用于磁镊装置的磁球坐标的校准方法和校准装置与流程

本发明涉及磁镊装置，特别涉及一种用于磁镊装置的磁球坐标的校准方法和校准装置。
背景技术：
：单分子磁镊操纵技术近年来逐渐成为研究生物大分子的热门工具，它能有效避开大量分子的平均效应，选取功能完整的分子进行纳米精度的操纵与测量。单分子磁镊操纵技术通过磁铁与超顺磁性磁球的距离来控制磁球受到的磁力大小，并通过监测磁球的高度变化量来研究生物大分子的构象变化。图1是现有技术的磁镊装置的结构示意图。如图1所示，磁镊装置包括照明光源1、永磁铁2、样品槽3、倒置物镜4、压电控制器5、ccd相机7和中央控制台8。其工作原理如下：照明光源1发出的光(图1中虚线箭头所示)穿过永磁铁2之间的缝隙照射到样品槽3中的磁球9上，倒置物镜4对磁球9进行成像，ccd相机7中接收磁球的衍射图像，并将衍射光信号转换为电信号后传递给中央控制台8，中央控制台8将磁球9的图像显示出来并计算磁球9的坐标。在图1所示的磁镊装置中，将倒置物镜4的焦平面定义为xy坐标平面，垂直于xy坐标平面为z坐标。基于光的衍射原理，磁球9的图像是衍射环，中央控制台8通过质心法计算衍射环的图心位置，从而获得磁球9的x坐标和y坐标。但是该方法无法精确测量磁球9的x坐标和y坐标。如果照明光源1照射在磁球9上的光照不均匀，则磁球9的衍射环的图像的光照也不均匀。图2示出了磁球在不均匀光照下的衍射环图像，如图2所示，衍射环上右下方的平均光强要略强于左上方的平均光强。由于质心法是计算加权平均，在光照不均匀时误差较大。因此通过质心法计算出来的图心(参见图2中的黑点)并不在衍射环的中心，而是相对于衍射环的中心朝右下方偏移。采用现有的校准方法对磁球9的中心进行校准，校准后的磁球中心仅在图2所示的黑点附近区域。由此校准后的磁球中心偏离衍射环的中心较远，造成较大的误差。再次参考图1所示，现有技术的磁镊装置为了精确测量磁球9的z坐标，在靠近倒置物镜4的盖玻片11的内表面上铺有直径为1微米的聚苯乙烯球15，并以聚苯乙烯球15为参考计算磁球9的z坐标的变化量。通过在z方向上移动永磁铁2并旋转永磁铁2以改变磁场的强度和方向，从而控制磁球9的高度。当磁球9的z坐标改变时，衍射环图像也将相应地改变，通过不同衍射环的径向光强分布确定磁球9的z坐标的变化量。但是，在长时间测量过程中，磁镊装置的热漂移会导致样品槽3的z坐标发生改变，从而严重影响信号的辨识与精度。技术实现要素：针对现有技术存在的上述技术问题，本发明提供了一种用于磁镊装置的磁球坐标的校准方法，包括下列步骤：步骤1)通过质心法获得所述磁球的衍射环图像的图心的初始位置；步骤2)获得所述衍射环图像在第一坐标轴方向和第二坐标轴方向上的径向光强分布，将所述衍射环图像在第一坐标轴方向上的径向光强分布与其镜像分布做互相关运算以校准所述磁球在第一坐标轴上的坐标，将所述衍射环图像在第二坐标轴方向上的径向光强分布与其镜像分布做互相关运算以校准所述磁球在第二坐标轴上的坐标。优选的，在所述步骤2)中包括：步骤21)以所述图心的初始位置为xy坐标系中的坐标原点；步骤22)获得所述衍射环图像在第一坐标轴方向上的径向光强分布，将所述衍射环图像在第一坐标轴方向上的径向光强分布相对于第二坐标轴做镜像得到镜像分布；步骤23)将第一坐标轴方向上的径向光强分布与其镜像分布做互相关运算；步骤24)根据互相关运算得到的互相关曲线的相关性最高值对应的第一坐标轴上的坐标数值校准所述磁球在第一坐标轴上的坐标。优选的，在所述步骤22)中包括：步骤221)在以所述坐标原点为圆心的同心圆的每一个上选取多个采样点，其中所述多个采样点分布的全部象限或部分象限关于第二坐标轴对称；步骤222)将第二坐标轴一侧的采样点的光强叠加后求平均值，将第二坐标轴另一侧的采样点的光强叠加后求平均值，以得到所述多个采样点在第一坐标轴方向上的径向光强分布。优选的，在所述步骤23)中，所述互相关运算的公式为其中cxx为互相关数值，r为径向光强分布在第一坐标轴上的坐标，p(-r)是径向光强，fft为快速傅里叶变换，ifft为快速傅里叶逆变换，是p(-r)的傅里叶变换的复共轭。优选的，在所述步骤24)中，所述磁球中心在第一坐标轴上的校准坐标为x0+2*xcor/π，其中x0为磁球在第一坐标轴上的初始坐标，π为圆周率，xcor为cxx中的最高值对应的第一坐标轴上的坐标。优选的，在所述步骤221)中，所述多个采样点平均分布在xy坐标系的四个象限中，所述四个象限中的每一个象限中的部分或全部采样点具有相同的极角。优选的，在所述步骤222)中，所述多个采样点中的每一个的光强由公式i＝(a*b+b*a+c*d+d*c)/4获得，其中a、b、c、d分别为采样点的上下左右四个像素点的光强，a、b、c、d分别为采样点距离上下左右四个像素点的距离。本发明还提供了一种用于磁镊装置的磁球的高度确定方法，所述磁镊装置包括物镜和样品槽，包括下列步骤：执行如上所述的用于磁镊装置的磁球坐标的校准方法，将磁球中心的校准位置作为校准原点，在不改变所述磁球的位置的情况下调节所述物镜和样品槽的间距，获得所述磁球在多个衍射环图像下的径向光强分布并生成查找表；获得所述磁球在当前位置的衍射环图像的径向光强分布；将所述磁球的衍射环图像的径向光强分布与所述查找表中的每一行的元素的光强值相减并计算卡方值，其中卡方值的计算公式为其中k为卡方值，r为径向光强分布的最远采样点离所述校准原点的距离，i(r)为磁球的衍射环图像上距离所述校准原点为r时对应的光强，il(r)为查找表中距离所述校准原点为r时对应的光强。优选的，所述查找表中的一行元素的数值与所述多个衍射环图像中的一个的径向光强的数值相对应，且所述查找表中的一行元素的列坐标与所述校准原点距离所述多个衍射环图像中的一个的径向距离相对应。本发明还提供了一种用于磁镊装置的热漂移修正方法，所述磁镊装置包括倒置物镜、样品槽以及固定在所述样品槽中的参考球，所述热漂移修正方法包括：基于如上所述的磁球的高度确定方法获得所述参考球的高度变化值；根据所述参考球的高度变化值调节所述倒置物镜的高度，以使得所述倒置物镜和所述参考球的间距不变。优选的，所述磁镊装置还包括与所述倒置物镜固定连接的压电控制器，以及与所述压电控制器电连接的比例积分控制器或比例积分微分控制器，所述参考球的高度变化值作为所述比例积分控制器或比例积分微分控制器的误差信号，所述比例积分控制器或比例积分微分控制器控制所述压电控制器的电压以使得所述压电控制器的高度变化值与所述参考球的高度变化值相同。优选的，包括存储器和处理器，所述存储器存储了被所述处理器执行的计算机程序，所述处理器执行所述计算机程序时，使得所述校准装置执行如上所述的校准方法。本发明还提供了一种用于磁镊装置的磁球的高度确定装置，包括存储器和处理器，所述存储器存储了被所述处理器执行的计算机程序，所述处理器执行所述计算机程序时，使得所述高度确定装置执行如上所述的高度确定方法。本发明还提供了一种用于磁镊装置的热漂移修正装置，包括存储器和处理器，所述存储器存储了被所述处理器执行的计算机程序，所述处理器执行所述计算机程序时，使得所述热漂移修正装置执行如上所述的热漂移修正方法。本发明的校准装置能够精确测量磁球的三维坐标，生成磁球的查找表，并基于查找表实时修正磁镊装置的热漂移，显著提高了实验数据的精度，实现长时间研究生物单分子的构象变化。附图说明以下参照附图对本发明实施例作进一步说明，其中：图1是现有技术的磁镊装置的结构示意图。图2示出了磁球在不均匀光照下的衍射环图像。图3是磁镊装置中的磁球的衍射环图像。图4示出了根据本发明的第一个实施例的采样示意图。图5示出了磁球的衍射环图像在x轴方向上的径向光强分布及其镜像分布。图6是对图3示出的衍射环图像在x轴方向上的径向光强分布及其镜像分布基于校准横坐标得到的互相关曲线。图7示出了在图2所示的衍射环上采样的示意图。图8示出了选取一个采样点计算光强的示意图。图9示出了图3所示的磁球的衍射环的径向光强分布。图10是基于查找表生成的灰度图。图11示出了根据本发明的第二个实施例的采样示意图。图12示出了根据本发明第三个实施例的采样示意图。图13示出了根据本发明第四个实施例的采样示意图。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图通过具体实施例对本发明进一步详细说明。图3是磁镊装置中的磁球的衍射环图像。从图3可以看出，磁球的衍射环图像是一个正方形灰度图(大小为n*n像素点)。将衍射环图像转换为n*n的数字矩阵，其中矩阵中每个元素的数值对应衍射环图像中的像素点的灰度值(或光强)。首先，通过质心法计算磁球的衍射环图像的图心的初始位置(x0，y0)。质心法的计算公式如下：其中i，j为矩阵下标，iij表示第i行第j个元素的数值(即像素点的光强)。计算得到衍射环图像的图心的初始位置(x0，y0)后，利用象限插值法对衍射环图像圆心的初始位置进行修正。根据本发明的一个实施例，其具体方法如下：图4示出了根据本发明的第一个实施例的采样示意图。以上述计算出的初始位置(x0，y0)为xy坐标系中的坐标原点，将矩阵划分为xy坐标系下的4个象限。以坐标原点为圆心，在不同半径的圆上分别选取多个不同的像素点，比如：在第一半径的圆上选取12个像素点，其中每个象限各选取3个像素点；在第二半径的圆上选取12个像素点，其中每个象限各选取3个像素点……依次类推，在第七半径的圆上选取12个像素点，其中每个象限各选取3个像素点。每一个象限具有21个像素点，其中7个像素点在过坐标原点的一条直线上，另外7个像素点在过坐标原点的另一条直线上，剩余7个像素点在过坐标原点的又一条直线上。将位于第一象限和第四象限的相同半径上的像素点的光强叠加后求平均值，将位于第二象限和第三象限的相同半径上的像素点的光强叠加后求平均值，从而得到x轴方向上的径向光强分布p(r)，参见图5中的实线所示。将x轴方向上的径向光强分布p(r)相对于y轴做镜像得到镜像分布p(-r)，即p(-r)＝p(r)，参见图5中的虚线所示。将x轴方向上的径向光强分布p(r)与其镜像分布p(-r)做互相关运算，互相关运算的公式如下：其中cxx为计算得到的互相关数值，r为径向光强分布的x轴坐标，p(-r)是径向光强，fft为快速傅里叶变换，ifft为快速傅里叶逆变换，是p(-r)的傅里叶变换的复共轭。图6是对图3示出的衍射环图像在x轴方向上的径向光强分布及其镜像分布基于校准横坐标得到的互相关曲线的一个示例，其光强最高点(即相关性最高值)对应的坐标xcor为-0.05。磁球中心的校准横坐标x由公式x＝x0+2*xcor/π计算得出。其中，π为圆周率，x0为磁球的初始横坐标。磁球中心的校准纵坐标y的校准方式与校准横坐标x的校准方法基本相同，区别在于，将第一和第二象限的相同半径上的像素点的光强叠加后求平均值，将第三和第四象限的相同半径上的像素点的光强叠加后求平均值，从而得到y轴方向上的径向光强分布，再与其镜像分布做互相关运算即可得到校准纵坐标y。由此，最终得到磁球中心的校准位置(x，y)。下面进一步说明利用上述象限插值法校准磁球中心位置所带来的效果。为了便于对比，同样以图2所示的磁球在不均匀光照下的衍射环图像为例进行说明。图7示出了在图2所示的衍射环上采样的示意图。在衍射环上以质心法计算的图心为初始原点，并将衍射环分成4个象限(图7中的虚线所示)。在以初始原点为圆心的同心圆的每一个上采集12个采样点的光强值，其中所选取的采样点包括衍射环中心或其附近处的光强信息，将径向光强分布与其镜像分布互相关运算后，由于互相关计算的原理是计算对称中心，而磁球衍射环的球对称性保证了校准后的图心位置将朝向对称中心，即衍射环中心靠近，从而实现了准确校准磁球的中心位置。由此可知，即便照明光源1的光线强度不均匀，本发明的校准方法也能准确对磁球的中心位置进行校准。降低了对磁镊装置的性能要求。根据本发明的一个实施例，将坐标系中所有采样点的坐标极坐标化，即将采样点相对于初始原点的坐标(x，y)变成极坐标(r，θ)(转换关系为：y＝r*sinθ，x＝r*cosθ)，然后获得或计算出与初始原点相距相同距离、不同极角θ之处的光强，其中如果在每一个象限中的部分采样点具有相同的极角θ(即在过坐标原点的直线上)，可以极大地简化互相关运算的工作量。图8示出了根据本发明的一个实施例选取一个采样点计算光强的示意图。如图8所示，假设采样点为图8中的o点处，其上下左右四个像素的光强分别为a、b、c、d，其距离上下左右四个像素的距离分别为a、b、c、d，则采样点o的光强i由公式i＝(a*b+b*a+c*d+d*c)/4计算得出。如果采样点之间的距离小于一个像素，将矩阵中所选取的采样点的坐标极坐标化后，互相关运算后可以将磁球中心的校准坐标的精度提高到小于一个像素以内。由此可以实现亚像素级别的精度调节和校准。基于校准后的图心位置，下面将根据本发明的一个实施例，详细介绍基于查找表确定磁球的高度变化。以磁球中心的校准位置(x，y)为校准原点，在以校准原点为圆心的同心圆的每一个上选取多个(例如200)采样点，计算这些采样点的光强的平均值，即将每一个同心圆上的所有采样点的光强叠加后求平均值，从而得到距离校准原点为r时的光强值i(r)。再通过如下归一化公式计算得到归一化的光强i其中，imean是衍射环图像的光强均值，imax是衍射环图像中最大光强值。最终获得磁球的衍射环图像的径向光强分布，图9示出了图3所示的磁球的衍射环的径向光强分布，其中纵坐标是归一化的光强i。由于在测量过程中，研究者基于观测磁球高度的变化量间接反应出单分子发生的变化，因此z值的原点并不重要。为了方便判断磁球的z坐标的改变量，将测量初始时刻磁球的z值定义为z轴零点，并将图9所示的径向光强分布生成如下所示的查找表中的一行数据。0.80.91.01.11.21.31.41.51.6-0.294-0.0860.1040.2360.2890.2660.1860.077-0.0291.71.81.92.02.12.22.32.42.5-0.11-0.151-0.149-0.114-0.0580.0050.0490.0770.0822.62.72.82.93.00.0670.0400.008-0.020-0.038本领域的技术人员可知，磁球的衍射环图像随着磁球高度的变化而发生改变。本发明在不改变磁球的位置的情况下，调节倒置物镜4的位置以增加或减小倒置物镜4与样品槽3之间的距离z，再次获得磁球9的衍射环图像及其径向光强分布，并生成矩阵中的一行。以此类推，对于各个不同的距离z，生成查找表。该查找表反应了磁球9的衍射环图像的径向光强分布与磁球9相距倒置物镜4的距离z的对应关系。为了便于直观地观测，将查找表生成矩阵，矩阵中的一行元素的数值与衍射环的径向光强的数值相对应，且矩阵中该行元素的列坐标与磁球中心的校准位置距离衍射环的径向距离相对应。图10是基于查找表生成的灰度图，其中灰度图中每个像素的灰度值与查找表中的元素的光强值相对应。基于图10所示的灰度图，能够直观地判断磁球9的高度。将磁球9的衍射环图像的径向光强分布与查找表的灰度图中的每一行像素点的光强相对比，与衍射环的径向光强分布最接近的一行像素点对应的z值即为磁球的z坐标(即当前高度)。在本发明的另一个实施例中，将磁球9的衍射环图像的径向光强分布与查找表中的每一行的元素的光强值相减并计算卡方值，其中卡方值的计算公式如下：其中k为卡方值，r为径向光强分布最远采样点离校准原点的距离，i(r)为磁球衍射环上距离校准原点为r时对应的光强，il(r)为查找表中距离校准原点为r时对应的光强。将查找表中每一行所对应的卡方值计算出来，其中与最小的卡方值对应的z值即为磁球9当前的z值。通过卡方值来确定磁球9的z值，能够准确确定z值，不会因为查找表中的某些元素的光强值的误差造成较大的测量偏差。根据本发明的一个实施例，在对磁球9的坐标进行测量的过程中，同时基于上述方法确定聚苯乙烯参考球15的z坐标。通过实时测量聚苯乙烯参考球15的高度变化值，控制压电控制器5的电压，使得固定在压电控制器5上的倒置物镜4的高度发生同样变化，确保倒置物镜4和聚苯乙烯参考球15之间的距离保持不变，从而消除了热漂移对磁镊装置的位移带来的影响，提高了测量的精确度。上述的热漂移修正方法能够实时修正磁镊装置的热漂移，显著提高了实验数据的精度。另外在消除了热漂移的基础上，能够快速、实时确认磁球的位置在永磁铁的操作下发生的变化，并能够长时间研究生物单分子的构象变化，例如长时间研究蛋白质与核酸相互作用、生物大分子的折叠与组装、生物分子马达的动力学等。图11示出了根据本发明的另一个个实施例的采样示意图。其与图4基本相同，区别在于，在每一个同心圆上选取4个像素点，4个像素点分别处于四个象限中。每个象限中的7个像素点在过原点的直线上，即具有相同极角θ，这样可以简化互相关运算。图12示出了根据本发明再一个实施例的采样示意图。其与图4基本相同，区别在于，在每一个同心圆上选取6个像素点，其中三个像素点在第一象限中，另外三个像素点在第二象限中。第一象限中的21个像素点中的7个像素点具有第一极角，另外7个像素点具有第二极角，剩余7个像素点具有第三极角。同样在第二象限中的像素点具有三个不同的极角。图13示出了根据本发明又一个实施例的采样示意图。其与图4基本相同，区别在于，在每一个同心圆上选取6个像素点，其中三个像素点在第三象限中，另外三个像素点在第四象限中。其中在第三象限中的像素点具有三个不同的极角，在第四象限中的像素点具有三个不同的极角。在本发明的其他实施例中，在对磁球中心的x坐标校准过程中，采样区域或采样区域的一部分关于y轴对称，例如在四个象限中的任意三个象限采样。在本发明的其他实施例中，在对磁球中心的y坐标校准过程中，采样区域或其采样区域的一部分关于x轴对称。例如采样区域为第一和第四象限，或为第二和第三象限，或为四个象限中的任意三个象限，或为四个象限。基于本发明的磁球中心的校准方法，并不要求在四个象限中都选取采样点，由此当磁球的衍射环图像的部分区域上有污点时，在远离污点处选择采样点即可。因此本发明的校准方法降低了衍射环图像的质量要求，并且能够校准的磁球的种类和数量更多。在本发明的一个实施例中，采用比例积分控制器或比例积分微分控制器来修正倒置物镜4因热漂移需要移动的位移。将聚苯乙烯参考球15的z坐标的变化量作为比例积分控制器或比例积分微分控制器的误差信号，控制压电控制器5的电压以调节其高度，通过压电控制器5间接地控制倒置物镜4在热漂移下需要移动的位移，使得倒置物镜4的高度变化值与聚苯乙烯参考球15的高度变化值相同。克服磁镊装置在使用过程中的漂移，提高了系统的稳定性和数据的精度。本发明还提供了一种用于磁镊装置的磁球坐标的校准装置，包括存储器和处理器，所述存储器存储了被所述处理器执行的计算机程序，所述处理器执行所述计算机程序时，使得所述校准装置执行如上所述的校准方法。本发明还提供了一种用于磁镊装置的磁球的高度确定装置，包括存储器和处理器，所述存储器存储了被所述处理器执行的计算机程序，所述处理器执行所述计算机程序时，使得所述高度确定装置执行如上所述的高度确定方法。本发明还提供了一种用于磁镊装置的热漂移修正装置，包括存储器和处理器，所述存储器存储了被所述处理器执行的计算机程序，所述处理器执行所述计算机程序时，使得所述热漂移修正装置执行如上所述的热漂移修正方法。虽然本发明已经通过优选实施例进行了描述，然而本发明并非局限于这里所描述的实施例，在不脱离本发明范围的情况下还包括所作出的各种改变以及变化。当前第1页12