本发明属于食品检测方法
技术领域：
，尤其涉及一种同时分析农兽产品中多种氨基糖苷化合物残留的方法。
背景技术：
：氨基糖苷类抗生素是一类含有氨基糖苷键的抗生素，抗菌谱广，对需氧革兰氏阴性杆菌具有强大的抗菌活性，氨基糖苷类抗生素由于具有耳肾等毒副作用，且通过食品长期的摄入体内后将使人体产生耐药性，因此其残留检测变得越来越重要。氨基糖苷类抗生素具有碱性，极性大的特性，在c18柱上保留很弱，再加上缺少发色和荧光基团等特性,运用常规方法进行检测比较困难。我们国家目前尚没有标准检测农产品中的氨基糖苷化合物，针对动物性食品的检测标准，例如gb21323-2007《动物组织中氨基糖苷类药物残留量的测定高效液相色谱-质谱/质谱法》、gb/t22969-2008《奶粉和牛奶中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量的测定液相色谱-串联质谱法》、gb/t22945-2008《蜂王浆中链霉素双氢链霉素和卡那霉素残留量的测定液相色谱-串联质谱法》，按照上述三个标准检测食品中的氨基糖苷化合物残留时，均使用离子对试剂，操作较为繁琐，且易产生离子抑制效应或与质谱不兼容，维护成本增大。国内针对链霉素等氨基糖苷化合物同时检测的报道仅限于动物性食品中，缺少应用于农兽产品中同时检测的相关方法的研究。因此建立快速、有效、灵敏、可靠且实用的残留分析方法对于食品安全具有重要的现实意义。技术实现要素：本发明针对上述现有技术中存在的不足，提供一种利用分散固相萃取和固相萃取技术对样品进行预处理，利用亲水作用色谱质谱联用技术检测快速高效且结果准确的同时分析农兽产品中多种氨基糖苷化合物残留的方法。本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种同时分析农兽产品中多种氨基糖苷化合物残留的方法，包括以下步骤：(1)提取：称取样品到塑料离心管中，加入15ml提取用乙酸铵缓冲溶液，充分涡旋混匀，进行离心,转移上清液于另一50ml塑料离心管中，残渣重复提取一次，合并上清液至离心管中,分取10ml合并后的提取液用ph计调节ph值至6.50±0.05，得到水溶液。(2)净化：将步骤(1)得到的水溶液加入1g硅藻土涡旋混匀，离心；上清经混合型弱阳离子交换的固相萃取柱净化；该固相萃取柱预先用3ml甲醇、3ml水活化，上样，弃去流出液，再用3ml水，3ml甲醇淋洗，弃去淋洗液，抽干，先用2ml洗脱液1洗脱，洗脱液1为10％甲酸，甲醇+水＝1+1，收集洗脱液于10ml离心管，再加入2ml洗脱液2洗脱，洗脱液2为10％甲酸甲醇，抽干，合并洗脱液，漩涡混匀。收集后的洗脱液，过0.22μmptfe滤膜，按下述所述仪器条件，上机检测：uplc/ms/ms检测：仪器条件：超高效液相流动相：a：250mm甲酸铵水溶液，甲酸铵水溶液为200ml水中加800ul甲酸；b：200mm甲酸铵有机相溶液，甲酸铵有机相溶液为200ml中加甲酸400ul，有机相为乙腈+甲醇+水＝6+1+3；离子源：esi+色谱柱：cortecshilic2.1cm×100mm×1.6μmcolumn色谱条件：time-minflow-ml/min％a％binitial0.2501000.20.2501001.50.2535654.50.2535654.520.250100质谱条件：多反应监测(mrm)扫描模式，带*为定量离子。进一步，步骤(1)中所述的提取是称取均匀制样的样品3.0g于50ml离心管中，加入15ml提取用0.01mol/l的乙酸铵缓冲盐溶液，充分涡旋混匀，4000r/min离心5min；转移上清液于另一50ml塑料离心管中，残渣重复提取一次，合并上清液至离心管中,分取10ml合并后的提取液用ph计调节ph值至6.50±0.05；将步骤(1)得到的水溶液加入1g硅藻土涡旋混匀，4000r/min离心5min；上清经混合型弱阳离子交换的固相萃取柱净化：该固相萃取柱预先用3ml甲醇、3ml水活化，上样，弃去流出液，再用3ml水，3ml甲醇淋洗，弃去淋洗液，抽干，先用2ml洗脱液1洗脱，洗脱液1为10％甲酸，甲醇+水＝1+1，收集洗脱液于10ml离心管，再加入2ml洗脱液2洗脱，洗脱液2为10％甲酸甲醇，抽干，合并洗脱液，漩涡混匀。收集后的洗脱液，过0.22μmptfe滤膜，上机检测。本发明的有益效果是：本发明采用分散固相萃取和固相萃取技术对样品进行预处理，利用亲水作用色谱质谱联用技术检测快速高效且结果准确的同时分析农兽产品中多种氨基糖苷化合物残留的方法。分散固相萃取是通过将吸附剂直接加入到样品溶液中，利用吸附剂吸附干扰，在通过离心的方法去除。固相萃取技术基本操作就是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物或杂质吸附，使样品的基体和干扰化合物与目标化合物分离，达到分离和富集目标化合物的目的；亲水作用色谱技术是一种对在反相色谱中保留性能较差的强极性分析物进行有效保留的模式，本发明采用cortecshilic柱对8种氨基糖苷类抗生素进行分析均可获得良好的保留，其灵敏度符合相关法规要求，对常见氨基糖苷类抗生素可进行准确定性和定量，并提高了检测分析通量。本发明采用乙酸铵缓冲盐溶液提取，使用ph计精确调节至合适的ph值后先使用硅藻土处理样液，硅藻土是一种很通用的吸附剂和助滤剂，能吸附一些极性干扰物，使滤液清亮，有利于后续的固相萃取净化。然后采用混合型弱阳离子交换的固相萃取柱，能够有效去除样品溶液中的一些有机酸及部分中性和碱性干扰物，净化液用高灵敏度的uplc-ms/ms检测，外标法定性、定量分析。具体实施方式以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。配制大观霉素、庆大霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、安普霉素、链霉素、双氢链霉素及新霉素8种氨基糖苷混合标准品溶液，向阴性果蔬(使用苹果、大头菜、菘菜、菠菜、青梗菜、土豆、芋仔、青刀豆、胡萝卜、圆葱、大姜、蒜薹、香葱共13种果蔬均匀制成的混合基质)、阴性猪精瘦肉、阴性鸡肉、阴性猪肝和阴性鲐鱼中分别添加检出限水平的标准品，添加水平均等于或小于我国的限量标准，每个含量水平重复6次。实施例1：取上述阴性果蔬样品，即使用苹果、大头菜、菘菜、菠菜、青梗菜、土豆、芋仔、青刀豆、胡萝卜、圆葱、大姜、蒜薹、香葱共13种果蔬均匀制成的混合基质，检测链霉素和双氢链霉素两种氨基糖苷化合物残留含量，步骤如下：(1)提取：称取均匀制样的果蔬样品3.0g到塑料离心管中，加入15ml提取用0.01mol/l的乙酸铵缓冲盐溶液，充分涡旋混匀，4000r/min离心5min；转移上清液于另一50ml塑料离心管中，残渣重复提取一次，合并上清液至离心管中,分取10ml合并后的提取液使用ph计调节ph值为6.50±0.05：先用10mol/l氢氧化钠溶液粗调，再用1mol/l氢氧化钠和0.1mol/l氢氧化钠微调，超出使用6mol/l盐酸溶液或0.1mol/l盐酸溶液回调，得到水溶液；(2)净化：将步骤(1)得到的水溶液加入1g硅藻土涡旋混匀，离心；上清经混合型弱阳离子交换的固相萃取柱净化；该固相萃取柱预先用3ml甲醇、3ml水活化，上样，弃去流出液，再用3ml水，3ml甲醇淋洗，弃去淋洗液，抽干，先用2ml洗脱液1洗脱，洗脱液1为10％甲酸，甲醇+水＝1+1，收集洗脱液于10ml离心管，再加入2ml洗脱液2洗脱，洗脱液2为10％甲酸甲醇，抽干，合并洗脱液，漩涡混匀。收集后的洗脱液，过0.22μmptfe滤膜，按下述所述仪器条件，上机检测。uplc/ms/ms检测：仪器条件：超高效液相流动相：a：250mm甲酸铵水溶液，甲酸铵水溶液为200ml水中加800ul甲酸；b：200mm甲酸铵有机相溶液，甲酸铵有机相溶液为200ml中加甲酸400ul，有机相为乙腈+甲醇+水＝6+1+3；离子源：esi+色谱柱：cortecshilic2.1cm×100mm×1.6μmcolumn色谱条件：time-minflow-ml/min％a％binitial0.2501000.20.2501001.50.2535654.50.2535654.520.250100质谱条件：多反应监测(mrm)扫描模式，带*为定量离子。所得到的果蔬中的链霉素和双氢链霉素残留含量的平均回收率和相对标准偏差rsd见表1。实施例2：取上述猪精瘦肉样品，检测其8种氨基糖苷化合物残留含量，步骤如下：(1)提取：称取均匀制样的猪精瘦肉样品3.0g到塑料离心管中，加入15ml提取用0.01mol/l的乙酸铵缓冲盐溶液，充分涡旋混匀，4000r/min离心5min；转移上清液于另一50ml塑料离心管中，残渣重复提取一次，合并上清液至离心管中,分取10ml合并后的提取液使用ph计调节ph值为6.50±0.05：先用10mol/l氢氧化钠溶液粗调，再用1mol/l氢氧化钠和0.1mol/l氢氧化钠微调，超出使用6mol/l盐酸溶液或0.1mol/l盐酸溶液回调，得到水溶液；(2)净化：将步骤(1)得到的水溶液加入1g硅藻土涡旋混匀，离心；上清经混合型弱阳离子交换的固相萃取柱净化；该固相萃取柱预先用3ml甲醇、3ml水活化，上样，弃去流出液，再用3ml水，3ml甲醇淋洗，弃去淋洗液，抽干，先用2ml洗脱液1洗脱，洗脱液1为10％甲酸，甲醇+水＝1+1，收集洗脱液于10ml离心管，再加入2ml洗脱液2洗脱，洗脱液2为10％甲酸甲醇，抽干，合并洗脱液，漩涡混匀。收集后的洗脱液，过0.22μmptfe滤膜，按下述所述仪器条件，上机检测。uplc/ms/ms检测：仪器条件：超高效液相流动相：a：250mm甲酸铵水溶液，甲酸铵水溶液为200ml水中加800ul甲酸；b：200mm甲酸铵有机相溶液，甲酸铵有机相溶液为200ml中加甲酸400ul，有机相为乙腈+甲醇+水＝6+1+3；离子源：esi+色谱柱：cortecshilic2.1cm×100mm×1.6μmcolumn色谱条件：质谱条件：多反应监测(mrm)扫描模式，带*为定量离子。所得到的猪精瘦肉的8种氨基糖苷化合物残留含量的平均回收率和相对标准偏差rsd见表1。实施例3：取上述鸡肉样品，检测其8种氨基糖苷化合物残留含量，步骤如下：(1)提取：称取均匀制样的鸡肉样品3.0g到塑料离心管中，加入15ml提取用0.01mol/l的乙酸铵缓冲盐溶液，充分涡旋混匀，4000r/min离心5min；转移上清液于另一50ml塑料离心管中，残渣重复提取一次，合并上清液至离心管中,分取10ml合并后的提取液使用ph计调节ph值为6.50±0.05：先用10mol/l氢氧化钠溶液粗调，再用1mol/l氢氧化钠和0.1mol/l氢氧化钠微调，超出使用6mol/l盐酸溶液或0.1mol/l盐酸溶液回调，得到水溶液；(2)净化：将步骤(1)得到的水溶液加入1g硅藻土涡旋混匀，离心；上清经混合型弱阳离子交换的固相萃取柱净化；该固相萃取柱预先用3ml甲醇、3ml水活化，上样，弃去流出液，再用3ml水，3ml甲醇淋洗，弃去淋洗液，抽干，先用2ml洗脱液1洗脱，洗脱液1为10％甲酸，甲醇+水＝1+1，收集洗脱液于10ml离心管，再加入2ml洗脱液2洗脱，洗脱液2为10％甲酸甲醇，抽干，合并洗脱液，漩涡混匀。收集后的洗脱液，过0.22μmptfe滤膜，按下述所述仪器条件，上机检测。uplc/ms/ms检测：仪器条件：超高效液相流动相：a：250mm甲酸铵水溶液，甲酸铵水溶液为200ml水中加800ul甲酸；b：200mm甲酸铵有机相溶液，甲酸铵有机相溶液为200ml中加甲酸400ul，有机相为乙腈+甲醇+水＝6+1+3；离子源：esi+色谱柱：cortecshilic2.1cm×100mm×1.6μmcolumn色谱条件：time-minflow-ml/min％a％binitial0.2501000.20.2501001.50.2535654.50.2535654.520.250100质谱条件：多反应监测(mrm)扫描模式，带*为定量离子。所得到的鸡肉的8种氨基糖苷化合物残留含量的平均回收率和相对标准偏差rsd见表1。实施例4：取上述猪肝样品，检测其8种氨基糖苷化合物残留含量，步骤如下：(1)提取：称取均匀制样的猪肝样品3.0g到塑料离心管中，加入15ml提取用0.01mol/l的乙酸铵缓冲盐溶液，充分涡旋混匀，4000r/min离心5min；转移上清液于另一50ml塑料离心管中，残渣重复提取一次，合并上清液至离心管中,分取10ml合并后的提取液使用ph计调节ph值为6.50±0.05：先用10mol/l氢氧化钠溶液粗调，再用1mol/l氢氧化钠和0.1mol/l氢氧化钠微调，超出使用6mol/l盐酸溶液或0.1mol/l盐酸溶液回调，得到水溶液；(2)净化：将步骤(1)得到的水溶液加入1g硅藻土涡旋混匀，离心；上清经混合型弱阳离子交换的固相萃取柱净化；该固相萃取柱预先用3ml甲醇、3ml水活化，上样，弃去流出液，再用3ml水，3ml甲醇淋洗，弃去淋洗液，抽干，先用2ml洗脱液1洗脱，洗脱液1为10％甲酸，甲醇+水＝1+1，收集洗脱液于10ml离心管，再加入2ml洗脱液2洗脱，洗脱液2为10％甲酸甲醇，抽干，合并洗脱液，漩涡混匀。收集后的洗脱液，过0.22μmptfe滤膜，按下述所述仪器条件，上机检测。uplc/ms/ms检测：仪器条件：超高效液相流动相：a：250mm甲酸铵水溶液，甲酸铵水溶液为200ml水中加800ul甲酸；b：200mm甲酸铵有机相溶液，甲酸铵有机相溶液为200ml中加甲酸400ul，有机相为乙腈+甲醇+水＝6+1+3；离子源：esi+色谱柱：cortecshilic2.1cm×100mm×1.6μmcolumn色谱条件：time-minflow-ml/min％a％binitial0.2501000.20.2501001.50.2535654.50.2535654.520.250100质谱条件：多反应监测(mrm)扫描模式，带*为定量离子。所得到的猪肝的8种氨基糖苷化合物残留含量的平均回收率和相对标准偏差rsd见表1。实施例5：取上述鲐鱼样品，检测其8种氨基糖苷化合物残留含量，步骤如下：(1)提取：称取均匀制样的鲐鱼样品3.0g到塑料离心管中，加入15ml提取用0.01mol/l的乙酸铵缓冲盐溶液，充分涡旋混匀，4000r/min离心5min；转移上清液于另一50ml塑料离心管中，残渣重复提取一次，合并上清液至离心管中,分取10ml合并后的提取液使用ph计调节ph值为6.50±0.05：先用10mol/l氢氧化钠溶液粗调，再用1mol/l氢氧化钠和0.1mol/l氢氧化钠微调，超出使用6mol/l盐酸溶液或0.1mol/l盐酸溶液回调，得到水溶液；(2)净化：将步骤(1)得到的水溶液加入1g硅藻土涡旋混匀，离心；上清经混合型弱阳离子交换的固相萃取柱净化；该固相萃取柱预先用3ml甲醇、3ml水活化，上样，弃去流出液，再用3ml水，3ml甲醇淋洗，弃去淋洗液，抽干，先用2ml洗脱液1洗脱，洗脱液1为10％甲酸，甲醇+水＝1+1，收集洗脱液于10ml离心管，再加入2ml洗脱液2洗脱，洗脱液2为10％甲酸甲醇，抽干，合并洗脱液，漩涡混匀。收集后的洗脱液，过0.22μmptfe滤膜，按下述所述仪器条件，上机检测。uplc/ms/ms检测：仪器条件：超高效液相流动相：a：250mm甲酸铵水溶液，甲酸铵水溶液为200ml水中加800ul甲酸；b：200mm甲酸铵有机相溶液，甲酸铵有机相溶液为200ml中加甲酸400ul，有机相为乙腈+甲醇+水＝6+1+3；离子源：esi+色谱柱：cortecshilic2.1cm×100mm×1.6μmcolumn色谱条件：time-minflow-ml/min％a％binitial0.2501000.20.2501001.50.2535654.50.2535654.520.250100质谱条件：多反应监测(mrm)扫描模式，带*为定量离子。所得到的鲐鱼的8种氨基糖苷化合物残留含量的平均回收率和相对标准偏差rsd见表1。表1农兽产品中氨基糖苷化合物回收率和相对标准偏差(n＝6)由表1中数据可以看出，农产品中链霉素、双氢链霉素及动物食品中8种氨基糖苷化合物残留的平均回收率在39.34％～109.79％，相对标准偏差rsd在2.20％～16.82％，回收率及相对标准偏差均符合农兽药残留检测标准。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12