一种宽检测范围的尿液转铁蛋白检测试剂盒的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
，特别是涉及一种宽检测范围的尿液转铁蛋白检测试剂盒。
背景技术：
转铁蛋白(utrf)是带负电荷的小分子循环蛋白，在生理状态下转铁蛋白和白蛋白都很难通过肾小球滤膜，但是当肾脏发生病变时，转铁蛋白和白蛋白可从肾小球中漏出，故尿转铁蛋白是一项反映肾小球滤膜损伤的灵敏指征。转铁蛋白的独特性不仅使其具有检测常规肾功能特性，而且还能更广泛地应用于更早期，更轻微肾损伤的检测。正常成人尿液中转铁蛋白含量较低，通常<2mg/l，但是正常成人血液中转铁蛋白含量高达2200-4000mg/l，当肾小球出现轻微损伤时，血液中转铁蛋白将漏到尿液中，使得尿液中的utrf明显升高；其中，中后期肾病病患，utrf漏出更多，使得尿液中的utrf浓度高达几百甚至1000mg/l。目前临床常用检测血液转铁蛋白的免疫比浊法试剂，因为灵敏度问题无法检测尿液转铁蛋白。现市面上已经有多家公司拥有测定尿液utrf的试剂，除西门子和贝克曼库尔特的进口尿液转铁蛋白检测试剂外；美康生物，北京百奥泰康生物以及本公司均采用胶乳免疫比浊法，其中美康生物，北京百奥泰康生物以及本公司试剂的检测下限均能达到0.6mg/l以下，但是在这些试剂中，线性范围最高的仅达到30mg/l，并且多数厂家还未标注抗原过剩范围。在临床应用中，现有的胶乳免疫比浊试剂具有线性范围过窄的问题，研究发现，50％以上的早期肾小球肾病患，其尿液中的utrf均会超过30mg/l，只有不到10％的早期肾小球肾病患尿液中的utrf会超过80mg/l。因此，现有的利用胶乳免疫比浊法试剂，检测尿液中utrf的试剂盒，根本无法满足大多数早期肾小球肾病患尿液中utrf含量的检测，而大量标本利用人工或者仪器稀释复检，既增加了医院工作人员的劳动强度又增加了试剂损耗成本。目前，检测尿液中utrf含量的主流试剂为进口的西门子bnii(2.2-35mg/l)系统的utrf试剂，以及贝克曼库尔特(bc)im800(2.0-40mg/l)系统中的utrf试剂，两者均采用散射免疫比浊法，虽然其检测范围相对较宽，能够达到35-40mg/l，覆盖了60％的病患，但是其检测低限仅能达到2.2和2.0mg/l。由于小于最低检测限的样本无法报告结果，而此项目的参考值则为2mg/l，致使临床应用相对尴尬，灰区样本无法检测出结果，弱阳性样本(尿液中utrf含量为2.0-5mg/l)测定重复性差。此外，进口试剂价格昂贵，而且现有的检测尿液中utrf的试剂盒，检测速度极为缓慢，均小于250t/h，无法适应大型医院病患多以及体检海量样本的需求。基于现有的utrf胶乳比浊试剂，通过仪器预稀释方式，拓展检测范围，将降低50％-70％的生化仪检测速度，相对现有西门子和bc试剂，此方法检测速度的提升并不明显，且该方式拓展检测范围的能力有限，仅能达到50-60mg/l，并不能达到线性范围上限超过80mg/l的要求。此外，大幅度提高抗体用量，虽然可以用来拓宽试剂线性范围，但是单纯提高抗体用量，不仅会对抗原过剩范围造成不利的影响，而且还会大幅度提升检测成本，在国家严控医疗费用的背景下，大幅度提高抗体用量来拓宽试剂线性范围的方法，显然是无法推广使用的。因此，提供一种线性范围上限超过80mg/l，能够涵盖90％以上病患，且在2mg/l参考值附近重复性好，利于灰区样本判断的国产尿液转铁蛋白检测试剂盒，是本领域技术人员亟需解决的问题。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了一种宽检测范围的尿液转铁蛋白检测试剂盒，其线性范围上限超过80mg/l，能够涵盖90％以上病患，且在2mg/l参考值附近的重复性好，利于灰区样本判断；此外，本发明中的试剂盒可以替代进口试剂，节约病患开支。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种宽检测范围的尿液转铁蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括试剂一和试剂二，所述试剂一包括金属离子添加剂。本发明中的尿液转铁蛋白检测试剂盒，在抗原过剩范围满足1000mg/l的情况下，线性范围上限超过80mg/l，灰区样本满足2mg/l浓度的检测，且其精密度cv<2％，能够满足90％以上的病患进行检测；此外，本发明中的试剂盒能够完全替代进口试剂，大幅度节约病患开支。进一步地，所述金属离子添加剂中的金属离子包括铁离子、铜离子或锌离子。铁离子，铜离子或锌离子作为金属离子添加剂中的金属离子，可以显著提高转铁蛋白测试的低端灵敏度。转铁蛋白结合离子的饱和程度，对其蛋白构象可能有影响，即影响其在免疫比浊测定中形成抗原抗体复合物的能力，饱和度越高，形成浊度能力越强。在试剂一中加入一定量的金属离子，低值标本转铁蛋白含量低，结合离子的饱和度高，带来浊度信号值高，反之，高浓度样本转铁蛋白含量高，相对离子结合饱和度低，所以浊度形成能力变化不明显。进一步地，所述金属离子添加剂能与转铁蛋白结合且易溶于水；所述金属离子添加剂包括锌盐，所述锌盐的浓度为6-19mm，优选的所述所述锌盐的浓度为10-15mm。进一步地，所述锌盐为硫酸锌，氯化锌或乙酸锌中的一种或者几种其中，所述金属离子添加剂还包括铁盐和铜盐，所述铁盐为硫酸亚铁；所述铜盐为硫酸铜。铁盐、铜盐或锌盐虽然均可作为试剂一中的金属离子添加剂，但是硫酸亚铁和硫酸铜均对试剂一溶液的颜色影响较大，且相对成本较高；而锌盐溶解后对试剂一溶液的颜色影响不大，且锌盐化工应用较多，成本较低，故优选采用锌盐作为金属离子添加剂。进一步地，所述试剂二为标记有utrf抗体的胶乳颗粒溶液；所述胶乳颗粒粒径范围为172-200nm；优选的所述胶乳颗粒粒径范围为185-200nm。使用粒径更小的胶乳，可整体降低试剂灵敏度，利用灵敏度和线性及抗原过剩范围矛盾的理论基础，可拓展线性范围，但是直接使用粒径更小的胶乳，将导致低端灵敏度低，产生无法区分灰区标本的问题。即使添加增敏剂，进行整体提高试剂灵敏度，但提升低端灵敏度同时，会导致高值灵敏度信号值过高，降低线性范围和抗原过剩范围。因此，在尿液utrf的检测中，当使用粒径更小的胶乳造成的低值灵敏度损失，与在试剂一加入的适量金属离子，带来的低值灵敏度的提升，相互抵消的时候，且该提升较小地影响高值灵敏度，才能既可以拓展尿液utrf试剂盒的线性范围，又可维持低值灵敏度，从而保证灰区样本测定的准确性。进一步地，所述试剂一还包括浓度为400mm/l的氯化钠或氯化钾；浓度不高于20g/l的增敏剂，和浓度为5ml/l的分散剂。其中，虽然氯化钾与氯化钠在本试剂盒中的作用相同，但是氯化钾相较于氯化钠成本高昂，故本发明优选氯化钠。优选的，试剂一中还包括防腐剂和缓冲液等试剂；其中防腐剂包括叠氮钠或proclin系列；缓冲液的ph值为5.5-8.0，包括柠檬酸，good’s，磷酸盐，甘氨酸或tris缓冲液。本发明可以根据实际检测情况，适量地添加防腐剂和缓冲液，其中utrf对ph值的变化并不敏感，故防腐剂和缓冲液等试剂的添加并不影响本发明试剂盒的检测性能。进一步地，所述增敏剂为聚乙二醇peg4000、聚乙二醇peg6000、聚乙二醇peg8000、聚乙二醇peg12000或聚乙二醇peg20000中的一种或几种。本发明同时还利用专利号为201710986970.7，
专利名称：为“一种提高胶乳免疫比浊法抗原过剩和线性范围的方法”公开的二次收敛聚合胶乳改造技术，在不提高抗体投料体积即成本不变，不使用仪器预稀释即不降低检测速度，抗原过剩范围满足1000mg/l的情况下，实现本发明中尿液utrf检测试剂盒线性范围的提高。其中专利号为201710986970.7(一种提高胶乳免疫比浊法抗原过剩和线性范围的方法)的发明专利，虽然利用了二次收敛聚合胶乳改造技术，在不提高抗体投料体积，不使用仪器预稀释，抗原过剩范围满足1000mg/l的情况下，可以将utrf检测试剂的线性范围拓展到0.2-40mg/l，达到进口试剂的线性范围，且低值灵敏度优于进口试剂，但并不能完全满足临床需求。本发明中的试剂盒相较于专利号为201710986970.7(一种提高胶乳免疫比浊法抗原过剩和线性范围的方法)的发明专利，在抗原过剩范围满足1000mg/l的情况下，可实现试剂盒的线性范围上限超过80mg/l，灰区样本满足2mg/l浓度的检测，且其精密度cv<2％，能够满足90％以上的病患进行检测。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明提供了一种宽检测范围的尿液转铁蛋白检测试剂盒，具有如下技术优点：(1)本发明中的试剂盒在试剂一中加入金属离子添加剂，并选择了合适的胶乳颗粒粒径范围，使用粒径更小的胶乳造成的低值灵敏度的损失与使金属离子带来的低值灵敏度的提升相互抵消，且该提升较小地影响高值灵敏度，才能既可以拓展本发明试剂盒的线性范围，又可维持低值灵敏度，从而保证灰区样本测定的准确性。(2)本发明中的试剂盒，在抗原过剩范围满足1000mg/l的情况下，线性范围上限超过80mg/l，灰区样本满足2mg/l浓度的检测，且其精密度cv<2％，能够满足90％以上的病患进行检测；(3)采用本发明的试剂盒进行检测，可替代进口试剂，节约病患开支。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1附图为本发明提供的不同浓度乙酸锌对测定不同浓度utrf灵敏度的影响。图2附图为本发明提供的不同浓度硫酸亚铁对测定不同浓度utrf灵敏度的影响。图3附图为本发明提供的不同浓度硫酸铜对测定不同浓度utrf灵敏度的影响。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1利用专利号为201710986970.7中记载的方法，即二次收敛聚合胶乳改造技术，对本公司第一代utrf试剂拓展其线性范围，得到试剂a，并验证第一代utrf试剂与试剂a的性能。第一代utrf试剂：注册证号沪械注准20162400121，线性范围为0.2-24mg/l，抗原过剩范围为1000mg/l；主要组成成分为：试剂一：氯化钠，浓度为400mm/l；聚乙二醇peg6000，浓度为1g/l；吐温-20，浓度为5ml/l；试剂二：胶乳颗粒，3g/l，胶乳粒径297nm；utrf抗体(货号q0327)，10ml/l，品牌dako。其中，将第一代utrf试剂进行二次收敛聚合胶乳改造的具体步骤如下：(1)使用同第一代utrf试剂相同的，500ml的polymicrospheres公司货号为cb0297c的胶乳溶液，其中，包括10％质量浓度的、粒径为297nm的胶乳，通过millipore公司的50kd截留孔径超滤膜包加入蒸馏水进行错流过滤，完成8倍换液。(2)将置换蒸馏水后的胶乳溶液，加入到容量为1000ml的四口反应釜中，加入1.5g氯化锂和0.4g十二烷基苯磺酸钠，反应釜放在恒温水浴锅中，保持50℃的恒温，260rpm机械搅拌10min。然后通入氩气去除氧气5min后，加入0.15g过硫酸钾，二次引发微球内部的收敛聚合反应，继续在50℃的恒温中，260rpm机械搅拌下反应10h。(3)将完成收敛聚合反应后的胶乳溶液加入50mm/l浓度、ph5.0的mes-naoh溶液，通过millipore公司的50kd截留孔径超滤膜包进行错流过滤，完成16倍换液。收敛聚合反应前胶乳溶液中胶乳的粒径d1为297nm，经过二次收敛聚合胶乳改造后，胶乳溶液中的胶乳粒径为d2＝0.78d1＝231nm。试剂a的主要组成成分为：试剂一：氯化钠，浓度为400mm/l；聚乙二醇peg6000，浓度为1g/l；吐温-20，浓度为5ml/l；防腐剂pc-300，浓度为0.35ml/l；试剂二：二次收敛聚合后的胶乳颗粒，浓度为3g/l，胶乳粒径为d2(d2＝0.78d1)231nm；utrf抗体(货号q0327)，10ml/l，品牌dako，使用常规化学偶联法制备试剂二。同时第一代utrf试剂与试剂a，均使用2ul样本，105ul试剂一，35ul试剂二，在570nm波长，18-34读点情况下在hitachi7180上验证性能，具体数据如表1-3。表1第一代utrf试剂定标数据mg/l01.5361224δabs6433912199041619374表2a试剂定标数据mg/l02102040δabs2275153334717592表3第一代utrf试剂和试剂a线性范围及抗原过剩范围的比较由表1-3可知，试剂a相对第一代utrf试剂，试剂a的线性范围上限可拓展到超过40mg/l，抗原过剩范围达到1000mg/l。实施例2验证金属添加剂的作用利用试剂a，在试剂a的试剂一中分别添加不同浓度的乙酸锌，硫酸铜和硫酸亚铁，使用2ul样本，105ul试剂一，35ul试剂二，在570nm波长，18-34读点情况下在hitachi7180上，使用相同批次不同浓度的utrf标准品测定δabs，结果如表4-6和图1-3所示。表4不同浓度的乙酸锌对测定不同浓度utrf灵敏度的影响表5不同浓度的硫酸亚铁对测定不同浓度utrf灵敏度的影响表6不同浓度的硫酸铜对测定不同浓度utrf灵敏度的影响从表4-6和图1-3可知，在试剂a的试剂一中添加乙酸锌、硫酸铜或硫酸亚铁，少量金属离子就能显著提高低浓度utrf测定的灵敏度(约提升120％)，随着金属离子浓度增加，低浓度(2mg/l)utrf的灵敏度提升已经趋于稳定(表6第三例2mg/l浓度灵敏度变化)，中高浓度(如10mg/l)utrf测定灵敏度随金属离子添加量增加而开始逐渐增加，但是金属添加剂的浓度过高时，比如24mm/l时，线性范围为40mg/l时abs超界，不能满足线性范围上限超过40mg/l的要求。此外，在所有情况下，单纯在试剂a的试剂一中添加金属添加剂，其线性范围均无法达到80mg/l，abs均超界。其中，加入硫酸铜的试剂一为淡蓝色，加入硫酸亚铁的的试剂一为浅绿色，不符合本领域大多数试剂一为无色或淡黄色澄清溶液的要求，且成本略高，不作为优选，后续实施例使用溶液无色的且工业化价格低的锌盐。实施例3使用本领域常规思路，在一定范围内减小胶乳粒径，拓展试剂线性范围。将实施例1试剂a中polymicrospheres公司粒径为297nm的胶乳，更换为bangslab粒径为200nm的胶乳，根据专利号为201710986970.7中记载的二次收敛聚合胶乳改造技术，得到d3＝0.78×200nm＝156nm的胶乳，得到试剂b，试剂b的主要组成分为：试剂一：氯化钠，浓度为400mm/l；聚乙二醇peg6000，浓度为1g/l；吐温-20，浓度为5ml/l；防腐剂pc-300，浓度为0.35ml/l；试剂二：二次收敛聚合后的胶乳颗粒，浓度为3g/l，胶乳粒径d3为156nm；utrf抗体(货号q0327)，浓度为10ml/l，品牌dako，使用常规化学偶联法制备试剂二。试剂b的试剂一中，添加不同的浓度乙酸锌，配合试剂b的试剂二，使用2ul样本，105ul试剂一，35ul试剂二，在570nm波长，18-34读点情况下在hitachi7180上，使用相同批次不同浓度的utrf标准品测定δabs，参考值附近精密度，线性范围和抗原过剩范围，结果如表7-9所示。表7不同浓度的乙酸锌对不同浓度utrf中δabs的影响表8不同浓度的乙酸锌对测定参考值浓度精密度的影响乙酸锌浓度mean(mg/l)sdcv0mm2.030.1738.52％6mm2.020.0321.58％12mm2.030.0331.63％19mm2.010.031.49％24mm2.060.0311.50％表9不同浓度的乙酸锌对抗原过剩范围和线性范围的影响本实施例降低胶乳粒径到200nm，利用专利号为201710986970.7中记载的二次收敛聚合胶乳改造技术，并在试剂b的试剂一中加入6-19mm的乙酸锌。从表格8可知，本实施例中的试剂可实现，在2mg/l的精密度cv<2％；从表格7和表格9可知，本实施例中的试剂，线性范围上限可超过80mg/l，抗原过剩范围满足1000mg/l的要求，为宽线性范围的utrf试剂。同时，随着乙酸锌浓度提高，试剂测定高值时灵敏度也逐渐提升，但抗原过剩范围却在逐渐下降；当乙酸锌浓度为6-12mm时，抗原过剩范围高达1200mg/l甚至更多；但当乙酸锌浓度为19mm时，理论抗原过剩范围为1000mg/l，但此时浓度测定的线性范围只有80.16mg/l，已经处于80mg/l线性范围的抗原过剩范围边缘；如果继续提高乙酸锌浓度到24mm时，处于80mg/l线性范围的abs超界，已经无法满足线性范围达到80mg/l的要求。实施例4验证胶乳粒径的下限将实施例3试剂b中的胶乳更换为粒径为172nm的胶乳(polymicrospheres公司货号为cb0172e)，因整体灵敏度下降较多，单纯靠乙酸锌无法满足低值灵敏度要求，故调整增敏剂为聚乙二醇peg8000，浓度20g/l，根据专利号为201710986970.7中记载的二次收敛聚合胶乳改造技术，得到d4＝0.78×172nm＝134nm的胶乳，进一步得到试剂c，试剂c的主要组成分为：试剂一：氯化钠，浓度为400mm/l；聚乙二醇peg8000，浓度为20g/l；吐温-20，浓度为5ml/l；防腐剂pc-300，浓度为0.35ml/l；试剂二：二次收敛聚合后的胶乳颗粒，浓度为3g/l，胶乳粒径d4为134nm；utrf抗体(货号q0327)，浓度为10ml/l，品牌dako，使用常规化学偶联法制备试剂二。在试剂c的试剂一中，添加不同浓度的乙酸锌，配合试剂c中的试剂二，使用2ul样本，105ul试剂一，35ul试剂二，在570nm波长，18-34读点情况下在hitachi7180上，使用相同批次不同浓度的utrf标准品，测定δabs，参考值附近精密度，线性范围和抗原过剩范围，结果如表10-12所示。表10不同浓度的乙酸锌对不同浓度utrf中δabs的影响表11不同浓度的乙酸锌对测定参考值浓度精密度的影响乙酸锌浓度mean(mg/l)sdcv0mm1.920.22111.51％6mm2.010.0391.94％12mm1.990.0381.91％19mm2.020.041.98％24mm1.990.0391.96％表12不同浓度的乙酸锌对抗原过剩范围和线性范围的影响由表10-12可知，本实施例在降低胶乳粒径到172nm，使用专利号为201710986970.7中，记载的二次收敛聚合法的情况下，并在试剂1中加入6-19mm的乙酸锌时，可以实现2mg/l精密度cv<2％，线性范围上线可超过80mg/l，抗原过剩范围满足1000mg/l要求的宽线性范围utrf试剂。但可以看到，当胶乳粒径降低到172nm时，聚乙二醇peg8000作为常规增敏剂，已经加到了较高浓度即20g/l，此浓度接近容易带来peg沉淀蛋白非特异反应的浓度25g/l了，再降低胶乳粒径，精密度cv已经难以保证。本实施例中在6-19mm的乙酸锌浓度下，胶乳粒径适用范围为172-200nm。另外从实施例3和4对比可以看到，胶乳粒径提高，线性范围和抗原过剩范围将大幅度下降。实施例3中200nm的胶乳粒径在19mm乙酸锌浓度以及1g/lpeg6000条件下已经处于抗原过剩范围边缘。本发明公开提供了一种宽检测范围的尿液转铁蛋白检测试剂盒，通过在试剂盒试剂一中加入可与转铁蛋白结合，且易溶于水的金属离子添加剂，并选择了合适的胶乳颗粒粒径范围，使金属离子带来的低值灵敏度的提升与使用粒径更小的胶乳造成的低值灵敏度的损失相互抵消，且低值灵敏度的提升较小地影响高值灵敏度，在抗原过剩范围满足1000mg/l的情况下，拓展了本发明中试剂盒的线性范围上线超过80mg/l，又可维持了低值灵敏度，从而保证灰区样本满足2mg/l浓度的检测，且其精密度cv<2％，能够满足90％以上的病患进行检测，使用本发明的试剂盒替代进口试剂，可大幅度节约病患开支。本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。当前第1页12