本发明属于真菌毒素检测
技术领域：
，具体涉及一种用于赭曲霉毒素a快速检测的上转换适配体试纸条的制备方法。
背景技术：
赭曲霉毒素是继黄曲霉毒素后又一个引起世界广泛关注的霉菌毒素。它是由曲霉属的7种曲霉和青霉属的6种青霉菌产生的一组重要的、污染食品的真菌毒素，4种，其中毒性最大、分布最广、产毒量最高、对农产品的污染最重、与人类健康关系最密切的是赭曲霉毒素a。中国专利201611111887.7，一种马铃薯病毒快速检测试纸条及其制备方法和应用，该试纸条采用抗体作为识别物质达到对靶标的检测目的。但抗体本身的制备周期长，过程复杂，是的试纸条的制备费时费力，且仅能实现定性检测。中国专利201710641207.0，用于检测乙酰胆碱酯酶的胶体金层析快速诊断试纸条及其制备方法，该技术采用胶体金为标记物，抗体为识别物，可实现对乙酰胆碱酯酶的快速检测，但无法实现定量的目的。且抗体的应用增加了其制备难度及成本。中国专利201510662526.0，一种定量检测猪口蹄疫病毒的免疫荧光试纸条，该试纸条通过与荧光检测仪连用，可初步达到定量检测的目的。但所采用的识别物质仍为抗体，增加了其制备难度及成本。因此，制备一种能够快速、准确、高灵敏度、高特异性的检测试纸是有现有技术有待解决的技术问题。技术实现要素：本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种用于赭曲霉毒素a快速检测的上转换适配体试纸条的制备方法。为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种用于赭曲霉毒素a快速检测的上转换适配体试纸条的制备方法，其特征在于：包括，上转换发光纳米材料的制备及改性：将含有yb3+、y3+、er3+的无机盐加入油酸、十八烯混合、搅拌并通入惰性气体，加热，形成均一溶液；将氟化铵、氢氧化钠溶于甲醇后加入上述溶液中，加热蒸发除去甲醇，通入惰性气体进行反应，加入冷凝回流装置、升温进行反应，得到上转换发光纳米材料；将聚丙烯酸、乙醇混合，将所述上转换发光纳米材料分散于氯仿溶液后加入到聚丙烯酸、乙醇混合溶液中，搅拌反应，得到改性的上转换发光纳米材料；制备上转换适配体探针：将所述改性的上转换发光纳米材料与适配体偶联，制备上转换适配体探针；适配体在试纸条硝酸纤维素膜上的固定：将适配体识别序列与非识别序列的互补序列dnaota和dnapolya通过链霉亲和素固定在硝酸纤维素膜的检测线及质控线上。作为本发明所述的用于赭曲霉毒素a快速检测的上转换适配体试纸条的制备方法的一种优选方案：所述上转换发光纳米材料中，ycl3含量为78％、ybcl3含量为20％、ercl3含量为2％，以体积比计，所述油酸：十八烯＝2：5。作为本发明所述的用于赭曲霉毒素a快速检测的上转换适配体试纸条的制备方法的一种优选方案：所述上转换发光纳米材料改性，包括，将ybcl3·6h2o、ycl3·6h2o和ercl3加入6ml油酸和15ml十八烯，在搅拌、通氮气环境下，逐渐升温至160℃，使试剂形成均一的溶液，自然冷却至室温，称取4mmolnh4f和2.5mmolnaoh溶于10ml甲醇溶液中，将上述溶液逐滴加入到三口烧瓶中，升温至60℃磁力搅拌30min，后逐渐升温蒸发去除甲醇；持续通氩气，加入冷凝回流装置，升温至300℃，持续反应1h，反应结束后，关闭装置，自然冷却至室温，用水和乙醇将材料离心清洗三次，并于70℃下烘干8h，得到所述上转换发光纳米材料。作为本发明所述的用于赭曲霉毒素a快速检测的上转换适配体试纸条的制备方法的一种优选方案：所述上转换发光纳米材料改性，还包括，将200mg聚丙烯酸和8ml无水乙醇溶液搅拌均匀，将30mg所述上转换发光纳米材料分散于4ml氯仿溶液，并逐滴加入聚丙烯酸和无水乙醇溶液中，磁力搅拌反应24h后，离心收集材料，得到所述改性的上转换发光纳米材料。作为本发明所述的用于赭曲霉毒素a快速检测的上转换适配体试纸条的制备方法的一种优选方案：所述制备上转换适配体探针，包括将20mg所述改性的上转换发光纳米材料分散于4ml浓度为10mm的吗啡啉乙磺酸缓冲溶液中，超声分散后，加入0.2ml浓度为5mg/mln-羟基硫代琥珀酰亚胺和0.1ml5mg/ml1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液，于37℃摇床中震荡2h进行羧基活化，离心洗涤后分散于2ml水溶液中，加入氨基化适配体，37℃下孵育24h，离心洗涤后分散于2ml水中，得到所述上转换适配体探针。作为本发明所述的用于赭曲霉毒素a快速检测的上转换适配体试纸条的制备方法的一种优选方案：所述适配体在试纸条硝酸纤维素膜上的固定，包括，取0.125mg/ml链霉亲和素100μl，分别加入100μmdnaota及dnapolya，震荡混匀，并将混合液置于37℃摇床中孵育30min，用点晶喷膜仪将两种混合液分别喷涂于硝酸纤维素膜上，喷涂量为0.8μl/ml，两条线间距为0.5mm，将处理后的硝酸纤维素膜放于37℃烘箱中1h。作为本发明所述的用于赭曲霉毒素a快速检测的上转换适配体试纸条的制备方法的一种优选方案：所述硝酸纤维素膜包括sartoriuscn140硝酸纤维素膜。作为本发明所述的用于赭曲霉毒素a快速检测的上转换适配体试纸条的制备方法的一种优选方案：所述适配体序列aptota1为：5’-nh2-ttttttttttttttttttttttttttttttgatcgggtgtgggtggcgtaaagggagcatcggaca-3’；所述适配体识别序列与非识别序列的互补序列dnaota，其序列为5’-bio-tgtccgatgctccctttacgccacccacacccgatc-3’，所述dnapolya其序列为5′-bio-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa-3′。本发明的有益效果：本发明提供了一种新的层析试纸条技术，可以有效提高试纸条的灵敏度，降低制作成本，并达到定量检测的目的。本发明将适配体应用于层析试纸条中，作为识别分子，代替抗体进行靶标识别。同时，将上转换发光纳米材料作为试纸条的信号标记物，充分利用上转换材料优良的光学性能，提高试纸条的灵敏度，减少背景干扰，使结果更准确，达到准确定量的目的。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：图1为本发明三种上转换发光材料ucnps1、ucnps2、ucnps3的tem图。图2为本发明三种上转换发光材料ucnps的发光光谱图。图3为本发明三种ucnps滴加至试纸条上后的结果图。图4为本发明三种上转换探针滴加至具有不同硝酸纤维素膜试纸条的结果图。图5为上样量分别为10μl(a)，20μl(b)，30μl(c)和40μl(d)的ota试纸条检测结果图。图6为本发明工艺流程图。具体实施方式为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。本发明将上转换发光纳米材料(ucnps)通过聚丙烯酸改性，使其表面具有羧基基团，连接氨基修饰的适配体(aptota1)形成上转换适配体探针ucnps-aptota1。将适配体识别序列与非识别序列的互补序列dnaota和dnapolya通过链霉亲和素固定在硝酸纤维素膜的检测线(t线)及质控线(c线)上。当待测液中没有赭曲霉毒素a(ota)存在时，ucnps-aptota分别被t线与c线上的互补序列捕获，在980nm激光发射器下可观察到两条绿色发光条带；当待测液中有ota存在时，ucnps-aptota1将靶标捕获形成复合结构。由于识别序列被占据，无法与t线的互补序列dnaota结合，因而在980nm激光发射器下检测线条带亮度降低或消失。但无论靶标是否存在，c线上的互补序列dnapolya均可通过通过碱基互补配对方式捕获ucnps-aptota1。实施例1：合成上转换发光纳米材料ucnps1：称取ybcl3·6h2o、ycl3·6h2o和ercl3(78％y3+，20％yb3+，2％er3+)加入到100ml三口烧瓶中，并加入6ml油酸和15ml十八烯。在搅拌、通氮气环境下，逐渐升温至160℃，使试剂形成均一的溶液，自然冷却至室温。称取4mmolnh4f和2.5mmolnaoh溶于10ml甲醇溶液中。将上述溶液逐滴加入到三口烧瓶中，升温至60℃磁力搅拌30min，后逐渐升温蒸发去除甲醇。持续通氩气，加入冷凝回流装置，升温至300℃，持续反应1h。反应结束后，关闭装置，自然冷却至室温。用水和乙醇将材料离心清洗三次，并于70℃下烘干8h，得白色固体粉末，储存备用。选用聚丙烯酸作为配体交换剂，在常温下进行羧基化修饰：于圆底烧瓶中，加入200mgpaa和8ml无水乙醇溶液，搅拌均匀，使其充分溶解。称取30mg油酸修饰的nayf4:yb,er上转换材料分散于4ml氯仿溶液，并逐滴加入到圆底烧瓶中。磁力搅拌24h后，离心收集材料，用超纯水离心清洗三次，得到羧基基团修饰的改性上转换材料，储存备用。制备上转换适配体探针：取改性后的上转换发光材料ucnps120mg，分别分散于4ml，10mm吗啡啉乙磺酸(mes)缓冲溶液中，超声分散后，加入0.2ml，5mg/mln-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-nhs)和0.1ml5mg/ml1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)溶液，于37℃摇床中震荡2h进行羧基活化。离心洗涤后，将ucnps1分散于2ml水溶液中，加入氨基化适配体aptota1(适配体终浓度均为1000nm)，37℃下孵育24h后，离心洗涤，将材料分散于2ml去离子水中得到与适配体偶联的上转换探针ucnps1-aptota1。取0.125mg/ml链霉亲和素100μl，分别加入100μmdnaota及dnapolya，震荡混匀，并将混合液置于37℃摇床中孵育30min。用点晶喷膜仪将两种混合液分别喷涂于sartoriuscn140硝酸纤维素膜上，喷涂量为0.8μl/ml，两条线间距为0.5mm。将处理后的硝酸纤维素膜放于37℃烘箱中1h，取出后装于密封袋中置于干燥避光环境下保存备用。将吸水纸、样品垫、pvc底板及硝酸纤维素膜组装并切割成4mm宽的试纸条，放于干燥避光环境下备用。图6为本发明工艺流程图。适配体序列为aptota1：5’-nh2-ttttttttttttttttttttttttttttttgatcgggtgtgggtggcgtaaagggagcatcggaca-3’。啤酒样品中赭曲霉毒素a的检测：用本方法对啤酒样品中的ota含量进行测定。对样品进行预处理：将啤酒样品置于4℃冰箱冷藏30min，超声得脱气后样品40g。将液体倒入50ml容量瓶中，加提取液(150g氯化钠和20g碳酸氢钠加水定容至1l)定容，混匀，用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清透明，收集滤液。接着选取不同浓度的ota标准品分别加入到处理好的啤酒样品中，至ota终浓度分别为0ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、300ng/ml和500ng/ml。将混合液混匀后取30μl滴加到新制赭曲霉毒素a试纸条的样品垫上，1min后用pbs(ph7.4)冲洗，观察结果，见表1。采用加标回收的方法对所构建的试纸条准确性、灵敏度等进行验证，结果显示赭曲霉毒素a的回收率为95.2％～115.6％，可满足现场灵敏快速检测。表1实施例1对啤酒样品中的ota含量进行测定样品ota浓度(ng/ml)检测结果仪器检测结果(ng/ml)回收率10阴性0/25阳性5.21104.25310阳性10.51105.10％420阳性23.11115.56％550阳性48.5297.04％6100阳性95.1795.17％7300阳性//8500阳性//实施例2：合成上转换发光纳米材料ucnps2，具体方法如下：将0.3gnaoh，1.5ml去离子水，5ml油酸和10ml乙醇依次加入到100ml烧杯中，快速搅拌混合，形成透明均一溶液。称取1.6mly(no3)3·6h2o(0.5mol/l)，0.9mlyb(no3)3·5h2o(0.2mol/l)，0.1mlyb(no3)3·5h2o(0.2mol/l)逐滴加入到上述溶液中，剧烈搅拌混合。称取0.168gnaf溶于4ml去离子水中，并逐滴加入到上述混合溶液中。剧烈搅拌15min，随后将混合液转移到100ml带聚四氟乙烯内衬的反应釜中，于200℃下反应8h。反应结束后，取出反应釜自然冷却至室温，取底部沉淀，用乙醇离心洗涤三次，并于70℃下烘干8h，得白色固体粉末，储存备用。选用聚丙烯酸(paa)作为配体交换剂取代上转换材料表面的油酸配体，高温加热下对上转换材料进行羧基修饰，使其可溶于极性溶液。在三口烧瓶中，将0.5gpaa加入到10ml二甘醇溶液中溶解，加热到110℃并剧烈搅拌15min。称取30mg油酸修饰的nayf4：yb，er上转换材料分散与2ml甲苯溶液中，并迅速转移到混合液中混合，维持高温搅拌15min以便蒸发甲苯。随后升温至240℃，反应1h。反应结束后停止加热，冷却至室温，并加入过量稀盐酸，离心得白色沉淀。用超纯水离心清洗三遍，得到羧基基团修饰的上转换材料，储存备用。实施例3：合成上转换发光纳米材料ucnps3，具体方法如下：取0.18gy2o3(28％)，0.788gyb2o3(70％)和0.022ger2o3(2％)，分别加入到硝酸溶液中，加热溶解，并蒸发掉多余硝酸，得到上述稀土元素的硝酸盐粉末。置于8ml去离子水溶解后，加入2.1273g乙二胺四乙酸(edta)，调节溶液ph呈弱碱性，充分溶解。量取25ml乙二醇溶液，加入0.4g十六烷基三甲基溴化铵(ctab)和上述混合液，快速搅拌。逐滴加入1.5mlhf。待溶液呈白色乳状胶体后，加入3.5ml浓硝酸，搅拌均匀后转移到100ml带聚四氟乙烯内衬的反应釜中，于195℃下反应24h。反应结束后关闭装置，取出反应釜，自然冷却至室温。取下层沉淀，加入热水冲洗，充分搅拌后静置。待固体沉淀后弃上层液体，再次加入热水搅拌，重复3次。最后加入乙醇溶液超声分散，离心得到所需材料，于70℃下烘干8h，得固体粉末，储存备用。将5mg制备好的ucnps3溶于2ml环己烷溶液中，加入0.1g十六烷基三甲基溴化铵(ctab)和20ml去离子水。混合液在室温下剧烈搅拌以蒸发多余的环己烷，形成透明的ucnps–ctab溶液。取10ml转移到20ml去离子水中，加入3ml乙醇和150μl浓度为2m的naoh溶液，持续搅拌。升温至70℃，加入200μl正硅酸乙酯(teos)，反应10min。将材料离心，用酒精清洗三次，得到硅层包覆的上转换材料ucnps3@msio2。将新制ucnps3@msio2转移到50ml含0.3gnh4no3的乙醇溶液中，60℃下反应2h以除去材料表面的ctab。此时上转换材料虽可溶于极性溶液，但表面不具有可与适配体连接的基团，因此利用氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)作为硅烷偶联剂，在上转换材料表面连接氨基集团，离心得氨基包覆的ucnps3@msio2材料。实施例4：上转换材料与氨基化、羧基化赭曲霉毒素a适配体aptota1、aptota2的偶联：本发明中，氨基修饰的赭曲霉毒素a适配体序列aptota1：5′-nh2-ttttttttttttttttttttttttttttttgatcgggtgtgggtggcgtaaagggagcatcggaca-3′；羧基修饰的赭曲霉毒素a适配体序列aptota2：5′-cooh-ttttttttttttttttttttttttttttttgatcgggtgtgggtggcgtaaagggagcatcggaca-3′生物素修饰的赭曲霉毒素a适配体识别序列的互补序列dnaota为：5′-bio-tgtccgatgctccctttacgccacccacacccgatc-3′，生物素修饰的赭曲霉毒素a适配体非识别序列的互补序dnapolya为：5′-bio-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa-3′。取上转换材料ucnps1、ucnps2各20mg，分别溶于4ml10mmol吗啡啉乙磺酸(mes)缓冲溶液中，超声分散后，加入0.2ml5mg/mln-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-nhs)，0.1ml5mg/ml1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)溶液，于37℃摇床中震荡2h进行羧基活化。离心洗涤后，将ucnps1、ucnps2分别分散于2ml水溶液中，各加入氨基化适配体aptota1；ucnps3分散于2ml水溶液中，加入羧基化适配体aptota2(适配体终浓度为1000nm)，37℃下孵育24h后，离心洗涤，材料溶于2ml去离子水中得三种与适配体偶联的上转换探针ucnps1-aptota1、ucnps2-aptota1和ucnps3-aptota2。不同上转换发光纳米材料的表征：对制备的三种nayf4：yb，er上转换发光纳米材料及其改性后材料进行表征，结果如图1所示。图1a为上转换材料ucnps1tem图；图1b为上转换材料ucnps1改性后tem图；图1c为上转换材料ucnps2tem图；图1d为上转换材料ucnps2改性后tem图；图1e为上转换材料ucnps3tem图；图1f为上转换材料ucnps3改性后tem图。tem结果显示油酸包被的nayf4：yb，er上转换材料ucnps1粒径约为40±6nm(如图1a)，在非极性溶液中具有较好的分散性和均一性。改性后材料tem表征结果如图1b所示，结果显示改性后的上转换材料粒径约为40±6nm，且具有良好的分散性和均一性。对上转换发光纳米材料ucnps2进行表征，结果如图1c。tem结果显示油酸包被的nayf4：yb，er上转换材料呈正方形，粒径约为15±8nm，且在非极性溶液中具有良好的分散性和均一性。改性后材料tem表征结果如图1d所示，结果显示改性后材料仍为正方形，粒径约为15±8nm，且具有良好的分散性和均一性。对nayf4：yb，er上转换发光纳米材料ucnps3进行表征，结果如图1e。tem结果显示油酸包被的nayf4：yb，er上转换材料呈椭圆形，粒径约为40±10nm，且在非极性溶液中具有良好的均一性。为使材料能溶于极性溶液，先将材料表面包覆硅层，后借助硅烷-peg-羧基再其周围连接羧基，如图1f所示。tem结果显示材料表面成功包覆硅层，仍呈椭圆形，粒径约为50±10nm，且具有良好的均一性，材料轻微聚集。上转换发明纳米材料的选择：取相同浓度的三种上转换材料比较其在980nm激光照射下的发光强度，结果如图2所示。由发光光谱图可看出，上转换材料ucnps1和ucnps3发光性较好。除发光强度之外，材料的分散性会影响其在试纸条上的流动性，间接影响试纸条的性能。若材料流动性不佳，则探针会聚集在样品垫上，无法通过硝酸纤维素膜，严重影响试纸条的灵敏度。取等量的三种上转换适配体探针滴加于新制ota上转换适配体试纸条的样品垫上，1min后用pbs冲洗。为观察上转换适配体探针在整个试纸条上的流动情况，需扩大照射范围。因此在980nm激光发射器上连接扩束器，将光束发散，得到更大的观察区域，结果如图3所示，图3a代表ucnps1，图3b代表ucnps2，图3c代表ucnps3。实验结果可知，上转换材料ucnps3因颗粒聚集，导致流动性不佳，大量探针残留在样品垫上，t、c线均较暗，不利于实际样品的检测；ucnps2流动性虽较ucnps3好，但在样品垫及硝酸纤维素膜上仍有部分残留，且因发光性较差导致t、c线亮度较弱；而ucnps1在流动性、发光性方面均优于另外两种材料。硝酸纤维素膜的选择：在上述实验基础上，选取不同孔径的硝酸纤维素膜whatmanae99、millipore135、sartoriuscn140和pallvivid170制成四种不同的ota上转换试纸条。将新制的上转换适配体探针ucnps1-aptota1滴加到样品垫上，1min后用pbs冲洗。为观察探针在整个试纸条上的迁移情况，将扩束器连接在980nm激光发射器上，扩大观察范围，结果如图4所示，图4a表示whatmanae99，图4b表示millipore135，图4c表示sartoriuscn140，图4d表示pallvivid170。由图可知，whatmanae99和millipore135两种硝酸纤维素膜制成的试纸条在上转换适配体探针流过之后虽无残留，但t线及c线颜色均较浅，不利于实际检测中观察t线的变化；pallvivid170孔径的硝酸纤维素膜因孔径较小，流速过慢，膜上反应时间较长，使得两条条带颜色较深，但膜上有大量残留，定量时存在背景干扰，影响结果准确性。而sartoriuscn140孔径的硝酸纤维素膜条带颜色较深，且膜上几乎无残留，因此选用sartoriuscn140孔径的硝酸纤维素膜。上样量的优化：上样量指底物与上转换适配体探针孵育后滴加至试纸条上的体积。取不同体积(10，20，30和40μl)的上转换适配体探针分别与ota标准品混合(ota终浓度为20ng/ml)，孵育后滴加在制备好的试纸条上。1min后用pbs冲洗，观察结果，如图5所示，a组为空白对照，b组为20ng/mlota的实际检测结果，上样量分别为10μl(a)，20μl(b)，30μl(c)和40μl(d)。由图可知，当上样量较小时，由于探针数量较少，加入ota后虽出现明显的阳性结果，但条带颜色较浅，不利于观察。上样量较大时，仍可观察到检测线，灵敏度较差。且硝酸纤维素膜上有大量残留，存在背景干扰，不易结果定量。因此，30μl为最佳上样量。综上，本发明提供了一种新的层析试纸条技术，可以有效提高试纸条的灵敏度，降低制作成本，并达到定量检测的目的，本发明检测时间仅需1min。本发明将适配体应用于层析试纸条中，作为识别分子，代替抗体进行靶标识别。同时，将上转换发光纳米材料作为试纸条的信号标记物，充分利用上转换材料优良的光学性能，提高试纸条的灵敏度，减少背景干扰，使结果更准确，达到准确定量的目的。应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。当前第1页12