本发明涉及中药领域，特别涉及芦根提取物的鉴别方法。
背景技术：
：中药提取物为基原明确、化学成分组合比例相对固定的提取物，是具有一致性的天然提取物。它可以替代原药材入药并保证具有安全、稳定的物化特性，既是一种提取物也是一种新的药物剂型，同时可作为中成药gmp生产的标准化投料的原料药。芦根提取物是芦根药材采用适宜的工艺制备而成，其主要成分为酚酸类物质，主要包括对香豆酸、阿魏酸、咖啡酸等，具有清热、止呕、抗菌消炎的作用，与原药材芦根用来治疗发热、止呕的功效相吻合。苇根作为芦根的伪品，因名称、外观性状及药效上与芦根的相似性，一些厂家因利益驱使或缺乏专业的中药材鉴别能力，将伪品药材作为原料或者掺入原料中进行提取。苇根提取物和与芦根提取物性状相似，研究发现主要成分均含有对香豆酸、阿魏酸，但其功效与芦根提取物有一定的差别，将其掺入芦根提取物销售会影响芦根提取物的功效，严重侵犯消费者权益。由于苇根提取物与芦根提取物有相同的主要成分，仅通过对对香豆酸或阿魏酸含量测定很难鉴别芦根提取物中是否掺有苇根提取物。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供一种芦根提取物的鉴别方法。该方法可检测芦根提取物中是否掺有苇根提取物，并且特异性好、灵敏度高、准确可靠，当芦根中掺入质量分数5％及以上的苇根时，其提取物中的苇根提取物可被检测出。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种芦根提取物的鉴别方法，包括以下步骤：步骤1：分别获得芦根提取物标准品和苇根提取物标准品的特征图谱；步骤2：获得芦根提取物特征峰和苇根提取物特征峰；步骤3：取待测样品检测，根据所述检测结果鉴别获得所述待测样品是否为芦根提取物和/或该待测样品中是否掺杂有苇根提取物。在本发明的一些具体实施方案中，所述检测的方法为高效液相色谱法；其色谱条件为：固定相为十八烷基硅烷键合硅胶柱；采用流动梯度洗脱，流动相a为乙腈，流动相b为0.5％磷酸二氢钾溶液(ph＝2.15)，a:b＝7％～22％：93％～78％；流速0.8～1.2ml/min；检测波长为270～280nm；色谱柱温度为25～35℃。在本发明的一些具体实施方案中，所述色谱条件具体为：洗脱液的a、b相变化为：0～15min，a相7％；15～35min，a相7％～12％；35～55min，a相12％～15％；55～70min，a相15％～19％；70～80min，a相19％～22％；80～85min，a相22％；流速1.0ml/min；检测波长为275nm；色谱柱温度为30℃。在本发明的一些具体实施方案中，所述芦根提取物特征峰共7个，其保留时间范围为15～50min；所述苇根提取物特征峰共6个，其保留时间范围为55～85min。在本发明的一些具体实施方案中，所述芦根提取物特征峰共7个，其保留时间为17.1±2min、23.8±2min、26.7±2min、28.3±2min、35.1±2min、39.2±2min和46.6±2min；所述苇根提取物特征峰共6个，其保留时间为59.6±2min、65.0±2min、71.5±2min、75.0±2min、78.4±2min和80.0±2min。在本发明的一些具体实施方案中，所述鉴别的标准为：i)、如果所述检测结果中包括全部所述芦根提取物特征峰，则所述待测样品为芦根提取物；反之，如果所述检测结果中仅包括部分所述芦根提取物特征峰，则所述待测样品不是芦根提取物；ⅱ)、如果所述待测样品中包括全部所述芦根提取物特征峰，且至少包括一个所述苇根提取物特征峰，则所述待测样品为芦根提取物且掺杂有苇根提取物；反之，如果所述待测样品中包括全部所述芦根提取物特征峰，但不包括所述为苇根提取物特征峰，则所述待测样品为芦根提取物且不掺杂有苇根提取物。在本发明的一些具体实施方案中，所述芦根提取物特征峰的保留时间为15～50min；所述苇根提取物特征峰的保留时间为55～85min。在本发明的一些具体实施方案中，所述芦根提取物特征峰的保留时间为17.1±2min、23.8±2min、26.7±2min、28.3±2min、35.1±2min、39.2±2min和46.6±2min；所述苇根提取物特征峰的保留时间为59.6±2min、65.0±2min、71.5±2min、75.0±2min、78.4±2min和80.0±2min。在本发明的一些具体实施方案中，所述待测样品中苇根提取物的检出限为不小于5％(w/w)。本发明提供了一种芦根提取物的鉴别方法，包括以下步骤：步骤1：分别获得芦根提取物标准品和苇根提取物标准品的特征图谱；步骤2：获得芦根提取物特征峰和苇根提取物特征峰；步骤3：取待测样品检测，根据所述检测结果鉴别获得所述待测样品是否为芦根提取物和/或该待测样品中是否掺杂有苇根提取物。通过上述方法可检测芦根提取物中是否掺有苇根提取物，并且特异性好、灵敏度高、准确可靠，当芦根中掺入质量分数5％及以上的苇根时，其提取物中的苇根提取物可被检测出。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示精密度试验重叠图；图2示稳定性试验重叠图；图3示重复性试验重叠图；图4示不同批次芦根的提取物特征图谱重叠图；图5示不同批次芦根的提取物生成的对照特征图谱；图6示不同批次苇根的提取物特征图谱重叠图；图7示不同批次苇根的提取物生成的对照特征图谱；图8示掺入5％苇根的芦根提取物hplc色谱图；图9示掺入10％苇根的芦根提取物hplc色谱图；图10示掺入15％苇根的芦根提取物hplc色谱图；图11示掺入20％苇根的芦根提取物hplc色谱图；图12示未掺假的芦根提取物的hplc色谱图；图13示芦根提取物(lg1)特征峰紫外光谱；图14示苇根提取物(wg1-zz)6个特征峰(w1～w6)紫外光谱。具体实施方式本发明公开了一种芦根提取物的鉴别方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明的目的在于提供一种芦根提取物真伪鉴别方法，用于鉴别芦根提取物中是否掺有苇根提取物。本发明所采取的技术方案是：一种芦根提取物真伪鉴别方法，包括以下步骤：1)分别采用高效液相色谱法检测芦根提取物标准品和苇根提取物标准品，建立芦根提取物特征图谱和苇根提取物特征图谱；2)将苇根提取物特征图谱与芦根提取物特征图谱对比，确定芦根提取物特征峰和苇根提取物特征峰；3)采用高效液相色谱法检测芦根提取物，由测定结果判断芦根提取物中是否掺有苇根提取物。进一步地，高效液相色谱法包括以下步骤：1)对照品溶液的制备：取对照品对香豆酸和阿魏酸，置棕色量瓶中，加甲醇，摇匀；2)供试品溶液的制备：精密称取检测样品，加入甲醇，超声提取，冷却，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇溶解，转移到量瓶中，摇匀，即得供试品溶液；3)测定：精密吸取供试品溶液，注入高效液相色谱仪测定。进一步地，对照品溶液中含有22.2μg/ml对香豆酸和10.6μg/ml阿魏酸。进一步地，高效液相色谱法检测时的色谱条件为：固定相为十八烷基硅烷键合硅胶柱；采用流动梯度洗脱，流动相a为乙腈，流动相b为0.5％磷酸二氢钾溶液(ph＝2.15)，a:b＝7％～22％：93％～78％；流速0.8～1.2ml/min；检测波长为270～280nm；色谱柱温度为25～35℃。进一步地，洗脱液的a、b相变化为：0～15min，a相7％；15～35min，a相7％～12％；35～55min，a相12％～15％；55～70min，a相15％～19％；70～80min，a相19％～22％；80～85min，a相22％；流速1.0ml/min；检测波长为275nm；色谱柱温度为30℃。进一步地，芦根提取物特征峰共7个，其保留时间范围为15～50min；苇根提取物特征峰共6个，其保留时间范围为55～85min。进一步地，芦根提取物特征峰共7个，其保留时间为17.1±2min、23.8±2min、26.7±2min、28.3±2min、35.1±2min、39.2±2min和46.6±2min；苇根提取物特征峰共6个，其保留时间为59.6±2min、65.0±2min、71.5±2min、75.0±2min、78.4±2min和80.0±2min。进一步地，判断芦根提取物中掺有苇根提取物的标准为：测定结果中出现芦根提取物的全部特征峰，且至少出现一个苇根提取物的特征峰，说明芦根提取物中掺有苇根提取物，反之说明芦根提取物中不掺有苇根提取物。进一步地，判断芦根提取物中掺有苇根提取物的标准为：测定结果在保留时间15～50min出现芦根提取物的全部特征峰，且保留时间55～85min至少出现一个苇根提取物的特征峰，说明芦根提取物中掺有苇根提取物，反之说明芦根提取物中不掺有苇根提取物。进一步地，判断芦根提取物中掺有苇根提取物的标准为：测定结果在保留时间为17.1±2min、23.8±2min、26.7±2min、28.3±2min、35.1±2min、39.2±2min和46.6±2min均出峰，且在保留时间为59.6±2min、65.0±2min、71.5±2min、75.0±2min、78.4±2min和80.0±2min至少出一个峰，说明芦根提取物中掺有苇根提取物，反之说明芦根提取物中不掺有苇根提取物。本发明的有益效果是：通过上述方法可检测芦根提取物中是否掺有苇根提取物，并且特异性好、灵敏度高、准确可靠，当芦根中掺入质量分数5％及以上的苇根时，其提取物中的苇根提取物可被检测出。本发明提供的芦根提取物的鉴别方法中所用原料、辅料及试剂均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1仪器与试药：仪器：agilent1200型高效高效液相色谱仪(二极管阵列检测器)，bp-211d精密电子天平(sartoriusag，goettingen，germany)；ms204s电子天平(瑞士mettlertoledo公司)台式超声清洗器(sk7200lh，上海科导超声仪器有限公司)。试药：7批芦根提取物为市售芦根提取物，均采用水提法提取。7批苇根提取物由实验室收集不同来源的苇根药材自制的提取物，具体由适量药材加20倍量水煎煮三次，合并滤液，浓缩至稠膏，加适量辅料混匀，减压干燥而得。对香豆酸对照品(批号bcbs872)，购自sigmaaldrich公司，纯度≥98.0％；阿魏酸对照品(批号111073-201604)，购自中国食品药品检定研究院，纯度99.0％；提取用甲醇为分析纯；液相分析试剂乙腈为色谱纯。高效液相色谱步骤：1)参照物溶液的制备：取对香豆酸对照品、阿魏酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加50％甲醇制成每1ml含对香豆酸22.2μg、阿魏酸10.6μg的混合溶液，摇匀，即得。2)供试品溶液的制备：精密称取待测样品0.5g，加入50％甲醇50ml，超声提取60min，取出，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加50％甲醇溶解，转移到5ml量瓶中，摇匀，配制成0.1g/ml的供试品溶液，即得。3)测定：分别精密吸取15μl参照物溶液与供试品溶液，注入高效液相色谱仪测定。色谱条件为：采用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，色谱柱型号为zorbaxsbc18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相a为乙腈，流动相b为0.5％磷酸二氢钾溶液(ph＝2.15)；流动梯度洗脱过程中，洗脱液的a、b相变化为：0～15min，a相7％；15～35min，a相7％～12％；35～55min，a相12％～15％；55～70min，a相15％～19％；70～80min，a相19％～22％；80～85min，a相22％；检测波长为275nm；流速1.0ml/min；色谱柱温度为30℃。精密度实验取同一份芦根提取物样品供试品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，测定结果如图1所示，s1-s6为连续6次进样的图谱，由结果分析可知各共有峰的相对保留时间与相对峰面积的rsd均小于3％，表明精密度良好。稳定性实验取同一份芦根提取物样品供试品溶液，按上述色谱条件分别在0、3、6、12、18、24h进样测定，测定结果见图2，s1-s6为0、3、6、12、18、24h进样测定的结果，由结果分析可知，各共有峰的相对保留时间与相对峰面积的rsd均小于3％，表明样品溶液在24h内稳定。重复性实验取同一批芦根提取物样品6份，精密称定，按上述供试品制备方法制备供试品溶液，分别进样检测，结果如图3所示，s1-s6为6次进样测定的结果，由结果分析可知，各共有峰的相对保留时间与相对峰面积的rsd均小于3％，表明重复性较好。特征图谱的建立：1.芦根提取物特征图谱的建立取不同批次芦根的提取物样品，按照上述高效液相色谱步骤与条件进行测定，测定结果如图4所示，根据测定结果制定芦根提取物对照特征图谱如图5所示。2.苇根提取物特征图谱的建立：取不同批次苇根的提取物样品，按照上述高效液相色谱步骤与条件进行测定，根据测定结果如图6所示，根据测定结果制定苇根提取物对照特征图谱如图7所示。特征峰的确定：通过对比芦根提取物特征图谱和苇根提取物特征图谱，确定59.6±2min、65.0±2min、71.5±2min、75.0±2min、78.4±2min、80.0±2min出现的6个色谱峰为苇根提取物特有，而芦根提取物在此保留时间无色谱峰出现，因此，将这6个色谱峰确定为特征峰。实施例2仪器与试药：仪器：agilent1200型高效高效液相色谱仪(二极管阵列检测器)，bp-211d精密电子天平(sartoriusag，goettingen，germany)；ms204s电子天平(瑞士mettlertoledo公司)台式超声清洗器(sk7200lh，上海科导超声仪器有限公司)。试药：7批芦根提取物为市售芦根提取物，均采用水提法提取。7批苇根提取物由实验室收集不同来源的苇根药材自制的提取物，具体由适量药材加20倍量水煎煮三次，合并滤液，浓缩至稠膏，加适量辅料混匀，减压干燥而得。对香豆酸对照品(批号bcbs872)，购自sigmaaldrich公司，纯度≥98.0％；阿魏酸对照品(批号111073-201604)，购自中国食品药品检定研究院，纯度99.0％；提取用甲醇为分析纯；液相分析试剂乙腈为色谱纯。高效液相色谱步骤：4)参照物溶液的制备：取对香豆酸对照品、阿魏酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加50％甲醇制成每1ml含对香豆酸22.2μg、阿魏酸10.6μg的混合溶液，摇匀，即得。5)供试品溶液的制备：精密称取待测样品0.5g，加入50％甲醇50ml，超声提取60min，取出，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加50％甲醇溶解，转移到5ml量瓶中，摇匀，配制成0.1g/ml的供试品溶液，即得。6)测定：分别精密吸取15μl参照物溶液与供试品溶液，注入高效液相色谱仪测定。色谱条件为：采用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，色谱柱型号为zorbaxsbc18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相a为乙腈，流动相b为0.5％磷酸二氢钾溶液(ph＝2.15)；流动梯度洗脱过程中，洗脱液的a、b相变化为：0～15min，a相7％；15～35min，a相7％～12％；35～55min，a相12％～15％；55～70min，a相15％～19％；70～80min，a相19％～22％；80～85min，a相22％；检测波长为275nm；流速1.0ml/min；色谱柱温度为30℃。准确性、灵敏度实验待测样品a、b、c、d的组分如下：表1样品名abcd对照组芦根47.5g45g42.5g40g50g苇根2.5g5g7.5g10g0掺假量5％10％15％20％0取样品a、b、c、d及对照组样品，水提法制备提取物a、b、c、d，按照上述高效液相色谱步骤与实验条件对提取物进行测定，测定结果见图8～11，对照组测定结果见图12。由结果可知，掺入苇根的提取物的色谱图在59.6±2min、65.0±2min、71.5±2min、75.0±2min、78.4±2min、80.0±2min左右出现至少一个明显色谱峰，根据本发明提供的鉴定方法可知，样品a、b、c、d中掺有苇根。而未添加苇根的提取物在此无明显色谱峰，表明对照组样品中不掺有苇根。且图中结果表明，特征峰随苇根添加比例的增加而增大，表明通过本发明中的方法可以鉴别掺入苇根的芦根提取物，准确性好；且能够鉴别含量不小于5％(w/w)的苇根，灵敏度高。实施例3芦根提取物真伪鉴别特异性分析芦根提取物特征图谱的建立与分析：在275nm检测波长条件下，7批芦根提取物样品主要特征峰基本一致，匹配前后的重叠见图4，采用相似度软件生成的对照图谱，共标示出7个特征峰，其中鉴别了对香豆酸、阿魏酸两个特征峰，见图5。芦根提取物1(lg1)的7个特征峰的特征峰紫外光谱见图13。以峰6(对香豆酸)作为参照峰，计算各特征峰相对保留时间及相对峰面积，结果见表2。表27批芦根提取物hplc特征图谱共有峰的相对保留时间和相对峰面积苇根提取物特征图谱的建立与分析：在275nm检测波长条件下，7批苇根提取物样品能检出与芦根提取物一致的7个特征峰，但比芦根提取物多6个黄酮紫外光谱特征的特征峰(峰w1-w6)，能达到鉴别目的。不同批次主要特征峰基本一致，匹配前后的重叠见图6。将7批以上的样品用相似度软件生成对照图谱，见图7。苇根提取物样品wg1-zz的6个黄酮特征峰的特征峰紫外光谱见图14。以峰6(对香豆酸)作为参照峰，计算各特征峰相对保留时间及相对峰面积，结果见表3。表37批苇根提取物特征峰相对保留时间及相对峰面积以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12