本发明涉及标准物质的定值方法，具体涉及一种桔皮素标准物质的制备和定值方法。
背景技术：
类黄酮(flavonoids)是植物重要的一类次生代谢产物，它以结合态(黄酮苷)或自由态(黄酮苷元)形式存在于水果、蔬菜、豆类和茶叶等许多食源性植物中。类黄酮尤其是多甲氧基黄酮具有增强人体免疫力、抗癌、抑菌消炎、预防糖尿病和心脑血管疾病等显著的生理作用，因此，目前作为重要成分被广泛添加在膳食补充剂等功能性保健食品。同时，根据类黄酮成分及含量的不同，还可以作为特征指标用于柑橘地理标志和果汁产品产地溯源与真实性鉴别。虽然类黄酮已广泛应用于食品、医药和化妆品等领域，但该类标准物质在我国目前数量少、种类单一，相关标准物质制备与定值技术水平还有待提高。桔皮素，英文名称tangeretin，化学名称：5,6,7,8,4'-五甲氧基黄酮，cas：481-53-8。分子式：c20h20o7。相对分子质量372.37da，无色结晶或结晶性粉末，属于多甲氧基黄酮，熔点154-156℃，难溶于水，易溶于乙醇、乙醚等有机溶剂。储存条件：阴凉干燥。分子结构式为：技术实现要素：本发明的目的是针对以上问题提供一种样品性质稳定、特性量值准确可靠的桔皮素标准物质的制备和定值方法。本发明实现其目的采用的技术方案为：一种桔皮素标准物质的定值方法，包括如下步骤：1)对桔皮素原料粉末取样，采用高效液相色谱面积归一化法测定所述桔皮素原料粉末中桔皮素的质量百分含量，得到桔皮素原料粉末的纯度定值p0；2)测定桔皮素原料粉末中水分质量百分含量、有机挥发性杂质质量百分含量和无机非挥发性杂质质量百分含量，结合步骤1)中测定的所述桔皮素原料粉末的纯度定值p0，按照如下公式ⅰ计算，即得到桔皮素纯度定值phplc-an；phplc-an＝p0×[100％-xw-xn-xv]×100％公式ⅰ，其中，xw为水分质量百分含量，xn为无机非挥发性杂质质量百分含量，xv为有机挥发性杂质质量百分含量；3)采用示差量热扫描法得到桔皮素纯度定值pdsc；4)按照如下公式ii计算，即得到最终的桔皮素纯度定值4、如权利要求1所述的桔皮素标准物质的定值方法，其特征在于：还包括步骤5)不确定度的分析。在上述技术方案中，步骤1)中所述高效液相色谱面积归一化法的色谱条件如下：色谱柱：agilentsb-c18(250mm×4.6mm,5.0μm)；流动相：0.2％乙酸水溶液：乙腈的体积比＝45：55；检测波长：375nm；浓度：1000mg/l；流速：1.0ml/min；柱温：25℃；进样量：10μl。在上述技术方案中，步骤3)中示差量热扫描法的测定方法为起始温度为148℃，以0.5℃/min的速率升温至158℃，待样品冷却降至熔点以下30℃时，再以同样的升温速率加热样品，得到测定桔皮素纯度的dsc图。在上述技术方案中，步骤2)中采用卡尔费休法水分测定方法测定桔皮素原料粉末中水分质量百分含量；采用顶空进样气相色谱法测定有机挥发性杂质甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、乙酸乙酯、苯、甲苯、正己烷的质量百分含量；采用电感耦合等离子体质谱法测定无机非挥发性杂质中b,ti,cr,co,ni,as,se,sr,mo,cd,sn,sb,ba的含量，采用电感耦合等离子体发射光谱法测定无机非挥发性杂质中al,ca,cu,fe,k,mg,mn,na,p,zn的含量。一种桔皮素标准物质的制备方法，包括如下步骤：首先制备标准物质：取桔皮素标准物质候选物，采用反相c18硅胶进行纯化，洗脱剂采用水与丙酮的混合物，纯化后旋蒸，干燥，保存；然后按照前述的定值方法对制备得到的桔皮素标准物质进行纯度定值。上述的桔皮素标准物质的制备方法采用反相c18硅胶进行纯化的纯化条件为反相硅胶用量150g，上样量400mg，洗脱剂比例为水：丙酮按体积比30:70。本发明的有益效果是：提供了桔皮素纯度标准物质的制备方法，制得的桔皮素纯度标准物质，已完成12个月长期稳定性监测，样品性质稳定、特性量值准确可靠，为相关柑桔产品溯源与真实性检测、保健品、化妆品和医药产品的质量监控提供技术支撑。提供的桔皮素定值方法采用了高效液相色谱-面积归一化法和示差量热扫描法(dsc)两种不同原理的方法对标准物质原料进行纯度定值，得到的结果十分准确可靠。附图说明图1是纯化后桔皮素及其杂质的色谱对比图。图2是最优条件下甲醇空白、桔皮素及其杂质的色谱图。图3是以0.5℃/min的速率测定桔皮素纯度的dsc图。图4是桔皮素纯度标准物质定值不确定度来源分析及评定流程图。具体实施方式实施例1标准物质样品制备一、标准物质制备标准物质候选物桔皮素购于南京草本源生物科技有限公司，采用反相c18硅胶进行纯化，纯化条件：反相硅胶用量150g，上样量400mg，洗脱剂比例为水：丙酮的体积比为30:70。纯化后旋蒸，采用hplc检测样品纯度，如图1所示，纯化后桔皮素的纯度由98.29％提高到99.98％，纯化效果显著。后续采用烘箱及冷冻干燥法干燥，水分降低至0.0251％。除水干燥后，充分混合均匀，置于洁净、干燥的分装环境，分装至4ml洁净agilent棕色玻璃瓶中，拧紧，盖好。每个包装量为20mg，共122瓶，低温(4℃)，避光，保存。二、主成分定性分析将制得的桔皮素标准物质采用质谱法和核磁氢谱法对候选物进行主成分定性分析，检测结果表明纯品原料主要成分为桔皮素。三、均匀性检验采用高效相色谱面积归一化法对制备的桔皮素标准物质均匀性进行检验，液相色谱条件如下：色谱柱：agilentsb-c18(250mm×4.6mm,5.0μm)；流动相：0.2％乙酸水溶液：乙腈＝45：55；检测波长：375nm；流速：1.0ml/min；柱温：25℃；进样量：10μl。测量的数据采用单因素方差分析法统计检验，由数据统计分析可知，桔皮素纯度标准物质分装单元均匀，符合技术规范要求。四、稳定性考察为考察桔皮素纯度标准物质在长期储存条件以及外部环境变化条件影响下，物质物理化学性质和特性量值保持不变的能力，根据《标准物质定值原则与统计学原理》的介绍，采用直线拟合法对桔皮素纯度标准物质开展了长期和短期的稳定性考察。1)长期稳定性考察根据jjg1006-1994《一级标准物质技术规范》中的要求，标准物质稳定性考察按照先密后疏的原则。本研究采用液相色谱法分别在第0、1、3、6、9、12个月进行稳定性考察。每次抽取2个包装，采用重量-容量法配制溶液，每个包装平行测定3次，液相色谱条件如下：色谱柱：agilentsb-c18(250mm×4.6mm,5.0μm)；流动相：0.2％乙酸水溶液：乙腈＝45：55；检测波长：375nm；浓度：1000mg/l；流速：1.0ml/min；柱温：25℃；进样量：10μl。稳定性检验结果如表1所示，并对监测结果拟合直线，由线性方程可知斜率b1和截距b0。我们将继续监测稳定性以延长标准物质的有效期。表1桔皮素纯度标准物质长期稳定性监测结果(％)2)短期稳定性考察将样品置于20℃、40℃和60℃恒温箱中(模拟运输条件)保存，分别在第1、3、5、7、9天进行稳定性监测，测定方法与长期稳定性监测相同,液相色谱条件如下：色谱柱：agilentsb-c18(250mm×4.6mm,5.0μm)；流动相：0.2％乙酸水溶液：乙腈＝45：55；检测波长：375nm；浓度：1000mg/l；流速：1.0ml/min；柱温：25℃；进样量：10μl。采用趋势分析对监测数据进行考察，考察结果显示，本标准物质在60℃及以下的运输条件下9天内可保证纯度量值稳定，具体结果如表2所示。表2桔皮素纯度标准物质短期稳定性考察结果(％)时间(天)温度条件(20℃)温度条件(40℃)温度条件(60℃)199.8599.8599.85399.8399.8299.82599.8699.8499.86799.8499.8599.82999.8499.8299.82平均值99.8499.8499.83b1-0.0005-0.0015-0.0003b099.84799.84499.849s20.0001730.00030670.0005067s(b1)0.00208200.00276900.0035590t0.95,n-23.183.183.18结论|b1|<t0.95,n-2·s(b1)，稳定|b1|<t0.95,n-2·s(b1)，稳定|b1|<t0.95,n-2·s(b1)，稳定综上所述，桔皮素纯度标准物质12个月长期稳定性良好，在20℃、40℃、60℃的模拟运输温度、9天的运输时间条件下特性量值稳定。实施例2标准物质定值参照“国家一级标准物质技术规范”，通过前期文献调研及预实验结果，本研究采用液相色谱面积归一化法和示差量热扫描法两种不同原理的方法对桔皮素纯度标准物质定值。液相色谱面积归一化法包括hplc-uv法测定桔皮素主成分、卡尔费休库伦法测定水分含量、顶空气相色谱法测定挥发性杂质含量、以及icp-ms和icp-oes测定无机元素含量等，为保证测量结果的溯源性与准确性，使用的仪器设备经过计量检定或标准物质校准。定值方法1：高效液相色谱法-面积归一化法一、高效液相色谱条件优化及测定(1)紫外全扫描高效液相色谱条件优化前做了桔皮素的紫外全扫描，桔皮素的紫外最大吸收波长为325nm，因此后续采用325nm为高效液相条件优化的波长。(2)色谱柱优化首先采用纯化前的桔皮素来优化高效液相条件。选择合适的色谱柱，能够达到更好的分析效果。根据查阅的文献，比较了sb-aq、sb-c18及eclipseplusc18色谱柱对于桔皮素及其杂质的色谱出峰情况，优化色谱柱的液相条件是：流动相：0.2％乙酸水溶液：乙腈＝45:55；波长：325nm；样品浓度：3000ppm；流速：1ml/min；进样量：5μl；柱温：25℃。使用sb-aq柱时，6.775min和11.517min左右的杂质与主峰距离较近，主成分的响应和峰形均不如sb-c18；使用eclipseplusc18时，8.395min左右的主峰的峰形太宽，杂质峰及主峰的峰形都较sb-c18色谱柱上的宽；而使用sb-c18柱时，杂质与主峰分离较好，峰形较窄，因此选用sb-c18色谱柱。(3)有机相的优化在此基础上，以0.2％乙酸水溶液为水相，比较了甲醇和乙腈作为有机相，桔皮素及其杂质的出峰情况。液相条件：色谱柱：sb-c18；水相：0.2％乙酸水溶液；波长：325nm；样品浓度：1000ppm；流速：1ml/min；进样量：5μl；柱温：25℃。甲醇作为有机相时，主成分及其杂质的响应都较低，出峰较晚，所有峰120min才能出完；乙腈作为有机相时，分离效果明显优于甲醇，同等条件下，色谱分离较完全，杂质响应显著，主峰及所有杂质的峰形较甲醇窄，因此选乙腈为有机相。(4)流动相比例的优化以0.2％乙酸水溶液为水相，乙腈为有机相，继续优化了不同流动相比例条件下桔皮素及其杂质的出峰情况。当水相与乙腈比例为30:70时，7.077min左右的杂质未能与主峰完全分开；当水相与乙腈比例为45:55时，所有杂质与主峰分离，20min内所有峰都能出完；当水相与乙腈比例为55:45时杂质与主峰完全分离，但是整体出峰时间过久，近50min。因此流动相比例选择0.2％乙酸水溶液：乙腈＝45:55。(5)波长的优化为了考察杂质在不同波长下的响应，选取了240、310、350、365、375和380nm六个不同的波长，结果显示在375nm的波长下，6.47min和15.688min的杂质响应最充分，杂质的峰面积最大，因此选择375nm为定值波长。(6)样品浓度的优化针对杂质响应程度，考察了100mg/l、500mg/l、1000mg/l及3000mg/l四种不同浓度的桔皮素甲醇溶液的色谱出峰情况，并且与甲醇溶剂空白比较。浓度为100mg/l和500mg/l时，6.47min和15.688min的杂质几乎看不到，1000mg/l浓度及以上，6.47min和15.688min的杂质较明显，杂质响应较充分，因此选用1000mg/l的浓度。综上所述，最终确定的桔皮素液相色谱条件如下：色谱柱：agilentsb-c18(250mm×4.6mm,5.0μm)；流动相：0.2％(体积百分含量)乙酸水溶液：乙腈的体积比＝45：55；检测波长：375nm；浓度：1000mg/l；流速：1.0ml/min；柱温：25℃；进样量：10μl。最优条件下甲醇空白，桔皮素色谱图如图2所示，桔皮素主峰及杂质含量表如表3所示。分离度(又称分辨率)可以判断分离物质在色谱柱中的分离情况，用r表示，等于相邻两峰的保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比。r<1时，两峰部分重叠，r＝1时，分离度可达98％，两峰基本分离；r＝1.5时，分离度可达99.7％，两峰完全分离。该色谱条件下，主成分的分离度在7以上，所有杂质的分离度都在1.5以上，分离度较好。因此该色谱条件满足桔皮素纯度标准物质的色谱测量要求。表3纯桔皮素含量表序号保留时间峰面积(微伏*秒)％面积16.4675050.0728.79768254699.87315.7254010.06二、卡尔费休法水分测定(1)主要仪器与试剂dl32型微量水分测定仪(瑞士梅特勒公司)；xs105分析天平(max＝120g,d＝0.01mg,瑞士梅特勒公司)；50μl微量注射器；库伦法阳极液coulomatak(用于酮类样品，fluka公司)；默克apura-waterstandard标准水样，含水0.1％。(2)测定步骤开启卡尔费休库仑滴定仪，仪器自动滴定水分至终点，保持滴定池中没有水分。用微量注射器吸取40μl标准水样，用天平准确称量质量，经垫片的针孔注入滴定池，输入质量进行滴定并校准。由于标定过程没有开盖造成空气进入，因此不需要扣除背景。用称量纸称取5-7mg的样品，迅速打开滴定池上塑胶盖，将样品加入反应瓶进行滴定，加样过程控制在5s左右，输入称量质量，待滴定结束，系统会自动显示计算出的含水量，每个样品重复测定5次。为了消除空气中水分对测定结果的影响，模拟加样过程、质量及时间，但是不加样进行测定，计算空气中的水分空白值，扣除空白后得到最终结果。三、有机挥发性杂质测定由于纯化过程中使用了丙酮作为洗脱剂的一部分，考虑到样品中可能会引入溶剂杂质丙酮，因此采用顶空进样气相色谱法测定了桔皮素纯度标准物质中的包括丙酮在内的8种有机挥发性杂质。具体实验过程及结果如下。(1)主要仪器与试剂shimadzu气相色谱仪(gc-2018)，氢火焰离子化检测器(fid)(岛津)，hs-10型顶空进样器(岛津)，20ml顶空进样瓶(岛津)，甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、丙酮、苯、甲苯、正己烷(中国计量科学院)。(2)实验条件与参数色谱柱db-624(0.32mm×1.8μm，30m)，载气：氢气流量：40ml/min、空气流量：400ml/min，检测器温度：260℃；程序升温条件：初始45℃保持5min，以每分钟7℃的速率升温至60℃，再以每分钟15℃的速率升温至190℃。进样量：1ml，分流比：5:1。恒温炉温度：90℃；样品流路温度：115℃；传输线温度：120℃。(3)实验步骤分别取60mg左右甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、丙酮、苯、甲苯、正己烷溶于10ml容量瓶中并准确记录其质量，dmso定容，混匀后作为母液(浓度大致为6000ppm)。标曲配制：各取1ml母液于15ml离心管中，加入9mldmso，混匀配制成600ppm左右的溶液，各取1ml600ppm左右的甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、丙酮、苯、甲苯于15ml离心管中，加dmso溶剂到10ml，配成约60ppm的7种混标，再依次稀释成30ppm、6ppm和0.6ppm的混标，混匀。正己烷配成单标，依次由600ppm稀释成60ppm、30ppm、6ppm及0.6ppm的单标，混匀。单标和混标每个浓度取2ml于20ml顶空瓶中，立即用压盖器封好，待测定。样品：称取20mg(精确至0.01mg)的样品于20ml的顶空瓶中，并准确记录样品质量，加入2ml的dmso溶解，立即用压盖器封好，待测定。挥发性溶剂信息如表4所示。样品的测定结果代入标曲计算杂质含量，并与dmso空白比较后可以确定，在保留时间2.989min、2.582min、4.234min的位置分别为丙酮、乙醇、正己烷。通过标曲计算可知，桔皮素纯度标准物质中丙酮、乙醇、正己烷的溶剂残留质量分数平均值为0.001423％、0.000564％、0.003597％。挥发性有机溶剂杂质总质量分数为0.005584％。表4挥发性溶剂信息四、无机非挥发性杂质测定(1)电感耦合等离子体质谱法采用微波消解-电感耦合等离子体质谱法(microwave-assistedicp-ms)检测橙皮素样品中的b,ti,cr,co,ni,as,se,sr,mo,cd,sn,sb,ba含量，具体实验过程如下。1)实验仪器及试剂电感耦合等离子体质谱仪(icp-ms)赛默飞世尔有限公司icp-msxseries2，万分之一分析天平，纯度>99.99％高纯氩气，cem微波消解仪(marssystem)，超纯水，硝酸(优级纯)，双氧水(优级纯)，b,ti,cr,co,ni,as,se,sr,mo,cd,sn,sb,ba单元素标准溶液，配成混合标准溶液(10mg/l)。2)实验方法标准工作曲线的建立：标准工作曲线的制作通过配置不同浓度的混标溶液(0.1ppm、1ppm、10ppm、50.0ppm、100.0ppm、500ppm)。内标液(re185，ge72)：以超纯水作介质，配成溶液浓度为5μg/l。样品前处理：微波消解法。称取7个均匀干样，每个0.100g，精确至0.0001g，于55ml消解管中，加3ml硝酸，浸泡过夜，加入1ml双氧水，盖上溶样盖，置于高压罐内，再放入微波溶样装置内，设置微波系统消解程序，开始消解试样。消解完全结束后，取出内罐，冷却至室温，用水转移入25ml容量瓶中，定容，混匀备用。同时做试剂空白。仪器条件：雾化器流量1.02l/min；扫描次数45次；辅助气流量0.80l/min；冷却气流量13l/min。(2)电感耦合等离子体发射光谱法采用微波消解-电感耦合等离子体发射光谱法(microwave-assistedicp-oes)检测橙皮素样品中的al,ca,cu,fe,k,mg,mn,na,p,zn，实验过程如下。1)实验仪器及试剂电感耦合等离子体发射光谱仪(icp-oes)agilenttechnologies5100icp-oes，万分之一分析天平，纯度>99.99％高纯氩气，空气压缩机，循环冷却水，cem微波消解仪(marssystem)，超纯水，硝酸(优级纯)，双氧水(优级纯)，al,ca,cu,fe,k,mg,mn,na,p,zn标准溶液。2)实验方法标准工作曲线的建立：标准工作曲线的制作通过配置不同浓度的混标溶液(0.1ppm、1.0ppm、5.0ppm、10.0ppm、20ppm、40ppm)。样品前处理：微波消解法。称取7个均匀干样，每个0.100g，精确至0.0001g，于55ml消解管中，加3ml硝酸，浸泡过夜，加入1ml双氧水，盖上溶样盖，置于高压罐内，再放入微波溶样装置内，设置微波系统消解程序，开始消解试样。消解完全结束后，取出内罐冷却至室温，用水转移入25ml容量瓶中，定容，混匀备用。同时做试剂空白。仪器条件：径向观察方式；rf功率1200w；雾化器流量0.70l/min；辅助气流量1.00l/min；等离子体气流量12l/min。通过以上两种方法测得的桔皮素中各个元素的含量见表5。表5桔皮素纯度标准物质中非挥发性无机元素杂质测定结果得到检测结果后，按照如下公式ⅰ计算，即得到最终的桔皮素纯度定值phplc-an；phplc-an＝p0×[100％-xw-xn-xv]×100％公式ⅰ，其中，p0为采用高效液相色谱面积归一化法测得的桔皮素原料粉末的纯度定值，xw为水分质量百分含量，xn为无机非挥发性杂质质量百分含量，xv为有机挥发性杂质质量百分含量。按照前述方法和步骤，由高效液相色谱面积归一化法测定的桔皮素纯度标准物质的质量分数为99.81％，具体检测结果见表6。表6桔皮素的高效液相色谱面积归一化法定值结果(单位：质量分数，％)定值方法2：示差量热扫描法(dsc)根据astme928，对于纯度高于98.5％的物质，dsc法是一种准确、快速且方便的纯度测定方法。其理论依据是vanthoff方程，计算公式如下：式中：t0—杂质含量为零的纯物质的熔化温度；ts—样品的熔化温度；r—气体常数；δhf—样品的摩尔热焓；x—样品中杂质的摩尔分数；f—熔化了的样品分数。vanthoff方程表明，样品熔化温度的降低与其所含杂质的摩尔分数成正比，对于特定样品来说，t0，r，x，及δht是一定的，ts只随1/f呈线性变化。因此，杂质的摩尔分数x可以通过拟合直线的斜率算出。测量前采用铟标准物质gbw(e)120182校准dsc仪器。并且优化了影响桔皮素纯度的升温速率，首次采用10℃/min的速率(室温-250℃)时桔皮素的纯度只有98.59％，纯度较低，连续多次采用10℃/min的速率测定平行样品，桔皮素纯度都很低，与液相色谱面积归一化法测定的桔皮素纯度差异较大。申请人分析，可能升温速率太快，导致纯度下降，后续在接近熔点的温度范围内采用0.5℃/min的升温速率来测定样品，熔点附近出现了两个峰，纯度有所上升，经查阅资料，dsc测试的结果熔点附近有两个吸热峰情况有很多，可能是以下几种情况：1，已经结晶的晶区因为结晶不完善，较低温度下已经开始熔融，同时，在熔融过程中，此温度下也可以结晶，(较高温度下晶核不容易生成，但由于温度高分子链运动活跃，可以以原来没有熔融的晶区作为成核位点而结晶，进而形成更有序的晶区)而发生了重结晶情况；当温度继续升高，此时重结晶的晶区才开始熔融，进而出现了两个峰。2，不稳定晶型的转变。在有些聚合物的结晶中，因为结晶温度不同，会形成不同的晶型，α、β、γ等，此外还会有一种与α晶型类似，但又没有其稳定的晶型α'晶，在较低温度下结晶形成了这种晶型后，在熔融过程中会转变成α晶，这是一种固-固转变过程，由α'晶直接转变α晶，第一个熔融峰对应少量α'晶熔融，第二个吸热峰对应α晶(由α'转变来的)的熔融，这种情况一般中间还会有一个小的放热峰。因此桔皮素熔点附近出现两个峰，可能属于第二种情况，多种晶型的转变。为了解决这种情况，使定值更加准确，将做过实验的样品再次以相同的速率做一次实验。结果如图3所示，熔点附近只出现一个峰，桔皮素纯度提高到99.85％。因此后续样品的测定方法都改为：起始温度为148℃，以0.5℃/min的速率升温至158℃，待样品冷却降至熔点以下30℃时，再以同样的升温速率加热样品，得到测定桔皮素纯度的dsc图。首次加热样品至熔点以上是为了让桔皮素熔点附近的晶型充分转变，第二次测定纯度。同时优化了晶型充分转变后第二次测定桔皮素纯度时升温速率对纯度的影响，晶型充分转变的升温速率均为1℃/min，分别考察了测定纯度的升温速率为0.5℃/min、1℃/min和3℃/min时对桔皮素纯度的影响，平行测定三次。结果表明随着升温速率的增加，桔皮素的纯度不断降低，因此选择0.5℃/min为纯度定值的升温速率。平行测定7个样品，结果如表7所示。表7桔皮素纯度的dsc测定结果(单位：％)样品1234567平均sd纯度99.8299.8399.7999.8599.7999.8299.8599.820.02三、纯度定值结果纯度定值的结果取两种不同原理方法测量结果的平均值，结果如下：其中，为最终的桔皮素纯度质量分数定值结果，phplc-an为采用高效液相色谱面积归一化法测得的桔皮素纯度质量分数定值，pdsc为采用示差量热扫描法测得的桔皮素纯度质量分数定值。综上所述，最终的桔皮素纯度质量分数定值结果为99.82％。实施例3不确定度评定桔皮素纯度标准物质不确定度来源分析及评定流程如图4所示。桔皮素纯度标准物质的不确定度由三部分组成：标准物质的均匀性引入的不确定度ubb；标准物质的稳定性引入的不确定度(短期稳定性ults和长期稳定性usts)以及标准物质定值过程引入的不确定度uchar。一、均匀性引入的不确定度根据技术规范要求，采用单因素方差分析法进行均匀性评估。均匀性标准偏差sh可以用公式计算：式中：sh为均匀性标准偏差；为组间方差；为组内方差；n为组内测量次数。在这种情况下，sh等同于瓶间不均匀性导致的不确定度分量ubb，即为公式ubb＝sh＝0.00342％。二、稳定性引入的不确定度根据表1的数据，有效期为12个月的长期稳定性的不确定度usls计算如下：usls＝s(b1)·x＝0.001054×12＝0.01265％根据表2的数据，短期稳定性引入的不确定度usts计算如下：usts＝s(b1)·x在20℃下：usts1＝s(b1)·x＝0.01874％在40℃下：usts2＝s(b1)·x＝0.02492％在60℃下：usts3＝s(b1)·x＝0.03203％所以：三、定值引入的不确定度液相色谱面积归一化法定值引入的不确定度根据液相色谱面积归一化法定值过程及其测量参数可知，液相色谱面积归一化法的不确定度u(phplc-an)计算公式如下：其中，u(phplc-an)为面积归一化法的不确定度，u(p0)为液相色谱法的不确定度，u(xw)为水分测量的不确定度，u(xn)为非挥发性杂质测量的不确定度，u(xv)为挥发性杂质测量的不确定度。(1)液相色谱的测量不确定度1)液相色谱法定值测量重复性引入的不确定度u1由测量的标准偏差计算，u1＝0.0090％2)各成分在不同检测波长下响应差异引入的不确定度:式中，bimaxλ为在6个检测波长下杂质成分i的最大百分比含量；bi定值λ为定值波长下杂质成分i的百分比含量；u2-i为杂质成分i的不确定度分量。计算得到液相色谱测定合成不确定度：(2)水分引入的不确定度天平称样引入的不确定度分量很小，所以水分测量的主要不确定来源是测量的重复性ua，水分的测量结果xw为0.0251％，标准偏差为0.0072％，因此水分测定引入的不确定度:(xw)＝0.0072％(3)其他杂质引入的不确定度天平称样引入的不确定度分量很小，所以非挥发性无机元素杂质测量的主要不确定来源是测量的重复性ua，非挥发性无机元素杂质的测量结果xn为0.00695％，由于部分元素的测定受环境、仪器的影响较大，因此，本研究中将非挥发性无机元素杂质的不确定度记为u(xn)＝0.00695％。(4)面积归一化法的标准不确定度：四、示差量热扫描引入的不确定度dsc测量法引入的不确定度包括a类不确定度和b类不确定度。a类不确定度主要由测量结果的标准偏差来计算，即ua＝0.02％。b类不确定度主要由实验测量各个量的变化来估算。由vanthoff方程：可得：式中：q—样品的热焓；m—样品的质量。所以，dsc各个量变化引入的b类不确定度可通过以下公式估算：在dsc法测量中，使用了gbw13202铟热分析标准物质。证书给定的熔化晗为3265j/mol，仪器实际测得的熔化晗为3340j/mol；所以，δq/q＝0.023，证书给定铟的熔点为156.52，不确定度为0.01℃，t0-ts为1.44℃，所以δt/(t0-ts)＝0.0069；称样使用最大量程150mg/0.001mg分析天平，样品称样量为3mg，天平称量的变动性和检定不确定度等估计为5μg，所以，δw/w＝0.0017；峰面积的相对误差为δf/f＝0.02。因此，ub，rel＝0.03；ub＝0.03×(1-99.82％)＝0.0054％；综上，dsc引入的不确定度为：由于两种定值结果等精度，因此，纯度定值引入的不确定度计算如下：五、标准物质的合成及扩展不确定度标准物质的合成不确定度计算公式如下：扩展不确定度为：ucrm＝k×ucrm＝0.104％(k＝2)。六、结果表达综上所示，桔皮素纯度标准物质的特性量值及其不确定度如表8所示。表8桔皮素纯度标准物质特性量值及其不确定度名称质量分数/％不确定度/％(k＝2)桔皮素纯度标准物质99.80.2针对本发明研制的桔皮素纯度标准物质，已完成12个月长期稳定性监测，样品性质稳定、特性量值准确可靠。当前第1页12