酯A，银杏内酯B，银杏内酯K含量平均值分别为37.10％，53.3％，0.92％；RSD值分别为2.13％，2.09％，1.77％，说明该方法的重复性良好。
实施例7加样回收率试验
取已知含量的供试品20mg，精密称定，共9份，置于5mL容量瓶中，分高、中、低三个浓度组(150％，100％，50％)加入定量的对照品，按实施例1方法制备供试品溶液并进行测定，计算各成分的回收率。结果见表2，表明该方法准确度良好。
表2银杏内酯原料的加样回收率考察
实施例9样品含量测定
取3批银杏内酯原料，按实施例1测定。同时取此3批样品，采用高效液相色谱法测定银杏内酯A，银杏内酯B，银杏内酯K的含量。结果表明，两种方法具有较好的一致性(表3)。
表3三批样品的1H-NMR和HPLC含量测定结果
实施例10银杏内酯原料指纹图谱检测方法
1、供试品溶液的制备：取银杏内酯原料约10mg，精密称定，置于2mL EP管中，加入0.5mL的DMSO-d6，室温超声10min，然后转移到5毫米NMR核磁共振分析管中。
2、1H NMR检测条件：zg30脉冲序列，谱宽4801K，数据点32K，扫描次数64次，温度303K，采样时间6.66s，弛豫时间1s，增益35，中心频率δ＝2.04。
3、测定法：根据多批次样品的检测结果，选择24个共有峰作为银杏内酯原料的特征指纹峰，并选择化学位移居中，峰面积适中的13号峰作为参照峰，计算所有特征峰的相对峰面积。结果见表4。用DMSO-d6分别制备一定浓度的银杏内酯A，银杏内酯B，银杏内酯C，银杏内酯K对照品溶液，按上述方法测定，结果如图5。与供试品比对，结合质子信号峰的化学位移和耦合情况，对24个共有峰进行指认，其中，峰3、5、7、12、15、17、19、21为银杏内酯A的特征峰，峰1、4、9、16、18为银杏内酯B的特征峰，峰8为银杏内酯C的特征峰，峰2为银杏内酯K的特征峰，而峰6、10、11、13、14、20、22、23、24为共流出峰，结果见图4。
表4银杏内酯原料的特征指纹峰
实施例11精密度试验
取同一份供试品溶液，按实施例10方法连续进样6次，分别记录各共有峰的化学位移和相对峰面积，计算相应的RSD值。结果表明，所有共有峰的化学位移和相对峰面积的RSD值均小于4.0％，相似度均大于0.99，说明仪器的精密度良好。
实施例12稳定性试验
取同一份供试品溶液，按实施例10方法，分别于0、2、4、8、12、24h进行测定，考察样品的稳定性。结果表明，24h内样品中并未出现新的特征峰，所有共有峰的化学位移和相对峰面积的RSD值均小于5.0％，相似度均大于0.99，说明供试品溶液在24h内的稳定性较好。
实施例13重复性试验
取同一批次样品，按实施例10方法制备6份供试品溶液并测定，分别记录各共有峰的化学位移和相对峰面积，计算相应的RSD值。结果表明，6份供试品溶液中所有共有峰的化学位移和相对峰面积的RSD值均小于4.0％，相似度均大于0.99，说明该方法的重复性良好。
实施例14样品测定
分别取10批银杏内酯原料，按实施例10方法制备供试品溶液并测定，得到10批样品的1H-NMR指纹图谱，见图6。采用中位数(运用EXCEL中MEDIAN函数)计算方法，计算10批样品的指纹图谱相似度，结果相似度均大于0.99(表5)，说明本品在不同批次间的差异较小，生产工艺较为稳定。
表510批样品的相似度
对比例采用专利CN 1763514A方法测定银杏内酯原料
1、供试品溶液的制备：取银杏内酯原料约40mg，精密称定，加入390μL MeOD和210μL C6D6，室温下超声处理30min，然后转移到5毫米的NMR核磁共振分析管中。
2、1H NMR检测条件：zg30脉冲序列，谱宽6410K，数据点32K，扫描次数64次，温度303K，弛豫时间8.87s，中心频率δ2.03ppm。
采用该方法进行银杏内酯原料含量测定，无法完全溶解银杏内酯原料，且如图7所示(*为其他专利方法中银杏内酯A和银杏内酯B的定量峰)，其定量峰峰型较差，分离效果较差，导致较低的准确度，故该方法不适用于银杏内酯原料的含量测定。
以上实施方式不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。