本发明涉及肿瘤免疫学检测
技术领域：
，具体涉及一种量子点免疫层析法膀胱癌检测试剂盒。
背景技术：
：膀胱癌是指来源于膀胱壁上皮及间质组织的恶性肿瘤，属泌尿系统最常见的恶性肿瘤，在我国泌尿系统肿瘤发病率居首位，一般男性发病率要高于女性3-4倍，发病年龄在50-70岁之间居多。其90％以上为移行细胞癌，大多呈乳头状，6-8％是鳞状上皮细胞癌，1-2％是腺癌，还有不到1％是肉瘤。膀胱癌的典型特点是不易察觉，且容易复发。绝大多数的病人都是等到出现了肉眼可见的血尿或排尿困难等症状才去就医检查，一旦确诊往往已是晚期，且有很大一部分病人在实行膀胱癌电切术后复发，因此早发现早治疗是预防膀胱癌的最佳途径。目前膀胱癌诊断的金标准为尿道膀胱镜检，费用相对昂贵，且操作不方便，最主要的是会给病人带来巨大痛苦，且有可能会伴有尿道出血、甚至发生感染的可能。因此，寻找一种准确、灵敏、能够通过特异性肿瘤标志物早期快速检测膀胱癌的诊断试剂就显得尤为重要。目前，市场上存在的免疫层析相关的膀胱癌检测试剂主要有两种，一种以bta(也称hcfhrp，即人补体因子h相关蛋白，梅里埃，美国)为标志物的胶体金免疫层析法试剂，该标志物虽最早获得美国fda认证，但其在病人存在血尿的情况下，特异性会因血液中的蛋白补体因子而有所下降，一般在40-50％之间；另一种nmp22(核基质蛋白22，alere，美国)，是目前应用较为广泛的膀胱癌肿瘤标志物，其特异性和灵敏度相对bta略高，但在患者存在膀胱、肾结石以及病毒感染的时候依旧会出现假阳性。除以上两种标志物的层析方法外，目前市面上的膀胱癌早期诊断还有荧光探针原位杂交方法(fish，雅培，美国)和尿脱落细胞学检测方法。其中fish方法虽然灵敏度和特异性方面较前两者大大提高，但存在费用昂贵，操作方法复杂，样本需求量较大的弊端；尿脱落细胞方法学特异性方面特异性虽然较好，但敏感性较差，阳性患者检出率一般在20％左右，一般只作为辅助诊断使用。综上所述，传统的膀胱癌检测试剂盒存在着灵敏度差、特意性差、检测时创伤较大的缺陷，亟待进一步改进。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种量子点免疫层析法膀胱癌检测试剂盒，用以解决现有检测试剂盒灵敏度差、特意性差、检测时创伤较大问题。为实现上述目的，本发明提供一种量子点免疫层析法膀胱癌检测试剂盒，所述检测试剂盒包括：基板、样品垫、结合垫、吸水纸和硝酸纤维膜，所述硝酸纤维膜覆盖于所述基板上，所述结合垫位于所述硝酸纤维膜的上样端，所述吸水纸位于所述硝酸纤维膜的吸附端，所述样品垫位于所述样结合垫的上部，其中，所述结合垫上结合有量子点标记的单克隆抗体abc71，所述硝酸纤维膜上分别设有检测线和质控线，所述检测线包被有单克隆抗体cd71，所述质控线包被有羊抗鼠igg。本发明的一个实施例中，所述样品垫上还结合有牛血清白蛋白、蔗糖以及吐温。本发明的一个实施例中，所述基板采用pvc板。本发明的一个实施例中，所述硝酸纤维膜与结合垫的重叠长度以及所述结合垫与样品垫之间的重叠长度均为1-2cm。本发明的一个实施例中，所述吸水纸与所述硝酸纤维薄膜的重叠长度为2-3cm。本发明的一个实施例中，所述量子点标记的单克隆抗体abc71是通过硼酸盐稀释的量子点加入到abc71单克隆抗体中混匀，再加入edc水溶液和nhs水溶液避光反应后，最后加入bsa溶液进一步避光反应得到的。本发明的一个实施例中，所述单克隆抗体abc71的标记浓度为50-100ug/ml。本发明的一个实施例中，所述单克隆抗体的cd71的包被浓度为1-2ug/cm。本发明的一个实施例中，所述羊抗鼠igg的包被浓度为0.5-1.0ug/cm。本发明的一个实施例中，所述的量子点为羧基化的水溶性量子点，其激发波长为365-450nm，发射波长为600-620nm。本发明具有如下优点：本发明量子点免疫层析法膀胱癌检测试剂盒采用双抗夹心的方法，将高特异性的单克隆抗体abc71与单克隆抗体cd71分别作为标记抗体和包被抗体，与患者尿液中被检测的膀胱癌脱落细胞形成“抗体-细胞-抗体”的模式，通过以量子点作为标记探针，实现了高灵敏度检测。同时，由于尿脱落细胞本身直径较大，因此自身便可以将荧光信号放大，实现更高的灵敏度。同时由于量子点的荧光信号值和被检测物的数量呈明显的正相关性，我们可以通过制作标准曲线，通过相关检测仪器读取荧光值便可以定量分析患者尿液中膀胱癌尿脱落细胞的数量。本发明量子点免疫层析法膀胱癌检测试剂盒具有高灵敏度、高特异性、使用简捷、成本低廉等特点，通过相关的荧光定量检测设备，甚至可实现全自动高通量检测，易于在中小型医院中推广使用。附图说明图1为本发明的量子点免疫层析法膀胱癌检测试剂盒的结构示意图。图2a-2c为本发明的量子点免疫层析法膀胱癌检测试剂盒标准品上样线性范围的曲线图。图3为本发明量子点免疫层析法膀胱癌检测试剂盒不同细胞样本上样后特异性的验证的柱状图。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。如图1所示，本发明的量子点免疫层析法膀胱癌检测试剂盒，其包括：基板500、样品垫100、结合垫200、吸水纸400和硝酸纤维膜300，硝酸纤维膜覆300盖于基板500上，结合垫200位于硝酸纤维膜300的上样端，吸水纸400位于硝酸纤维膜的吸附端，样品垫100位于结合垫200的上部，其中，结合垫200上结合有量子点标记的单克隆抗体abc71，硝酸纤维膜300上分别设有检测线310和质控线320，检测线310包被有单克隆抗体cd71，质控线320包被有羊抗鼠igg。本发明通过检测人尿液中的新型的膀胱癌肿瘤标志物ag-cd71，建立一种灵敏性高、特异性好、稳定性好、检测便捷的膀胱癌早期诊断试剂盒。实施1本发明的量子点免疫层析法膀胱癌检测试剂盒的制备方法如下：本发明的量子点免疫层析法膀胱癌检测试剂盒包括：依次粘贴于基板pvc底板500的吸水纸400、硝酸纤维素膜300、结合垫200、样品垫100；硝酸纤维素膜300的检测线310(t线)包被的商品化的单克隆抗体cd71(ab1086，abcam)，质控线320(c线)包被的羊抗鼠igg；结合垫200采用量子点标记的单克隆抗体abc71的稀释液喷涂于聚酯膜干燥而成。本发明采用的量子点为羧基化的水溶性量子点，其激发波长为365-450nm，发射波长为610±10nm。量子点与单克隆抗体abc71的标记通过edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)共价交联的方式进行。单克隆抗体abc71的标记浓度为50-100ug/ml，标记产物用保存液适当稀释后采用喷金设备喷于聚酯膜上，37℃烘干2小时后于铝箔袋内干燥避光保存。本发明的试剂盒的检测线310包被抗体采用的是商品化的单克隆抗体cd71(ab1086，abcam)，包被浓度为1-2ug/cm；质控线320包被抗体采用的是羊抗鼠igg，包被浓度采用的是0.5-1.0ug/cm，包被好抗体的硝酸纤维素膜300置于37℃烘干2小时后于密封袋内干燥保存。本发明的检测试剂盒的样品垫100在使用之前需要经过处理液进行处理，该处理液包括牛血清白蛋白、蔗糖、吐温等成分。处理后的样品垫于处理液中浸泡30分钟，37℃烘干2小时后于密封袋内干燥保存。具体的，本发明的量子点标记的abc71单克隆抗体的制备：将100ul浓度为10mg/ml的量子点采用10mm，ph7.4的硼酸盐缓冲液稀释到500ul，然后加入100ug的abc71单克隆抗体，混匀后加入适量去离子水配置的edc水溶液和等体积的nhs水溶液，室温避光条件下混匀反应2小时，然后加入去离子水配制的bsa溶液至终浓度0.5％，室温避光条件下混匀反应1小时。然后采用16000rpm，30min离心的方式对最终的标记产物进行离心清洗，重复此过程3-5次，最终将离心得到的沉淀物溶解于适量的保存液当中，超声混匀，4℃避光保存。本发明的量子点保存液包括以下成分：10-50mmpb缓冲液，1-3％bsa，5-10％蔗糖，1-2％吐温，0.05％叠氮钠，此保存液亦可以当做标记物的稀释液使用。本发明的结合垫200的制备：将量子点与单克隆抗体abc71的标记产物采用标记物稀释液稀释合适的倍数，采用上海金标的喷金划膜仪，5-10ul/cm的喷金速度均匀地喷于聚酯膜结合垫200上，将喷好标记物的结合垫置于37℃烘箱中烘干2小时，然后置于铝箔袋中密封，避光干燥保存。量子点免疫层析法膀胱癌检测试剂盒组装：将硝酸纤维薄膜300、吸水纸400、结合垫200、样品垫100分别以中、上、次下、最下的次序粘贴于无背景荧光的基板pvc底板500上，其中，吸水纸400与硝酸纤维薄膜300的重叠长度为2-3mm，硝酸纤维薄膜300与结合垫200、结合垫200与样品垫100的重叠长度均为1-2mm。硝酸纤维膜反应膜的制备：采用上海金标的喷金划膜仪，将购买的商品化的cd71单克隆抗体以0.8-1.5ul/cm的划膜速度划于贴近样品垫100的一侧，作为检测线310。将购置的羊抗鼠igg以0.8-1.5ul/cm的划膜速度划于贴近吸水纸400的一侧，作为质控线。将划好质控抗体和检测抗体的组合板置于37℃烘箱中烘干2小时，然后置于密封的铝箔袋中，避光干燥保存。基板500pvc大板的斩切：将组装完成的pvc大板采用上海金标的斩切机进行斩切，宽度设定为4mm，然后将斩切完成的试纸条置于塑料卡壳中，压紧后置于铝箔袋中，干燥密封保存。本发明的量子点免疫层析法膀胱癌检测试剂盒具体操作时，将样品液滴加到样品垫上，样品液经过结合垫将量子点结合的单克隆抗体abc71一起向吸水纸端层析，若样品液中含有目标抗原，量子点结合的单克隆抗体abc71就会与目标抗原结合，当层析到检测线时，目标抗原同时与检测线上包被的单克隆抗体cd71结合显色，在仪器下观察显色情况，判断目标抗原的含量范围，检测结果为阳性，对照标准品检测结果进行判断；若样品液中无目标抗原，则单克隆抗体cd71和单克隆抗体abc71均不与样品液中的成分结合，检测线上无显示，对照阴性对照的检测结果对比，判定检测结果为是否为阴性。实施2本发明的单克隆抗体abc71的制备和纯化：(1)杂交瘤细胞的制备1)动物免疫及细胞培养：将人膀胱癌组织匀浆后提取总蛋白，免疫balb/c小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，按每只小鼠50ug总蛋白的剂量进行腹腔免疫。每隔两周对小鼠再次免疫。小鼠血清效价达到要求后再加强免疫一次，3天后取小鼠脾脏制备成脾细胞悬液，准备进行细胞融合。复苏小鼠骨髓瘤细胞sp2/0(atcccrl-1772)，并用8-ag(8氮杂鸟嘌呤)筛选以维持细胞对hat的敏感性。2)细胞融合：将步骤1)制备好的脾细胞悬液与骨髓瘤细胞进行融合，具体方法参照《精编免疫学实验指南》((美国)j.e.科学根(美国)d.h.马古利斯等，科学出版社，2009年1月出版)。将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞培养基中培养。24小时后，加hat选择培养基(购自sigma公司；hat即h:hypoxanthine次黄嘌呤，a:aminopterin甲氨喋呤，t:thymidine胸腺嘧啶核苷)进行选择性培养。3)抗体检测：通过elisa方法确定分泌抗体的杂交瘤细胞株。具体方法是：提取膀胱癌组织总蛋白，用0.05mol/l碳酸盐缓冲液(ph9.6)4℃包被过夜，加入5％牛血清白蛋白(bsa)37℃封闭3小时。pbst洗涤3次，然后再加入100ul待检上清，37℃孵育1h。洗涤3次，加入辣根过氧化物酶标记的抗小鼠二抗igg-hrp(购自北京康为世纪生物科技有限公司)，37℃孵育1h。洗涤3次，加入50ultmb(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)显色5min后，加入50ul终止液。用酶标仪读取波长为450nm的od值。od值大于阴性对照od值的2倍以上的视为阳性。4)杂交瘤的克隆化和冻存：使用有限稀释法将筛选出的阳性杂交瘤细胞进行克隆化培养。经过5轮的克隆化培养，筛选出高效价单克隆抗体的杂交瘤细胞进行扩大培养。本发明中获得的一种阳性杂交瘤细胞株为抗人膀胱癌的单克隆杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株于2017年7月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc，中国，北京)，保藏号为cgmccno.14312。(2)abc71单抗的制备和纯化将上述分泌单克隆抗体abc71的杂交瘤细胞株(保藏号cgmccno.14312)扩大培养，并收集细胞培养上清。采用proteing对单抗abc71进行亲和层析纯化。步骤是：首先用磷酸盐缓冲液pbs平衡proteing亲和层析柱(购自ge公司)；然后将含abc71单抗的细胞培养上清通过proteing亲和层析柱；随后用pbs洗涤层析柱，直到流出柱子的洗涤液的od值接近零；使用0.2mol/l的甘氨酸-hcl溶液(ph2.8)洗脱proteing亲和层析柱，收集洗脱液，测定od值。含abc71单抗的洗脱液经pbs透析后，于-20℃冻存。本发明中的abc71单克隆抗体的鉴定：使用本发明制备的abc71单抗对人膀胱癌组织和人正常膀胱组织切片进行免疫组化。结果表明，人膀胱癌组织经abc71单抗免疫组化染色后呈现阳性反应，而人正常膀胱组织经abc71单抗免疫组化染色后呈现阴性反应。本发明制备的单克隆抗体abc71与人膀胱癌组织呈强阳性反应，而与人正常膀胱组织无交叉反应。表1免疫组化检测抗人膀胱癌单抗abc71对人膀胱癌组织与正常膀胱组织的免疫反应组织(癌组织和正常组织)abc71抗体人膀胱癌组织(病人#1)强阳性(+++)人正常膀胱组织(病人#1)阴性(－)人膀胱癌组织(病人#2)强阳性(+++)人正常膀胱组织(病人#2)阴性(－)人膀胱癌组织(病人#3)强阳性(+++)人正常膀胱组织(病人#3)阴性(－)人膀胱癌组织(病人#4)阳性(++)人正常膀胱组织(病人#4)阴性(－)人膀胱癌组织(病人#5)强阳性(+++)人正常膀胱组织(病人#5)阴性(－)实施例3本发明的量子点免疫层析法膀胱癌检测试剂盒的使用方法本发明的检测试剂盒的标准品为采用正常人尿液稀释的ej细胞；阴性对照采用正常人尿液，未含存在ag-cd71位点的尿脱落细胞；阳性样本为膀胱癌患者尿液，含有存在ag-cd71位点的尿脱落细胞。1、标准品的配制本发明采用正常人的尿液对人膀胱癌细胞系ej细胞进行逐级稀释，将1000cell/ml定义为1u/ml，同等方式，稀释得到0、1、2、4、8、26、32、64、128、256、512u/ml的尿液样本，分别进行上样，对各自的荧光值进行检测，以样本浓度为横坐标(u/ml)、检测线t和质控线c的荧光检测值的比值(f)为纵坐标绘制标准曲线。2、样本的收集收集膀胱癌病人新鲜尿液50ml，1000rpm离心5min，弃上清，收集沉淀，留取液体500ul。3、样品检测水平放置本发明的检测试剂盒，吸取2步骤液体80ul，滴于样品孔中被样品垫吸收，静置20分钟后，上机检测细胞浓度，打印检测报告。实施例4本发明的量子点免疫层析法膀胱癌检测试剂盒的方法学指标本发明采用免疫层析方法常用的检定规程对按照本发明量子点免疫层析法膀胱癌检测试剂盒进行检定，具体结果如下所示：1、本发明检测试剂盒的灵敏度将大量的正常人尿液样本进行混合，作为零值样本。然后将零值样本上样20人份本发明层析试纸条，记录测定值。将20个测定值求取平均值和标准偏差sd。然后以作为纵坐标值，代入标准曲线方程，其对应的横坐标值即为灵敏度。经统计得知，本发明检测试剂盒的灵敏度为0.625u/ml。2、本发明试剂盒的线性范围按照实施例3中所述方法制备0、1、2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024、2048、4096、8192u/ml的尿液标准品样本，各滴加80ul样品，静置20min后读取检测线t和质控线c的荧光检测值的比值f，以标准品浓度(u/ml)为横坐标，f值为纵坐标，绘制标准曲线如图2a-图2c所示。将线性相关系数在≥99.95％的情况下定义为可接受线性，可通过逐步剔除可疑值的方法找到本发明检测试剂盒的线性范围。由图图2a-图2c所示可见，本发明检测试剂盒的线性区间为0.625-2048u/ml，标准曲线方程为：y＝0.0183x+0.1473，线性相关系数r＝0.9988，线性区间为0.625-2048u/ml。3、本发明的检测试剂盒的精密度配备足够量的尿液标准品浓度分别为8、64、512u/ml的尿液标准品，三种浓度的样本在同一次分析中重复测定5次，每隔3天测定1次，共测定3次。同种方法同时测定3个批次的样品。分别计算批内样品和批间样品测定的平均值、标准差以及对应的变异系数。下表结果表明，本发明的检测试剂盒批内及批间的变异系数在0.46％-2.60％之间。表1本发明的检测试剂盒精密度测定4、本发明的检测试剂盒的准确度(回收实验)取1例膀胱癌患者新鲜的尿液，按照实施例3中样本的制备方法制备3份相同体积的待测样本，其中一份样品中加入1/10体积的正常人尿液，其余两份样本中分别加入1/10体积的采用正常尿液稀释的浓度为64u/ml、512u/ml人膀胱癌细胞系ej细胞的样本，充分混匀后，分别测定3种样本的f值，每个样本重复测定3次。将加入ej细胞标准品和未加ej细胞标准品的f值代入标准方程求得对应的浓度值，二者的差值即为相对应的回收浓度，各自的回收浓度与通过计算所得到的浓度的比值即为各自的回收率。如下表所示，本发明的检测试剂盒的回收率在97.09％-100.01％。表2本发明试剂盒准确度测定5、本发明的检测试剂盒的特异性按照实施例3中标准品的制备方法，分别将ej细胞(人膀胱癌细胞系)、t24细胞(人膀胱癌细胞系)、hcv29细胞(正常尿路上皮细胞系)配制成128u/ml的标准品。分别上样ej细胞、t24细胞、hcv29细胞和pbs，每种样品重复测定3次，测定各自的f值，分析本发明的特异性。结果如图3所示，人膀胱癌细胞系ej细胞和hcv29细胞的检测值非常高，而pbs溶液和阴性对照组正常尿路上皮细胞系hcv29细胞的检测值则几乎贴近于零样本值，说明本发明试剂盒的特异性良好。6、本发明的检测试剂盒的稳定性将本发明试纸条密封于装有干燥剂的铝箔袋中，分别置于37℃鼓风干燥箱和-20℃的冰箱中放置1周(7天)，验证本发明试剂盒在极端条件下保存的性能稳定性；置于室温条件下，每隔1个月测试1次，连续测试12个月，验证本发明试剂盒在室温保存条件下的有效期限。测试结果表明，不管是在37℃和-20℃的极端条件下还是室温条件下，一定期限内，本发明试剂盒以上所列参数完全在正常范围内，室温条件下保存可保存1年以上。实施例5本发明的量子点免疫层析法膀胱癌检测试剂盒的临床样本的检测收集医院的膀胱癌病人新鲜的尿液样本98例，收集正常人的尿液样本102例，按照实施例3中样本的收集方式进行处理上样，统计测试结果，得到本发明的检测试剂盒的灵敏度为92.34％，特异性为94.83％。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页12