滋肾育胎丸指纹图谱构建方法及其在质量检测中的应用与流程

本发明涉及中药测试
技术领域：
，特别是涉及滋肾育胎丸指纹图谱构建方法及其在质量检测中的应用。
背景技术：
：滋肾育胎丸是广州白云山中一药业有限公司根据20世纪60年代初著名中医妇科专家罗元恺教授多年的临床经验研制的中成药，由熟地黄、枸杞子、菟丝子、砂仁、人参、桑寄生、阿胶(炒)、首乌、艾叶、巴戟天、白术、党参、鹿角霜、续断、杜仲等15味中药组成，有补肾健脾、益气培元、养血安胎、强壮身体之功效。临床上主要用于防治习惯性流产、先兆流产并具有确切疗效。近年来，基于中医学“异病同治”“肾主生殖”等原理，滋肾育胎丸也常用于月经不调、不孕症的治疗。滋肾育胎丸质量标准收载于《中华人民共和国卫生部药品标准—中药成方制剂》第十六册(ws3-b-3113-98)，其原标准仅对党参、何首乌进行薄层鉴别，无含量测定项，专属性差，难以全面评估其质量优劣。基于其卓越的临床疗效，目前对滋肾育胎丸的研究多侧重于临床及药理学研究，对其质量研究，如含量测定、指纹信息等未见报道。因此，亟待开发一种滋肾育胎丸的质量检测方法。技术实现要素：基于此，本申请的目的之一是提供一种滋肾育胎丸指纹图谱的构建方法。该技术目的是通过以下技术方案实现的：一种滋肾育胎丸指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：对照品溶液制备：选取绿原酸、马钱苷、当药苷、马钱苷酸、川续断皂苷ⅵ中的任一种作为对照品，用有机溶剂溶解，制备对照品溶液；供试品溶液制备：选取多个批次的滋肾育胎丸，分别用有机溶剂溶解，制备供试品溶液；构建指纹图谱：采用高效液相色谱法分别对所述对照品溶液、供试品溶液进行测试，获得对照品色谱图、多个批次的滋肾育胎丸的色谱图；对所述多个批次的滋肾育胎丸的色谱图中的共有峰进行相似度分析、校正，获得参照指纹图谱；参照所述参照品色谱图中对照品色谱峰的保留时间，标注参照指纹图谱的色谱峰的化学成分，获得用于质量检测的滋肾育胎丸指纹图谱。在其中一些实施例中，所述对照品为当药苷。在其中一些实施例中，所述高效液相色谱法采用的条件包括：色谱柱选自kromasilc18、venusilhilic、bolitimatec18中的任一种；流动相为乙腈(a)-0.1～0.5％磷酸水溶液(b)；洗脱梯度为：0～12min，2％a；12～30min，2％～7％a；30～40min，7％～9％a；40～60min，9％～15％a；60～80min，15％～35％a；80～85min，35％～70％a；检测波长为250～260nm。在其中一些实施例中，所述高效液相色谱法采用的条件包括：流速为0.8～1.2ml·min-1，柱温为28～32℃，进样量8～12μl。在其中一些实施例中，所述色谱柱为kromasilc18，流动相为乙腈(a)-0.3％磷酸水溶液(b)，检测波长254nm；所述流速为1.0ml·min-1，柱温30℃，进样量10μl。在其中一些实施例中，所述色谱柱为kromasilc18(5μm，4.6×250mm)。在其中一些实施例中，所述有机溶剂选自甲醇或者体积含量为20～80％的甲醇水溶液；所述供试品溶液制备采用回流法或者超声法。优选采用体积含量为80％的甲醇水溶液。优选采用超声法，采用的超声时间优选为40min。本发明的目的还在于提供一种基于滋肾育胎丸指纹图谱的滋肾育胎丸的质量检测方法包括如下步骤：对照品溶液制备：选取绿原酸、马钱苷、当药苷、马钱苷酸、川续断皂苷ⅵ至少一种为对照品，用有机溶剂溶解，制备对照品溶液；待测品溶液制备：秤取待测滋肾育胎丸，用有机溶剂溶解，制备供试品溶液；质量检测：采用高效液相色谱法对所述对照品溶液、待测品溶液进行测试，获取对照品色谱图、待测品色谱图；分析所得待测品色谱图与所述滋肾育胎丸指纹图谱的共有峰、所得待测品色谱图与对照品色谱图。在其中一些实施例中，所述高效液相色谱法采用的条件包括：色谱柱选自kromasilc18、venusilhilic、bolitimatec18中的任一种；流动相为乙腈(a)-0.1～0.5％磷酸水溶液(b)；洗脱梯度为：0～50min，6％～11％a；50～52min，11％～17％a；52～80min，17％～28％a；80～95min，28％～40％a；检测波长为230～240nm、210～215nm。在其中一些实施例中，所述高效液相色谱法采用的条件包括：流速为0.8～1.2ml·min-1，柱温为28～32℃，进样量8～12μl。在其中一些实施例中，所述色谱柱为kromasilc18；所述流动相为乙腈(a)-0.1％磷酸水溶液(b)；所述检测波长235nm、212nm；所述流速为1.0ml·min-1，柱温30℃，进样量10μl。色谱柱优选为kromasilc18(5μm，4.6×250mm)。在其中一些实施例中，所述有机溶剂选自甲醇或者体积含量为20～80％的甲醇水溶液；所述供试品溶液制备采用回流法或者超声法。优选采用体积含量为80％的甲醇水溶液。优选采用超声法，超声时间优选为30min。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：发明人在长期试验及经验积累的基础上发现，选用绿原酸、马钱苷、当药苷、马钱苷酸、川续断皂苷ⅵ中的任一种作为参照物，特别是选取当药苷作为参照物，于合适的高效液相色谱条件下，就能够获得较好的指纹图谱，该指纹图谱中的色谱峰稳定并且包括马钱苷酸、绿原酸、马钱苷、当药苷、川续断皂苷ⅵ的色谱峰；这些种化学成分能够很好的体现滋肾育胎丸处方中作为臣药的续断；所建立的指纹图谱，能够较好地全面反映滋肾育胎丸的整体质量，重复性好、稳定性好、准确度高。并且，可用于考察生产稳定性及批间一致性。本申请提供的滋肾育胎丸的质量检测方法，选取马钱苷酸、绿原酸、马钱苷、当药苷、川续断皂苷ⅵ为对照品，并且配合采用合适的质检高效液相色谱条件，特别是该质检高效液相色谱条件不同于指纹图谱构建所用的高效液相色谱条件，不仅能够很好的检测滋肾育胎丸样品的化学成分种类，而且还能够精确测定滋肾育胎丸样品中上述五种化学成分的含量，很好地对待测滋肾育胎丸样品进行定性定量检测，重复性好、稳定性好、准确度高。附图说明图1为实施例1构建滋肾育胎丸对照指纹图谱；图2为实施例1中11批供试品指纹图谱；图3滋肾育胎丸样品在不同检测波长下检测所得色谱图；a.供试品；b.各个对照品；a.马钱苷酸；b.绿原酸；c.当药苷；d.马钱苷；e.川续断皂苷ⅵ。具体实施方式以下结合具体实施例对本发明的滋肾育胎丸指纹图谱构建方法及其在质量检测中的应用作进一步详细的说明。1.仪器bt125d型1/10万电子天平和bsa224s-cw型1/1万电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]，lc20a型高效液相色谱仪(日本岛津公司，包括lc-20at型溶液传输单元，sil-20a型自动进样器，spd-m20a型二极管阵列检测器和lcsolution色谱工作站)，det-50型高速万能粉碎机(温岭市大德中药机械有限公司)，xmtd-6000型水浴锅(北京长风仪器仪表有限公司)，kq-250de型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。2.材料滋肾育胎丸样品由广州白云山中一药业有限公司提供(批号：s00031，s00033，s00039，s00038，s00040，s00041，sf0001，v00013m，w000125，t01002，v00116)；川续断皂苷ⅵ，马钱苷酸(成都瑞芬思生物科技有限公司，批号分别为c-014-160323，x-071-160921，纯度分别为>98％，>98％)；马钱苷、当药苷、绿原酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号分别为111640-201005，111742-200501，110753-200212，纯度依次为≥99％，≥98％，≥98％)，规格为含量测定用。乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。实施例1、以当药苷为对照品建立滋肾育胎丸指纹图谱1.1供试品与对照品溶液的制备对照品溶液的制备：精密称取当药苷对照品适量，加甲醇溶解并定容，得质量浓度为0.1g·l-1的对照品溶液。供试品溶液的制备：精密称取滋肾育胎丸粉末(80目，下同)约1.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定质量，超声处理(功率250w，频率40khz)30min，放冷，称重，用甲醇补足失重，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得供试品溶液。1.2色谱条件：采用色谱柱kromasilc18(5μm，4.6×250mm)，流动相为乙腈(a)-0.3％磷酸水溶液(b)梯度洗脱(0～12min，2％a；12～30min，2％～7％a；30～40min，7％～9％a；40～60min，9％～15％a；60～80min，15％～35％a；80～85min，35％～70％a)，流速1.0ml·min-1，柱温30℃，进样量10μl，检测波长254nm。1.3指纹图谱方法学考察(1)精密度实验取供试品溶液(批号s00039)按1.2项下色谱条件连续进样6次，分别对共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行分析。结果各共有峰相对保留时间和相对峰面积rsd值分别小于0.2％和3.5％，表明仪器精密度良好。(2)稳定性实验取同一份供试品溶液(批号s00039)，分别于制备后的0，2，4，6，12，24h进样，按1.2项下色谱条件测定，分析共有峰的相对保留时间、相对峰面积。结果各共有峰相对保留时间、相对峰面积rsd值分别小于1.0％和5.0％，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。(3)重复性实验称取同一批次滋肾育胎丸样品(批号s00039)粉末约1.5g，共6份，精密称定，按照1.1项下方法制备供试品溶液，按1.2项下色谱条件测定，分别对共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行分析。结果各共有峰相对保留时间、相对峰面积rsd值分别小于2.0％和5.0％，表明重复性良好。1.4指纹图谱的建立及相似度评价取11批滋肾育胎丸(批号：s00031，s00033，s00038，s00039，s00040，s00041，sf0001，t01002，v00013m，v00116，w000125，后续编号依次为s1-s11)样品分别按照1.1项下方法制备样品溶液，按步骤1.2色谱条件测定；用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.1版本)进行分析，对色谱峰进行多点校正后，自动匹配，生成对照指纹图谱见图1。根据图1，其共标定15个共有峰，并指认出四个指标成分，分别为峰8马钱苷酸，峰10绿原酸，峰11当药苷，峰12马钱苷。其中以峰11当药苷为参照峰，各批滋肾育胎丸样品与参照指纹图谱比较相似度在0.957～0.999，说明各批次滋肾育胎丸具有良好的一致性，具体数据结果见表1，图2。表1滋肾育胎丸相似度评价s1s2s3s4s5s6s7s8s9s10s11对照s110.9950.9750.9830.9770.9800.9760.9790.9570.9800.9830.988s20.99510.9750.9830.9780.9800.9770.9900.9750.9900.9940.994s30.9750.97510.9990.9950.9980.9800.9760.9710.9800.9660.988s40.9830.9830.99910.9970.9990.9830.9810.9750.9900.9740.993s50.9770.9780.9950.99710.9970.9750.9740.9720.9800.9670.989s60.9800.9800.9980.9990.99710.9850.9790.9730.9800.9700.991s70.9760.9770.980.9830.9750.98510.9860.9700.9800.9760.987s80.9790.990.9760.9810.9740.9790.98610.9920.9900.9960.996s90.9570.9750.9710.9750.9720.9730.9700.99210.9900.9840.989s100.9770.9890.9810.9860.9830.9840.9760.9940.99410.9930.997s110.9830.9940.9660.9740.9670.970.9760.9960.9840.99010.993对照0.9880.9940.9880.9930.9890.9910.9870.9960.98910.9931实施例2、采用实施例1构建的指纹图谱对滋肾育胎丸进行质量检测2.1供试品与对照品溶液的制备对照品溶液得制备：精密称取绿原酸，马钱苷，当药苷，马钱苷酸，川续断皂苷ⅵ对照品适量，加甲醇溶解并定容，得质量浓度为0.0204，0.0121，0.0332，0.0532，0.158mg·ml-1的混合对照品液，备用。本实施例对照品种类的是参照实施例1构建的用于质量检测的滋肾育胎丸指纹图谱而选择的，主要是选取其中已经根据参照品色谱峰的保留时间而被标注的化学成分。供试品溶液的制备：精密称取滋肾育胎丸粉末约1.0g，精密称定，置于50ml具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇20ml，密塞，称定质量，超声处理(功率250w，频率40khz)30min，放冷，称重，80％甲醇补足重量，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得。2.2色谱条件采用色谱柱kromasilc18(5μm，4.6×250mm)，流动相为乙腈(a)-0.1％磷酸水溶液(b)梯度洗脱(0～50min，6％～11％a；50～52min，11％～17％a；52～80min，17％～28％a；80～95min，28％～40％a)，流速1.0ml·min-1，柱温30℃，进样量10μl，检测波长235nm，212nm。在上述色谱条件下，样品中绿原酸，马钱苷，当药苷，马钱苷酸，川续断皂苷ⅵ色谱峰的保留时间与对照品一致，5个成分的色谱峰能达到较好的分离，且纯度检查符合要求。样品中其他成分对待测成分的测定无干扰。见图3。2.3含量测定方法学考察(1)线性关系的考察分别精密吸取2.1项下混合对照品溶液1，2，5，10，15，20μl注入高效液相色谱仪，按2.2项下色谱条件测定。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数，见表2。结果表明，5个成分在一定质量浓度内与峰面积呈较好的线性关系。表2滋肾育胎丸中5种指标成分的线性关系考察目标成分回归方程r线性范围/ng马钱苷酸y＝1440.3x+118050.999253.2～1064当药苷y＝1256.5x+319.090.999933.2～664马钱苷y＝1507.9x+34.2230.999912.1～242绿原酸y＝1301.6x+844.210.999920.4～408川续断皂苷ⅵy＝240.49x+1324.20.9999129～2580(2)精密度试验取同一份混合对照品溶液，按2.2项下色谱条件连续进样6次。结果绿原酸、马钱苷酸、当药苷、马钱苷、续断皂苷ⅵ峰面积的rsd分别为0.85％，0.93％，2.03％，0.66％，0.68％。表明仪器精密度良好。(3)稳定性试验取同一份滋肾育胎丸供试品溶液(批号s00038)，分别于样品制备后的0，2，4，6，12，24h进样，按2.2项下色谱条件测定。结果样品溶液中绿原酸，马钱苷酸，当药苷，马钱苷，续断皂苷ⅵ五种成分峰面积rsd分别为3.85％，0.51％，0.79％，3.01％，1.32％。表明24h内，供试品溶液稳定性良好。(4)重复性试验称取同一批次滋肾育胎丸样品(批号s00038)粉末约1.0g，共6份，精密称定，按3.2.2项下方法制备供试品溶液，按3.1项下色谱条件测定。结果绿原酸，马钱苷酸，当药苷，马钱苷，续断皂苷ⅵ含量的rsd分别为0.94％，1.02％，0.78％，1.48％，1.63％。表明实验重复性良好。(5)加样回收率试验称取已知含量的滋肾育胎丸粉末9份，每份约0.5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，分别加入一定量的对照品溶液，按3.2.1项下方法制备供试品溶液，按3.1项下色谱条件测定。结果马钱苷酸，当药苷，绿原酸，马钱苷，续断皂苷ⅵ五种成分的加样回收率均值在96.61％～103.55％，rsd均<3.0％。表明该方法的准确度良好。结果见表3。表3滋肾育胎丸中5种成分加样回收率测定(n＝9)2.4样品测定取各批次滋肾育胎丸粉末，按2.1项下方法制备供试品溶液，每个样品平行3份，按2.2项下色谱条件测定。结果见表4。11批次的滋肾育胎丸中马钱苷酸，绿原酸，当药苷，马钱苷，川续断皂苷ⅵ的质量分数均不低于0.61‰，0.27‰，0.46‰，0.19‰，0.81‰。表4滋肾育胎丸样品中5种成分的质量分数(n＝3)‰批号马钱苷酸绿原酸当药苷马钱苷川续断皂苷ⅵs000310.610.270.460.201.17s000330.650.310.470.191.31s000390.860.430.590.221.99s000380.890.460.590.232.02s000400.900.480.590.232.10s000410.900.470.590.221.99sf00010.930.390.650.241.70v00013m1.450.510.880.291.60w001250.810.320.680.240.81t010021.080.440.760.280.97v001161.010.460.840.331.34采用本实施例提供的质量检测方法进行待测样品测试时，如果待测样品的色谱峰与本申请构建的用于质量检测的滋肾育胎丸指纹图谱一致，则说明待测样品所含的化学成分种类是符合要求的；如果待测样品色谱峰中绿原酸、马钱苷、当药苷、马钱苷酸、川续断皂苷ⅵ的色谱峰面积与对照品一致，则说明待测样品所含化学成分的含量是符合要求的。实施例3、以马钱苷作为对照品构建指纹图谱并以此对滋肾育胎丸进行质量检测3.1构建指纹图谱：本实施例构建指纹图谱的步骤同实施例1，变化之处在于，本实施例采用马钱苷作为对照品构建指纹图谱。3.2进行质量检测：以本例3.1项构建的指纹图谱为参照图谱，对滋肾育胎丸进行质量检测，质量检测的步骤同实施例2。本实施例指纹图谱构建结果同实施例1，参见图1和图2。本实施例对批号为s00031的滋肾育胎丸进行质量检测，结果同表4。在实施技术方案的过程中，发明人还对技术方案进行了如下的优选：(1)供试品制备方法的优选:1)预试验对滋肾育胎丸指纹图谱及含量测定的供试品溶液制备方法进行了优选，分别考察了回流法、超声法2种提取方式对滋肾育胎丸的提取效果。结果表明2种提取方法提取效果无显著性差异，超声法提取简便易行，故选择超声提取。2)本实验对提取溶剂亦进行了考察，比较了甲醇，80％甲醇，60％甲醇，40％甲醇，20％甲醇共5种溶剂的提取效率，结果表明滋肾育胎丸样品以甲醇为提取溶剂时色谱峰数量较多，因此选用甲醇为滋肾育胎丸指纹图谱样品的提取溶剂。而以80％甲醇为提取溶剂时滋肾育胎丸中五个成分提取效率均较高，因此选择80％甲醇为滋肾育胎丸含量测定提取溶剂。此外，还考察了超声时间(20，30，40min)，结果优选了滋肾育胎丸指纹图谱测定时为超声40min。而滋肾育胎丸含量测定供试品溶液超声提取30min五个目标成分已基本提取完全。(2)色谱条件的选择:1)滋肾育胎丸为15味药的复方制剂，各成分化学性质差别较大，实验采用梯度洗脱方式进行分离洗脱。实验室对不同填料的色谱柱进行了优选，考察3种色谱柱(kromasilc18，venusilhilic，bolitimatec18)对各待测成分的分离效能，结果显示kromasilc18色谱柱寿命较长，基线平稳，且各待测成分的峰形较好、分离度较大，故选择该柱作为分离柱。2)实验采用乙腈-磷酸系统作为流动相，分别考察了0.1％，0.2％，0.3％，0.5％磷酸对色谱峰峰形的影响。滋肾育胎丸指纹图谱色谱图在乙腈-0.3％磷酸水溶液系统下洗脱各共有峰峰形较好；乙腈-0.1％磷酸水溶液可使滋肾育胎丸中五个成分达到基线分离，因此选择乙腈-0.1％磷酸水溶液系统作为滋肾育胎丸含量测定的流动相。(3)检测波长的选择：采用二极管阵列检测器对滋肾育胎丸样品在190～400nm进行紫外吸收全波长扫描。滋肾育胎丸指纹图谱色谱图在254nm波长下基线平稳，色谱峰数量较多，信息量较大，因此选择254nm为滋肾育胎丸指纹图谱的检测波长。而马钱苷，马钱苷酸的紫外最大吸收波长a均为235nm，当药苷最大吸收波长为241nm，绿原酸紫外最大吸收波长为327nm，川续断皂苷ⅵ紫外最大吸收波长为212nm。为了兼顾滋肾育胎丸5个成分的最大吸收并具备良好的基线，最终检测波长确定川续断皂苷ⅵ为212nm，其他4个成分均在235nm处检测，因此确定滋肾育胎丸含量测定的检测波长为235nm和212nm。本实验首次建立的指纹图谱方法，可用于考察生产稳定性及批间一致性，并鉴别评价滋肾育胎丸的品质优劣；本研究建立的同时测定五个指标成分的含量测定方法，重复性好，稳定性好，准确度高，可精确测定滋肾育胎丸样品中指标成分的含量。综之，本发明以指纹图谱定性结合多成分同步测定方法建立滋肾育胎丸的质量控制标准，从整体到局部化学成分的分析对滋肾育胎丸的质量进行质量控制，为完善本品的质量标准和临床用药安全提供依据，也为进一步的谱效学研究奠定基础。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页12