一种快速灵敏地测定腺苷激酶活性的比色法的制作方法

本发明属于酶活性检测领域，涉及一种快速灵敏地测定腺苷激酶活性的比色法。

背景技术

腺苷激酶(adk；腺苷5’-磷酸转移酶，ec2.7.1.20)，由kornberg于1951年在酵母细胞中首次分离得到。adk属于核糖激酶家族，是哺乳动物组织中最丰富的核苷激酶之一。adk作为嘌呤补救途径中的第一个酶，可催化三磷酸腺苷(atp)的γ磷酸基团向腺苷转移，产生amp(adenosine+atp→amp+adp)。adk通过调节细胞内和细胞外腺苷浓度，能够有效地保护心脏和神经等组织。在糖尿病模型中，降低adk的活性会抑制t-淋巴细胞的增生。adk在促进细胞内甲基化方面也起着重要作用，敲除adk(adk^-/-)的转基因小鼠中，由于adk的缺乏会导致新生鼠患急性肝脂肪变性，并在出生后第8天死亡。然而，adk在脑中的过度表达会导致癫痫频繁发生，频率为每小时四次，并且与野生型相比，adk^-/-小鼠睡眠时间更少。此外，adk还可以催化其他核苷及其类似物的磷酸化，产生相应的单磷酸。

目前有两种方法来测定adk的酶活性：一种是多酶偶联法，另一种是放射性标记法。多酶偶联法包含三种酶：adk、丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶。在该过程中，在过量的磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸激酶的存在下，adk催化反应中形成的adp被重新转化为atp。同时，在过量的nadh和乳酸脱氢酶存在下，产生的丙酮酸被催化生成乳酸，消耗nadh导致340nm处的吸光度降低。这是一个复杂的多步反应过程，每一步都存在误差，每一种酶都具有不同的最佳反应条件，因此很难平衡三种酶系统的最佳条件。此外，该方法还不能准确地反映adk催化反应的初始速率。另一种测定方法依赖于用色谱法分析放射性atp的生成。它需要特定的设备，其中一个步骤需要长达18小时。此外，放射性核苷底物对人体有害，也不能准确反映adk催化反应的初始速率。因此，非常有必要开发一种方便、快速、灵敏和低成本的测定adk酶活性的方法。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种快速灵敏地测定腺苷激酶活性的比色法，以溴麝香草酚蓝为指示剂，以atp和腺苷(adenosine)为底物，建立了一步法测定adk活性。用此方法分析了家蚕腺苷激酶(bmadk)的活性，并检测了缓冲液和ph指示剂对adk活性的影响。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种快速灵敏地测定腺苷激酶活性的比色法，以atp和腺苷为底物，溴麝香草酚蓝为指示剂，醋酸镁和甘氨酸-氢氧化钠为缓冲液，与含有腺苷激酶的待测液于614nm条件下检测吸光度。

优选的，所述溴麝香草酚蓝浓度为0.75×10^-4～1.50×10^-4g/ml。

更优选的，所述溴麝香草酚蓝浓度为1.00×10^-4g/ml。

优选的，所述腺苷浓度为0.1～0.01mm。

更优选的，含有腺苷激酶的待测液由20mmtris-hcl(ph8.0)，500mmnacl，5％glycerol的缓冲液配制而成，用0.5mnaoh调节614nm处的吸光值为2.2±0.3，使ph值为7.4±0.3。

优选的，反应体系由底物、指示剂和缓冲液组成的反应液与含有腺苷激酶的待测液按体积比为199:1组成。

更优选的，所述反应液各组分浓度如下：醋酸镁5mm，甘氨酸-氢氧化钠50mm，溴麝香草酚蓝0.01％，atp4.7mm，腺苷10mm。

本发明的有益效果在于：本发明公开了一种快速灵敏地测定腺苷激酶活性的比色法。溴麝香草酚蓝(btb)是ph6～8范围内的良好指示剂。当ph从6增加到8时，它的颜色从黄色变为蓝色，因为它可以在碱性溶液中脱质子化形成高共轭结构。以atp和腺苷为底物，醋酸镁和甘氨酸-氢氧化钠为缓冲液条件下与腺苷激酶反应后于614nm条件下检测吸光度。该方法步骤简单，不需要使用有害物质，并且检测时间短(大约1分钟)，且该方法还具有可靠、灵敏等优点，因此在替代常规adk活性的测定方面具有巨大潜力。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为adk活性测定示意图。

图2为吸光度与h⁺浓度的相关性(a：反应体系的波长扫描；b：614nm处吸光度变化与h⁺浓度的相关性)。

图3为优化反应条件(a：缓冲液对该方法灵敏度的影响；b：gly-naoh浓度对该方法灵敏度的影响；c：bromothymolblue浓度对该方法的影响；d：bromothymolblue浓度对反应体系颜色的影响)。

图4为bmadk活性测定(a：该测活反应对bmadk含量的敏感性；b：614nm处的吸光度变化与bmadk含量的相关性；c：该测活反应对腺苷浓度的敏感性；d：反应速度与腺苷浓度的函数图)。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细地描述。

本发明实施例所用化学试剂和材料如下：atp和腺苷的钠盐均购自阿拉丁(上海，中国)，醋酸镁(mgac2)购于sigma(stlouis,mo)，溴百里酚蓝钠盐、甘氨酸以及其他试剂均购自上海生工，塑料比色皿购买于centome(成都，中国)，bamhi和hindiii购买于takara(大连，中国)，镍填料是ge公司(usa)的产品，特异性引物由上海生工合成。

实施例1、bmadk的制备及浓度测定

从家蚕cdna中克隆bmadk基因，克隆引物如下：正向引物5′-cgcggatccatggacgtttctgattccatatgtg-3′(seqidno.1)；反向引物5′-cccaagctttcagtcattgtattcgctgggtc-3′(seqidno.2)。经bamhi和hindiii酶切后，插入pskb2表达载体，在25℃下于大肠杆菌中表达，用镍柱亲和层析和凝胶过滤层析纯化。利用nanodrop2000c分光光度计(thermofisher,usa)测定bmadk浓度。通过12.5％sds-page和考马斯蓝染色后，发现bmadk纯度达到99％，纯化后bmadk的最终浓度为3.68mg/ml。

实施例2、adk活性分析优化

以atp和腺苷为底物，adk催化反应生成的氢离子改变了反应体系的ph值，从而导致反应体系的颜色变化，可以很容易地由吸光度变化来表示。吸光度的变化与氢离子浓度成正比。因此，可以根据吸光度变化来确定adk活性和初始反应速度，反应原理如图1所示。

为了确定反应体系的最大吸收波长，用盐酸改变体系的ph值，并对反应体系进行波长扫描。在反应体系(990μl)中加入盐酸(10μl)的连续稀释液，充分混合。在平衡3分钟后，对每个样品进行450～800nm的全波长扫描，结果如图2中a所示。结果显示，反应体系在614nm处观察到最大吸收峰。在614nm处的吸光度随着盐酸浓度的增加而降低，表明在614nm处的吸光值与氢离子浓度之间具有一定的相关性。

为了确定吸光度和h⁺浓度之间的相关性，绘制了在614nm处的吸光度变化对氢离子浓度的散点图，结果如图2中b所示。结果显示，吸光度变化与h⁺浓度之间的关系可以由以下方程线性拟合：y＝0.4457x+0.0411，r²为0.9937。结果表明，614nm处的吸光度变化与氢离子浓度呈正相关。

adk活性测定的可行性：

adk催化的反应伴随着h⁺的生成，这将降低反应体系在614nm处的吸光度。因此，可以通过记录614nm处的吸光度来监测反应的发生。我们利用纯化的bmadk分析了该方法的可行性。结果表明，614nm处的吸光度随时间的延长而降低，表明利用该方法测定adk活性是可行的。

反应体系如下：1ml0.1mmgac2，1ml1mgly-naoh(ph9.0)，2ml0.1％溴麝香草酚蓝，48mgatp和53mg腺甘酸，并加超纯水至总体积20ml获得反应混和液，其各组分浓度如下：5mmmgac2(醋酸镁)，50mmgly-naoh(甘氨酸-氢氧化钠)，0.01％溴麝香草酚蓝，4.7mmatp，和10mm腺苷。用0.5mnaoh调节614nm处的吸光值约为2.2±0.3，使反应混合液ph值接近7.4±0.3，反应混合物需现配现用。将bmadk(3.68mg/ml)用tris-buffer(20mmtris-hcl,500mmnacl,5％glycerol,ph8.0)进行梯度稀释，然后取5μl稀释后的bmadk加入995μl反应混合物中，利用光程为1cm的塑料比色皿，在du800核酸/蛋白分析仪(beckman，usa)上记录反应体系在180s内614nm处的吸光度。反应速度定义为反应前10s在614nm处吸光值变化直线的斜率。

缓冲液和ph指示剂的优化：

为了进一步稳定反应体系并提高测定的灵敏度，对缓冲液和ph指示剂的条件进行了优化。用2-环己基氨基乙烷磺酸(ches)(1m，ph9.0)代替gly-naoh溶液，在60s内测量了614nm的吸光度，结果如图3中a所示。结果显示，ches缓冲液对h⁺不敏感，因此降低了反应体系的灵敏度。

接着，研究了浓度分别为50mm、60mm、70mm、80mm和90mm的gly-naoh缓冲液对反应的影响，结果如图3中b所示。结果显示，gly-naoh缓冲液的浓度对反应的灵敏度影响不大。

此外，分别用浓度为0.5×10^-4g/ml、0.75×10^-4g/ml、1.00×10^-4g/ml、1.25×10^-4g/ml和1.50×10^-4g/ml的溴麝香草酚蓝评估了溴麝香草酚蓝浓度对反应的影响，结果如图3中c所示。结果显示，除0.005％外，所有浓度的溴麝香草酚蓝都可因h⁺的生成而对614nm处的吸光度变化作出响应。在浓度测试中，溴麝香草酚蓝的最佳浓度为0.01％，因为它具有最高的灵敏度。同时观察不同浓度溴麝香草酚蓝对反应体系颜色的影响，如图3d所示。结果显示溴麝香草酚蓝的浓度可以改变反应体系的颜色。因此，根据反应体系的颜色，可简单判别溴麝香草酚蓝的浓度。

为了评估该测定的灵敏度，使用梯度稀释的bmadk(用量分别为3.10μg、3.70μg、4.60μg、6.10μg、7.30μg、9.20μg、12.3μg、15.3μg和18.4μg)分析614nm处的吸光度变化，如图4中a所示。结果表明，3.7μg的bmadk足以使614nm处的吸光度发生变化，表明该方法灵敏度高，能检测到微量的bmadk。

接下来，分别用3.10μg、3.70μg、4.60μg、6.10μg、7.30μg、9.20μg、12.3μg、15.3μg和18.4μg的bmadk，分析了bmadk含量与吸光度变化的关系，如图4中b所示。结果表明，在614nm处的吸光度变化与bmadk含量呈正相关。它可以利用如下的方程进行线性拟合：y＝0.0227x-0.0339，相关系数为0.9904。

之后，分析了不同的腺苷浓度(0.100mm、0.050mm、0.040mm、0.030mm、0.020mm、0.010mm、0.005mm)对614nm处吸光度变化的影响。结果表明，腺苷浓度低至5μm时，仍能观察到614nm处吸光度的变化(图4，c)，表明该方法具有较高的灵敏度。

最后，用该方法测定了bmadk的km和vmax，分别为0.022mm和4.72×10^-3/s(图4，d)。

当前，酶在各个领域都发挥着重要的作用。一种好的酶学测活方法的建立，特别是当该方法极具特异性、灵敏性、重复性和经济性时，将会拥有广阔的应用前景。adk是嘌呤补救途径中的第一个酶，也是最广泛、最丰富的核苷激酶之一，在癫痫和缺血动物模型中起着重要的调节保护作用。哺乳动物(包括人)中存在两种亚型的adk蛋白，adk-l和adk-s。adk-l定位于细胞核内，而adk-s存在于细胞质中，并且不同组织器官中表达的adk亚型也不尽相同，发挥的功能也不一样。传统的adk活性测定方法过于复杂，不能直接测定反应的初始速率，并且这些检测需要昂贵的酶和特殊设备，且其放射性底物对人体有害。因此，开发一种简便、快速、灵敏、经济的检测adk活性的方法具有重要意义。

本研究建立了以溴麝香草酚蓝为ph指示剂分析adk活性的分光光度法，在ph7.4下测定了adk的初始速度。因此，我们将反应体系在614nm处的初始吸光度调整至2.2，使其ph值接近7.4。

该反应体系对adk催化引起的h⁺浓度变化具有灵敏和稳定的响应。614nm处的吸光度变化与h⁺浓度呈正相关。因此，我们可以很容易地确定adk的活性和反应的初始速度。

此外，我们还考察了缓冲液和溴麝香草酚蓝对反应敏感性的影响，并分析了该方法对adk含量和腺苷浓度的敏感性。我们使用开发的方法计算了bmadk的km和vmax。结果表明，该方法可行、简便、快速、可靠，对adk活性敏感。

总之，我们开发了一种简单快速的以溴麝香草酚蓝作为指示剂而不是多酶偶联测定adk活性的方法。该分光光度法简便、快速、灵敏、可靠、成本低。因此，它可以很好的替代传统的多酶偶联测定法，并广泛应用于临床和实验室研究。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>西南大学

<120>一种快速灵敏地测定腺苷激酶活性的比色法

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<213>人工序列(artificialsequence)

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