乳汁中PEDV免疫检测层析试纸条及其制备方法和应用与流程
本发明涉及免疫层析检测技术领域，具体涉及一种乳汁中pedv免疫检测层析试纸条及其制备方法和应用。
背景技术
猪流行性腹泻(ped)是由pedv(猪流行性腹泻病毒)引起的一种烈性猪传染病，是目前全球传播较广的一种猪的传染病，我国将其列为二类动物传染病。ped在多个国家流行，并有愈演愈烈的趋势，各国都加强了对流行性腹泻的监控。
研究者在对2015年和2017年多个地区发生和流行仔猪腹泻性疾病进行流行病学调查表明，这次多个地区发生和流行仔猪腹泻性疾病，主要病原是猪流行性腹泻病毒。其次是传染性胃肠炎，也还有猪轮状病毒病、kobu病毒病等，部分养殖场还有致病性大肠杆菌和沙门氏菌继发感染。在本次流行病学研究中发现，在母猪奶汁中发现大量的pedv病毒存在，荧光rt-pcr的ct(cycletimes)值有时小于小猪小肠内容物的ct值，表明母猪奶汁中pedv的含量高于发病仔猪小肠中病毒含量。这与猪场反映刚出生的仔猪吃完母猪奶汁后即出现腹泻的现象一致。尽管母猪不发病，建议有腹泻病例的猪场暂时停止喂饲刚出生的仔猪。
对pedv的快速诊断是防控ped流行的前提和基础，但传统的鉴别诊断方法，如病毒的抗原检测、病毒的免疫电镜观察、病毒的分离与鉴定等，都需要十分烦琐的病料前处理，不但工作量大、耗时长，而且操作复杂、诊断成本高。因此，建立一个操作简单、灵敏度高，特异性强、检测时间短的能够广泛运用的诊断方法显得尤为迫切。建立pedv的快速检测方法，包括分子生物学检测方法和现场免疫学检测方法，同时对具有相同症状引起猪腹泻的pedv、tgev、prova进行鉴别诊断。在建立病原体检测的基础上，建立怀孕母猪初乳中是否有pedv保护性母源抗体iga，对于仔猪出生后是否可以吸取母猪的乳汁来获得pedv的母源抗体保护，还是母猪乳汁中含有pedv而不能哺乳仔猪以免引起病毒从母猪传染给仔猪，这对于防控仔猪感染pedv感染具有重要的意义。
技术实现要素：
本申请的目的提供一种乳汁中pedv免疫检测层析试纸条及其制备方法和应用。
为了实现上述目的，本申请采用了一下技术方案：
本申请的一方面公开了一种乳汁中pedv免疫检测层析试纸条，包括搭接在支撑材料上的样品垫和层析条；层析条上设置有检测线和质控线，检测线上固定有pedv灭活全病毒，质控线上固定有羊抗兔igg抗体；样品垫上喷涂有量子点标记s1重组蛋白探针和量子点标记兔igg探针。
需要说明的是，本申请利用夹心法的原理，为了使pedv荧光量子点iga抗体检测试纸条具有控制线，引入了兔igg和羊抗兔igg作为内对照系统；并且，将pedv灭活全病毒固定在检测线上，在样品垫上喷涂量子点标记s1重组蛋白探针和量子点标记兔igg探针；使用时，如果待测的乳汁中存在pedviga抗体时，iga抗体与量子点标记s1重组蛋白探针中的s1重组蛋白结合后，层析到检测线时会被包被的pedv灭活全病毒中的全抗原捕获，从而在检测线位置聚集，形成紫外可激发的t带；同时样品垫上量子点标记兔igg探针会穿过固定有pedv灭活全病毒的检测线，即t带，层析到质控线位置时会被包被的羊抗兔igg捕获，从而在质控线位置聚集，形成质控内对照c带。质控线和检测线捕获的量子点在365nm紫外光照射下会发出明亮的荧光条带，通过检测仪分析这些荧光信号，就能确定母猪乳汁中是否含有pedv保护性的母源抗体iga。检测仪检测到的荧光信号强度与捕获到的量子点量相关。所能检测到的检测线最低荧光信号所对应流感病毒量即为该荧光免疫层析系统的灵敏度。
可以理解，本申请中支撑材料、样品垫、层析条等材料可以参考现有的免疫层析试纸，在此不做具体限定；甚至抗体包被方法、抗体与量子点的结合方法、喷涂方法等都可以参考现有技术，在此不做具体限定。
还需要说明的是，借助荧光量子点高灵敏的特性，结合抗原抗体特异性结合的特点，可检测被病毒感染或免疫过的动物或人的体液中的抗体是否存在，特别是检测不适用于血清学检测的主要成分是iga抗体，较少igg抗体的体液，比如在pedv感染或免疫过的母猪的乳汁中抗体的检测。本申请的免疫层析抗原检测试纸条具有灵敏度高，特异性好，且检测周期短的优势，适合用于猪流行性腹泻病毒的分子生物学检测和大规模的流行病学调查。
优选的，量子点标记s1重组蛋白探针由pedv的s1重组蛋白通过酰胺键与羧基功能化的量子点共价连接而成；量子点标记兔igg探针由兔igg通过酰胺键与羧基功能化的量子点共价连接而成。
优选的，本申请的s1重组蛋白由seqidno.1和seqidno.2所示序列的引物组扩增的核酸片段克隆表达。
优选的，层析条为硝酸纤维素膜。
优选的，样品垫为玻璃纤维垫。
本申请的另一面公开了本申请的pedv免疫检测层析试纸条在制备pedv检测试剂盒或装置中的应用。
本申请的再一面公开了本申请的pedv免疫检测层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
量子点标记s1重组蛋白探针和量子点标记兔igg探针制备，包括将s1重组蛋白和兔igg分别加入活化的量子点中，利用s1重组蛋白上的氨基、兔igg上的氨基分别与量子点羧基共价结合形成稳定的肽键，分别形成量子点标记s1重组蛋白探针和量子点标记兔igg探针；
样品垫制备，将玻璃纤维垫用含d-(+)海藻糖、1％bsa和0.1％tween20的磷酸盐缓冲液浸泡，然后烘箱干燥，将制备的量子点标记s1重组蛋白探针和量子点标记兔igg探针喷涂于干燥的玻璃纤维垫上，即获得样品垫；
包被膜制备，将羊抗兔igg抗体喷涂在层析条的质控线位置，将pedv灭活全病毒喷涂在检测线位置，将喷涂好的层析条烘干，即获得包被膜；
免疫层析试纸条组装，将样品垫、层析条按顺序搭接在支撑材料上，即获得pedv荧光量子点免疫层析试纸条。
优选的，免疫层析试纸条组装中，还包括对组装的试纸条进行裁剪。
由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：
本申请的乳汁中pedv免疫检测层析试纸条，充分结合荧光量子点高灵敏的特性，以及抗原抗体特异性结合的特点，可检测被病毒感染或免疫过的动物或人的体液中的抗体是否存在iga抗体，特别是较少igg抗体的体液，比如在pedv感染或免疫过的母猪的乳汁中iga抗体的检测。本申请的免疫检测层析试纸条，对iga抗体具有较高的检测灵敏度，并且特异性好，检测周期短，能够满足现场检测的需求，适合用于猪流行性腹泻病毒的分子生物学检测和大规模的流行病学调查。
附图说明
图1为本申请实施例中pet32a-s1重组表达载体双酶切鉴定电泳图；
图2为融合蛋白表达鉴定sds-page分析；
图3为融合蛋白的ni柱亲和纯化sds-page分析；
图4为融合蛋白westernblot鉴定分析；
图5为pedv荧光量子点免疫层析iga抗体检测试纸条最佳反应时间确定图；
图6为pedv荧光量子点免疫层析iga抗体检测试纸条检测混合脱脂奶灵敏度试验结果图；
图7和图8为pedv荧光量子点免疫层析iga抗体检测试纸条特异性试验结果图。
具体实施方式
当猪感染或免疫pedv后，通过体内的免疫反应，猪的血清中主要是igg抗体，可用pedvn蛋白和/或s2蛋白的elisa试剂盒进行检测，反应了猪群中pedv的感染和免疫情况，可用于血清学调查。在pedv感染或免疫过母猪后，在母猪的初乳中，主要是的iga抗体，较少igg抗体。在这种情况下，不能通过用pedvn蛋白和/或s2蛋白的elisa试剂盒进行检测母猪乳汁以反应了猪群中pedv的感染和免疫情况，进一步反映生产母猪初乳中pedv的iga抗体是否存在，对小猪肠道是否有提供母源抗体保护。本发明人在长期的科学研究中发现，羧基功能化量子点与病毒的s1蛋白或s2蛋白通过酰胺键共价结合，充分结合荧光量子点高灵敏的特性，以及抗原抗体特异性结合的特点，可检测被病毒感染或免疫过的动物或人的体液中的抗体是否存在，特别是检测不适用于血清学检测的主要成分是iga抗体，较少igg抗体的体液，比如在pedv感染或免疫过的母猪的乳汁中抗体的检测。采用该技术制备的iga抗体检测试纸可有效检测pedv感染或免疫后母猪乳汁中iga抗体存在的情况，具有灵敏度高，本申请的iga抗体检测试纸条灵敏度可以达到10-9，特异性好，且检测周期短的优势，满足现场检测的需求，适合用于猪流行性腹泻病毒的分子生物学检测和大规模的流行病学调查。
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
实施例
一、材料和设备
(1)细胞、病毒及质粒
vero-76传代细胞系、猴肾传代细胞系(ma-104)、猪源肾脏细胞(pk-15)、sp2/0-ag14(简称sp2)骨髓瘤细胞，均由华南农业大学兽医学院微生物学与免疫学教研室保存。
2015-pedv-6、2016-pedv+prova-1、2016-pedv+prova-2、2016-prova-1、2017-pedv+prova+tgev-3、tgev-gd均由华南农业大学兽医学院微生物学与免疫学教研室保存。
“科泻宁”，猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗，即wh-1株+aj1102株，为武汉科前生物股份有限公司产品；猪病毒性腹泻三联活疫苗，猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒(g5型)三联活疫苗，即弱毒华毒株+弱毒cv777株+nx株，为哈尔滨维科生物技术开发有限公司产品。
(2)主要试剂
dna高保真聚合酶
(3)抗体
山羊抗兔igg，兔igg、histag抗体均为sigma公司产品。
(4)主要溶液的配制
细胞完全培养基：dmem或rpmi-1640(1×原液)加入无菌双抗和灭活胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)，使fbs的终浓度为10％，置4℃冰箱保存、备用。无菌双抗为青霉素100u/m和链霉素0.1mg/ml。
细胞维持培养基：dmem或rpmi-1640(1×原液)加入无菌双抗和灭活胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)，使fbs的终浓度为2％，置4℃冰箱保存、备用。无菌双抗为青霉素100u/m和链霉素0.1mg/ml。
0.01mol/l磷酸盐缓冲液(phosphate-bufferedsaline，pbs)：取nacl8g、kh2po40.2g、kcl0.2g、na2hpo4·12h2o2.08g，完全溶解在1000ml去离子水中，高压灭菌30min，4℃冰箱保存、备用。
丙烯酰胺母液：丙烯酰胺43.8g、甲叉丙烯酰胺1.2g、三蒸水150ml，将上述样品混合于200ml的烧杯中，用玻璃棒搅拌溶解并过滤。
10％十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate，sds)：sds10g、三蒸水90ml搅拌均匀后稀释到100ml。
1.5mol/ltris-hcl(ph8.8)：三羟甲基氨基甲烷(trishydroxymethylaminomethane，tris)18.15g、三蒸水50ml用浓盐酸将上述溶液的ph调到8.8，再用三蒸水稀释到100ml，即为分离胶缓冲液。
0.5mol/ltris-hcl(ph6.8)：tris6g、三蒸水60ml，用浓盐酸将上述溶液的ph调到6.8，再用三蒸水稀释到100ml，即为浓缩胶缓冲液。
样品缓冲液：三蒸水3.55ml、0.5mol/ltris-hcl(ph6.8)1.25ml、甘油2.5ml、10％sds2.0ml、0.5％溴酚蓝0.2ml。
10×电泳缓冲液：tris15.15g、甘氨酸72g、sds5g、三蒸水400ml，搅拌溶解后，用三蒸水稀释到500ml。
10％过硫酸铵(ammoniumpersulfate，aps)：ap100mg、溶解于1ml三蒸水中。
pbst：取nacl8g、kh2po40.2g、kcl0.2g、na2hpo4·12h2o2.08g完全溶解在1000ml去离子水中，再加入500μltween-20，搅拌使其溶解，即为pbst。
10×电转移缓冲液：将tris3g和甘氨酸14.4g溶解于800ml三蒸水中，再加入100ml甲醇，最后用三蒸水定容至1000ml。
封闭液：脱脂奶粉0.5g，溶解于25mlpbst缓冲液中即可。
抗体稀释液：将脱脂奶粉0.4g、牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，bsa)0.2g溶解于20ml的pbst缓冲液中，即为抗体稀释液。
ecl显色剂溶液：避光条件下将显色剂a与显色剂b以1:1混合，待作用5min后使用。
0.1％焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate，depc)：1000ml去离子水加入1ml的depc，取100ml高压，作为rnase-free水配制rna提取的相关试剂，其余用于浸泡rna提取的相关器皿。
(5)主要仪器设备
co2细胞培养箱为德国wtbbinder公司产品、普通倒置显微镜为日本olympus公司产品、电子透射显微镜为荷兰philips公司产品、台式低温离心机为德国eppendorf公司产品、超低温冰箱为美国formascientific公司产品、电子天平为瑞典mettlertoledo公司产品、ph计为美国thermo公司产品、超净工作台为苏州净化设备有限公司产品、ql-901漩涡混合器为江苏海门麒麟医用仪器厂产品、台式水平离心机为上海安亭科学仪器厂产品、lx-100手掌型离心机为江苏海门麒麟医用仪器厂产品、thz-c恒温振荡器为金坛市富华仪器有限公司产品、微量移液器为德国eppendorf公司产品、酶标仪为美国bio-rad公司产品、xyz3050喷膜系统为美国bio-rad公司产品、cm4000裁切系统为美国bio-rad公司产品、365nm荧光量子点检测仪为清华大学深圳研究生院产品。
二、试验方法
1.病毒增殖和母猪免疫
(1)pedv的增殖与粗制纯化
待vero-76传代细胞系单层生长到80％～90％时，用无血清、无抗生素的dmem细胞培养液洗2次，vero-76传代细胞接种2015-pedv-6。接种病毒后的细胞37℃吸附1h，其间轻摇2次。吸附结束后，用无血清、无抗生素的dmem培养液洗2次。在vero-76细胞培养瓶中，加入含有终浓度10μg/ml胰酶、37.5μg/ml猪胰酶和含2％胎牛血清的dmem维持液，于37℃、5％co2培养箱中培养，72h作为一个传代周期。在接种两种毒株后每次传代前，将上一次的细胞培养物反复冻融3次，按上述方法进行盲传，显微镜观察细胞病变，同时进行商品化试剂盒pedv实时荧光rt-pcr检测。在接种病毒的vero-76传代细胞传至第3代后的连续传代中，只加入含有终浓度10μg/ml胰酶和含2％胎牛血清的dmem维持液，37℃培养72h作为一个传代周期。所有的细胞培养上清液均取5ml于-80℃冰箱保存、备用。
取收获细胞病毒培养液5000ml。将5000mlpedv病毒培养液8000r/min离心30min，去除细胞碎片。再将上清28000r/min超速离心3h，收集管底产物用1000ml0.01mpbs溶解作为抗原。
(2)母猪免疫
选择怀孕母猪20头进行编号，进行免疫。后海穴位肌肉注射，4ml/头。后备母猪免疫一次，免疫前30天抽血，免疫后30天抽血。怀孕母猪免疫二次，分别为产前30天免疫一次，产前15天增加免疫一次。产后一周内抽血。分离血清，将血清编号注明日期，保存于-20℃待检。20头母猪如表1所示。
表120头母猪的编号
2.pedvs1基因的原核表达与纯化
(1)pedvs1基因分析和人工合成
根据genebank中公开发表的pedvs1糖蛋白基因全序列，登录号kp870126.1，共4161bp进行分析。通过分子生物学软件对pedvs1全基因序列和全氨基酸序列进行分析，去除信号肽序列、跨膜结构序列和强疏水区域序列，将pedv的密码子修改为大肠杆菌偏嗜的密码子，送宝生物工程(大连)有限公司合成适合在因工程菌中表达的基因序列，即人工合成s1基因。
(2)pedvs1基因克隆至puc18-t保存
将人工合成的s1基因，克隆连接插入到puc18-t克隆载体上，命名为puc18-t-s1质粒，再转化dh5a宿主细菌。
(3)s1基因pcr扩增
根据genbank公布的pedvs1基因全核苷酸序列，应用primerprimier5.0设计pcr引物，如表2所示。
表2s1基因扩增引物
抽提转化puc18-t-s1质粒dh5a工程菌，以puc18-t-s1克隆质粒为模板，以上述pcr反应的上下游引物进行pcr反应，按照pfudna聚合酶说明书扩增s1基因序列，具体反应体系如下：10×pfudnabuffer5.0μl、2.5mm的dntp4.0μl、10μmol/l的senseprimer1.0μl、10μmol/l的anti-senseprimer1.0μl、pfudna聚合酶1.0μl、10ng/μl的puc18-t-s1质粒4.0μl，补充ddh2o至50μl。
pcr反应程序为：94℃5min，然后进入30个循环：94℃30s、65℃30s、72℃30s，循环结束后72℃5min。
以灭菌超纯水为空白对照。反应结束后，取5μl的pcr扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳进行检测。
根据gelextractionkit的使用说明进行胶回收。
(4)pedvs1基因克隆至表达载体pet-32a
将胶回收pcr产物和pet32a质粒分别相对应的核酸限制性内切酶进行双酶切，具体反应体系如下：10×kbuffer5.0μl、限制性内切酶bamhⅰ4.0μl、限制性内切酶xhoⅰ4.0μl、dna2μg，补充ddh2o至40μl。
将酶切产物根据gelextractionkit的使用说明进行胶回收后，用于连接反应，具体反应体系如下：10×t4buffer2.5μl、t4ligation1.0μl、pcr产物0.3pmol、质粒dna0.1pmol，补充ddh2o至25μl。
(5)pet32a-s1载体转化至大肠杆菌arctic-express
将重组表达质粒pet32a-s11μl加入100μl感受态细菌arctic-express中，置冰上20min。42℃热激90sec，迅速置冰中5min；加入600μllb培养液。37℃，220rpm振摇1hr，离心后全部涂布于含50μg/mlamp的lb平板，37℃倒置培养过夜。根据omega公司的无内毒素质粒抽提试剂盒(endo-freeplasmidminikiti)说明书抽提质粒pet32a-s1。取2μl对质粒进行稀释并测定od值，确定dna的浓度和纯度，并取少量进行测序鉴定，剩余的质粒于-20℃保存备用。
(6)表达载体pet-32a酶切鉴定
取少量抽提的重组表达质粒pet32a-s1，使用核酸限制性内切酶bamhⅰ和xhoⅰ进行双酶切鉴定，确定pedvs1基因插入表达载体中。
(7)iptg诱导pet32a-s1载体融合蛋白的表达
a.挑取转化平板上的单克隆接种于含50μg/mlamp的3mllb培养液的试管中，37℃220rpm振摇过夜；
b.次日按1：100接种于50μg/mlamp的30mllb培养液中，37℃220rpm振摇至菌体od600为0.6-0.8；
c.取出1ml培养物，10000g室温离心2min，弃上清，用100μl1×上样缓冲液重悬菌体沉淀；
d.向剩余的培养物中加入iptg至终浓度为0.5mm，37℃220rpm振摇4hr，诱导融合蛋白表达；
e.取出1ml培养物，10000g室温离心2min，弃上清，用100μl1×上样缓冲液重悬菌体沉淀。剩余培养物4000g，离心10min，弃上清，用pbs重悬菌体沉淀；重悬液进行超声波破碎后，分别取上清液与沉淀液加入上样缓冲液重悬；
f.进行12％sds-page检测分析，考马斯亮蓝染色显带。
(8)包涵体蛋白的变复性
a.将菌体沉淀重悬于20ml裂解液，超声破碎；裂解液为20mmtris-hclcontaining1mmpmsfandbacteriaproteaseinhibitorcocktail,ph8.0；超声破碎功率400w、工作4sec、间歇8sec、共20min；
b.将超声破碎的细胞裂解液4℃10000g离心20min，收集沉淀；
c.使用包涵体洗涤液洗涤包涵体3次；洗涤液为20mmtris、1mmedta、2m素、1mnacl和1％tritonx-100，ph8.0；
d.用溶解缓冲液，按一定比例溶解包涵体，4℃放置过夜；室温，15000rpm离心15min；缓冲液为20mmtris、5mmdtt、8m尿素ph8.0；
e.将上述溶液滴加20mmtris-hcl，100mmnacl，ph8.0缓冲液中，逐步成倍梯度稀释缓慢搅拌，将蛋白溶液装入透析袋于20mmtris-hcl，100mmnacl，ph8.0溶液中透析过夜。
(9)融合蛋白的ni柱亲和纯化
a.利用低压层析系统，包涵体溶液以0.5ml/min流速上样至ni-idabinding-buffer预平衡的ni-ida-sepharosecl-6b亲和层析柱；
b.用ni-idabinding-buffer以0.5ml/min流速冲洗，至流出液od280值到达基线；
c.用ni-idawashing-buffer以1ml/min流速冲洗，至流出液od280值到达基线；ni-idawashing-buffer为20mmtris-hcl、20mm咪唑、0.15mnacl、ph8.0；
d.用ni-idaelution-buffer以1ml/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液；ni-idaelution-buffer为20mmtris-hcl、250mm咪唑、0.15mnacl、ph8.0；
e.上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用20mmtris-hcl，0.10mnacl，ph8.0进行透析过夜；
f.进行12％sds-page分析。
(10)westernblot方法
a.取样品上样5μl。
b.上样完毕后，聚丙烯酰胺凝胶先90v跑完积层胶，再将电压升至200v直到电泳结束。
c.电泳结束后，取下凝胶进行转膜，恒压100v转膜，约为1.5h，恒流250ma。
d.电转结束后，取下膜后先用pbst洗涤4次，每次5min。
e.将膜置于5％脱脂奶粉封闭液中封闭37℃1h。
f.用封闭液1:1000稀释一抗his标签抗体，膜在一抗稀释液中4℃过夜。
g.次日将膜取出后用pbst洗膜4次，每次5min，
h.用含5％牛奶的封闭液稀释1:5000羊抗兔二抗。膜在二抗中37℃反应1h。
i.反应完毕后，把膜取出后置于干净的盒子中洗膜4次，每次5min。
j.ecl显影，曝光。
3.pedv荧光量子点免疫层析iga抗体检测试纸条的研制
(1)pedv量子点标记纯化原核表达重组蛋白s1和兔igg
利用夹心法的原理，为了使pedv荧光量子点iga抗体检测试纸条具有控制线，引入了兔igg和羊抗兔igg作为内对照系统。根据免疫层析夹心法荧光量子点标记物必须过量的要求，用标记物溶液将s1重组蛋白稀释至1.3mg/ml，兔igg稀释至8mg/ml。采用edc法共价连接羧基功能化量子点与s1重组蛋白和兔igg。首先配制0.1mmes溶液，调ph4.7待用；配制0.05m硼酸溶液，调ph8.5待用；配制0.02mpbs溶液，调ph7.4待用。羧基功能化量子点与s1重组蛋白和兔igg通过酰胺键共价结合，具体方法如下：取水溶性羧基量子点用0.1mmes溶液洗涤离心重悬后加入5mmedc和2mmnhs反应30分钟，然后离心洗涤三次，沉淀用0.05m硼酸溶液重悬，得到活化好的羧基功能化水溶性量子点。分别加入1.3mg/mls1重组蛋白溶液和8mg/ml兔igg溶液至活化量子点中,37℃反应3小时，s1重组蛋白上的氨基、兔igg上的氨基分别与量子点羧基共价结合形成稳定的肽键。量子点上剩余的活化位点通过加入5％bsa封闭，37℃反应30分钟。反应完后20,000g离心3次后用0.02mpbs溶液重悬，得到量子点标记s1重组蛋白和兔igg探针，4℃保存。
(2)基于量子点的乳汁中pedv免疫层析iga抗体检测试纸条的制备
将2015-pedv-6毒株繁殖进行粗制纯化，稀释至24mg/ml。将羊抗兔igg用pbs缓冲液配制为8mg/ml浓度。然后用xyz3050喷膜系统将羊抗兔igg喷涂在硝酸纤维素膜质控线位置，将粗提纯化的pedv灭活全病毒喷涂在检测线位置，喷涂好的硝酸纤维素膜放于37℃烘箱干燥4小时，得到包被膜。将玻璃纤维垫用用含d-(+)海藻糖，1％bsa和0.1％tween20的磷酸盐缓冲液浸泡后放于37℃烘箱干燥3小时，得到样品垫。将量子点标记s1重组蛋白和兔igg探针用xyz3050喷膜系统按10μl/cm量喷涂在样品垫上端后放于37℃烘箱干燥3小时。然后搭配组装试纸条，将试纸条组装后用cm4000裁切系统切成3.5mm宽，得到检测乳汁中pedv荧光量子点免疫层析iga抗体检测试纸条(pedv-qd-iga-fla)。
(3)检测步骤
取母猪的乳汁约为2ml，6000r/min离心5min，离心上层为脂肪层，吸取下层脱脂奶直接用于检测。将60μl(约2滴)下层脱脂牛奶滴加到上步得到的pedv荧光量子点免疫层析iga抗体检测试纸条(pedv-qd-iga-fla)的加样端。当乳汁中存在pedviga抗体时，iga抗体与量子点标记s1重组蛋白结合后，层析到检测线时会被包被的pedv灭活全抗原捕获，从而在检测线位置聚集，形成紫外可激发的t带。同时样品垫上量子点标记兔igg抗体会穿过pedv灭活全抗原(即t带)层析到质控线位置时会被包被的羊抗兔igg捕获，从而在质控线位置聚集，形成质控内对照c带。质控线和检测线捕获的量子点在365nm紫外光照射下会发出明亮的红色荧光条带，通过检测仪分析这些荧光信号，就能确定母猪乳汁中是否含有pedv保护性的母源抗体iga。检测仪检测到的荧光信号强度与捕获到的量子点量相关。所能检测到的检测线最低荧光信号所对应流感病毒量即为该荧光免疫层析系统的灵敏度。
(4)pedv荧光量子点免疫层析iga抗体检测试纸条最佳检测时间的确定
采集表1的怀孕母猪y29406和y4710的初乳各50ml混合，6000r/min离心5min，吸取下层脱脂奶保存于-80℃待用。取60μl(约2滴)的混合脱脂奶滴加到pedv量子点iga抗体免疫层析试纸的加样端，并用检测仪检测，时间从3到50分钟，每分钟检测1次，做2个平行测试并计算平均值。根据检测值绘制时间动力曲线，获得检测值比较稳定时的检测时间。
(5)pedv荧光量子点免疫层析iga抗体检测试纸条的灵敏度测试
检测50份阴性样品，计算均值及标准偏差，以便确定pedv荧光量子点免疫层析iga抗体检测试纸条(pedv-qd-iga-fla)检测的cut-off值。将“(4)pedv荧光量子点免疫层析iga抗体检测试纸条最佳检测时间的确定”制备的混合脱脂奶用0.02mpbs缓冲液10倍比稀释，从10-1连续稀释至10-15，0.02mpbs缓冲液作为阴性对照样品，用pedv荧光量子点免疫层析iga抗体检测试纸条检测，每个样品平行测试3次，确定pedv荧光量子点免疫层析iga抗体检测试纸条的灵敏度。
(6)pedv荧光量子点免疫层析iga抗体检测试纸条的特异性测试
用所建立pedv荧光量子点免疫层析iga抗体检测试纸条，对表1中免疫的20头怀孕母猪均采集初乳50ml，采集20头pedv阴性猪场猪初乳且采集后30天经猪流行性腹泻病毒n重组蛋抗体检测试剂盒检测血清全部为阴性的乳汁50ml，6000r/min离心5min，吸取下层脱脂奶作为样本进行检测。每个样品平行测试3次，进一步确定所建立方法的特异性。
(7)pedv荧光量子点免疫层析iga抗体检测试纸条的重复性测试
为检测量子点免疫层析试纸的重复性，取“(4)pedv荧光量子点免疫层析iga抗体检测试纸条最佳检测时间的确定”制备的混合脱脂奶进行10-5、10-6和10-7稀释，取三个稀释度作为待检样本，用pedv荧光量子点免疫层析iga抗体检测试纸条检测，平行测试20次，计算均值以及相对标准偏差rsd。
(8)pedv荧光量子点免疫层析iga抗体检测试纸条的老化实验
将制备的pedv荧光量子点免疫层析iga抗体检测试纸条，放置于37℃恒温干燥箱中，分别于0、7、14、21、28天取出，检测“(4)pedv荧光量子点免疫层析iga抗体检测试纸条最佳检测时间的确定”制备的混合脱脂奶样本。根据检测结果绘制时间动力曲线，以评估pedv荧光量子点免疫层析iga抗体检测试纸条的保质期。
(9)样品检测
对自2017年秋冬季开始，从3个大型猪场采集怀孕母猪初乳样本共120份临床样品，进行pedv荧光量子点免疫层析iga抗体检测试纸条检测，对所建立的方法进行田间小样试验。其中，120份临床样品由深圳出入境动植物检验检疫技术中心采集保存。
三、试验结果
1.pedvs1基因的原核表达与纯化
(1)pedvs1基因的分析与人工合成
通过对pedvs1蛋白分析，该蛋白的1-20aa为信号肽序列，1328-1350aa为典型的跨膜结构，7-23aa以及1330-1365aa为强疏水区域。为了促进原液核表达，在pedvs1全氨基酸序列基础上，截去了1-20aa以及1328-1386aa。为了加强原核表达，在对截短pedvs1基因序列进行了稀有密码子分析，在人工合成的pedvs1基因序列的时候，将pedvs1基因序列中的12个稀有密码子进行了代替，形成了适合在大肠杆菌中表达的密码子序列。并在人工合成的基因序列5’端加入限制性内切酶序列bamhⅰ序列ggatcc，在3’端加入了限制性内切酶序列xhoⅰ序列ctcgag。对该序列进行稀有密码子分析，发现均适合中大肠杆菌中表达。本例的人工s1基因序列为seqidno.3所示序列。
seqidno.3：
ggatccgagaatcagggagtgaattcaacgtggtattgcgcgggacagcatccaacggccagcggagtacacgggatttttgtgagccatatccgtggcgggcacggttttgagatcggcatctcacaagagccttttgacccaagtgggtaccaactttatttgcacaaggctactaacggcagcactaacgctacggctagacttcgaatttgccaatttccgagcatcaagtcacttggaccgacagcaaataacgatgtcacgacagggcgtaattgtctttttaacaaggccatcccggcccatatgtctgaacacagcgtagtcgggatcacatgggacaacgacagagtaactgtattttcagacaaaatctactatttttactttaaaaatgattggagtcgagttgcgacaaagtgctataattctggcggttgtgcaatgcaatacgtatatgaacctatatattacatgttgaacgtgacgagtgcaggggaggacggaattagttatcaattgtgcacagctaattgtataggttactctgccaatgttttcgcgacagaaccaaacggacacatcccggaaggtttttctttcaataattggtttttattaagcaacgattctactttggtacatggaaaagttgtatctaaccagccgttacttgttaattgtttgcttgccataccaaagatctacgggttgggtcaattcttttctttcaaccaaacaatcgatggcgtgtgtaatggggcggctgtgcaacgagctccagaggctcttcgattcaatatcaacgataccagcgtcattttggcagaaggctctatcgttttacacacggcattaggtactaacttctcatttgtgtgttcaaattcaagtaacccgcacttggctacatttgtcataccattaggggccacccaggttccatactactgttttttgaaagtggacacgtataattcaaccgtttataaattcttagccgtcttgccaccgaccgtacgagaaattgtaattaccaagtacggagatgtttacgttaatgggtttgggtatttacgacttggcttacttgatgcggtgactattaatttcacagggcacggcacggatgatgacgtgagtgggttctggacaatagccagtacgaacttcgtggacgcccttattgaagtacaaggaacggcaattcagcgtattttatattgcgacgacccagtaagtcaattaaaatgtagtcaggtagcgtttgacttggatgacggattttaccctatctctagccgaaatttgttatctcatgagcaaccatctagtttcgttacattgcctagctttaacgatcacagctttgtgaatataaccgtcagcgcgagcttcggcgggcactcaggcgcgaacttgattgttagcgacacaacgatcaatgggttcggctctttttgtgttgacactcgacaattcactatatctttattttacaacgtgacaaatagctacggttatgttagtaattcacaggatagtaattgtccatttacccttcagagtgtcaacgactacctttcattcagtaagttctgtgtttcaacttctcttcttgctagtgcgtgcacgattgatctttttggttatccagaattcgggagcggagttaagttcgctagtttatactttcaattcacaaaaggtgagttaataactgggactccgaagccattggagggcgtgaccgatgtatctttcatgacattagatgtgtgcacgaaatatactatatatgggtttaagggcgagggaataatcacattgacaaattcatcattttttgctggggtttactatacgcctgattcaggccaacttttggctttcaaaaatgtgacgagtggagccgtttatagcgtaaccccatgctcattcagtgagcaggcagtgtatgttgatgacgatatcgtcggcgtcatctcttcattgagtaacagtactttcaattctaccagagagttgcctgggtttttttaccactcaaactaactcgag
(2)pet32a-s1重组表达载体氨基酸序列推导与测序
重组表达载体中的s1基因长度为2052bp，加上两端添加的酶切位点序列即seqidno.3所示序列，利用软件推导出其对应的氨基酸序列为684个氨基酸，加上pet-32a的trx-tag蛋白标签序列，蛋白大小理论分子量为92.293kd，蛋白序列为seqidno.4所示序列。
seqidno.4：
msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkygirgiptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmdspdlgtddddkamadigsenqgvnstwycagqhptasgvhgifvshirgghgfeigisqepfdpsgyqlylhkatngstnatarlricqfpsikslgptanndvttgrnclfnkaipahmsehsvvgitwdndrvtvfsdkiyyfyfkndwsrvatkcynsggcamqyvyepiyymlnvtsagedgisyqlctancigysanvfatepnghipegfsfnnwfllsndstlvhgkvvsnqpllvncllaipkiyglgqffsfnqtidgvcngaavqrapealrfnindtsvilaegsivlhtalgtnfsfvcsnssnphlatfviplgatqvpyycflkvdtynstvykflavlpptvreivitkygdvyvngfgylrlglldavtinftghgtdddvsgfwtiastnfvdalievqgtaiqrilycddpvsqlkcsqvafdlddgfypissrnllsheqpssfvtlpsfndhsfvnitvsasfgghsganlivsdttingfgsfcvdtrqftislfynvtnsygyvsnsqdsncpftlqsvndylsfskfcvstsllasactidlfgypefgsgvkfaslyfqftkgelitgtpkplegvtdvsfmtldvctkytiygfkgegiitltnssffagvyytpdsgqllafknvtsgavysvtpcsfseqavyvdddivgvisslsnstfnstrelpgffyhsn
(3)pet32a-s1重组表达载体s1基因测序鉴定
将构建好的pet32a-s1重组表达载体转化大肠杆菌arctic-express后，采用质粒抽提试剂盒抽提重组表达质粒pet32a-s1。采用senseprimer和anti-senseprimer对重组表达质粒pet32a-s1中的s1基因进行测序，并与genebank中公开发表的pedvs1糖蛋白基因全序列，登录号kp870126.1，进行序列比对。除经修饰后的12个稀有密码子外，其他碱基完全相同。
(4)pet32a-s1重组表达载体双酶切鉴定
将构建好的pet32a-s1重组表达载体转化大肠杆菌arctic-express后，采用质粒抽提试剂盒抽提重组表达质粒pet32a-s1。采用核酸限制性内切酶bamhⅰ和xhoⅰ进行双酶切鉴定。双酶切后的电泳图如图1所示，图1中泳道1为pet32a-s1双酶切前的电泳图，泳道2为pet32a-s1双酶切后的电泳图，泳道3即m为marker：1000,2000,3000,4000,5000,6000,7000,8000,10000；图1的结果说明pet32a-s1重组表达载体构建成功。
(5)iptg诱导pet32a-s1重组表达载体融合蛋白的表达
将pet32a-s1重组表达载体的大肠杆菌arctic-express，用iptg诱导表达4h后，经12％sds-page分析，结果见图2。图2中，m为蛋白质分子质量标准，1为未诱导，2为诱导后，3为诱导破碎后上清，4为诱导破碎后沉淀。图2的结果显示，与诱导前相比，在预期的位置处出现明显的表达蛋白条带，分子量大小与预期一致。诱导arctic-express细菌破碎后上清基本没有目的蛋白，目标蛋白主要存在于沉淀中。
(6)融合蛋白的ni柱亲和纯化及结果分析
为了得到有活性的蛋白，将pet32a-s1重组表达的包涵体蛋白进行变复性，重新溶解目标蛋白，通过ni柱亲和纯化获得目标蛋白，进行12％sds-page分析。电泳结果图见图3。图3中，m为蛋白质分子质量标准，1为破碎后处理样品，2为流出，3为洗脱。将纯化蛋白原液用超纯水稀释10倍，于核酸\蛋白测定仪上测定a260值为0.043，a280值为0.037。按照warburg公式计算重组蛋白溶液的浓度为：
[protein](mg/ml)＝1.55×a280-0.76×a260＝1.55×0.062-0.76×0.043＝0.025mg/ml。乘以稀释因子10，最终表达后纯化产物为0.025mg/ml×10＝0.25mg/ml。
(7)westernblot结果分析
鉴于pedviga抗体作为一抗难以找到标准抗体，以pet32a-s1重组表达蛋白n基端的trx-tag蛋白标签序列作为检测对象。将trx-tag蛋白标签序列抗体作为一抗进行检测。将pet32a-s1重组表达的包涵体蛋白进行变复性，并经过ni柱亲和纯化后，进行westernblot结果检测，在相对分子质量约.92kd处出现明显的抗原抗体反应条带，如图4所示，图4中，m为蛋白质分子质量标准，1为纯化后样品。
2.pedv荧光量子点免疫层析iga抗体检测试纸条的研制
(1)pedv荧光量子点免疫层析iga抗体检测试纸条最佳检测时间的确定
将量子点标记纯化原核表达重组蛋白s1和兔igg，与t线pedv灭活全病毒包被硝酸纤维素膜和c线羊抗兔igg制成的pedv荧光量子点免疫层析iga抗体检测试纸条(pedv-qd-iga-fla)，通过检测怀孕母猪y29406和y4710的混合初乳脱脂奶原液10倍稀释液，时间从3到50min，每分钟检测1次，结果如图5所示，荧光强度随时间的增加而增强，并且在10min时增强幅度减小并趋于稳定。因此，pedv荧光量子点免疫层析iga抗体检测试纸条(pedv-qd-iga-fla)最佳检测时间确定为10min。
(2)pedv荧光量子点免疫层析iga抗体检测试纸条的灵敏度测试
检测50份阴性样品，通过计算平均值以及标准偏差，我们将pedv荧光量子点免疫层析iga抗体检测试纸条的荧光信号cut-off值定为123a.u.。当检测线荧光强度值≥123a.u.时，结果判定为阳性结果，小于102a.u.时结果判定为阴性结果。
将“(4)pedv荧光量子点免疫层析iga抗体检测试纸条最佳检测时间的确定”制备的混合脱脂奶用0.02mpbs缓冲液10倍比稀释，从10-1连续稀释至10-15，0.02mpbs缓冲液作为阴性对照样品。将样品滴加到pedv荧光量子点免疫层析iga抗体检测试纸条(pedv-qd-iga-fla)加样端，放置15min后用荧光检测仪检测，每个样品测试3次。检测混合脱脂奶最低浓度为10-9时，检测值高于cut-off值123a.u.，如图6所示。在阴性对照成立的情况下，于365紫外激发光下，可在10-1～10-15混合脱脂奶10倍系列稀释样品中均有可见两条荧光条带，即c条带和t条带，且荧光强度逐步减弱。在10-10时则只能观察到c对照条带，t条带已经无法检测到。因而pedv荧光量子点免疫层析iga抗体检测试纸条(pedv-qd-iga-fla)检测混合脱脂奶的检测限为10-9。
(3)pedv荧光量子点免疫层析iga抗体检测试纸条的特异性测试
将免疫pedv后的怀孕母猪初乳脱脂奶和pedv阴性猪场猪初乳脱脂奶各20份进行pedv荧光量子点免疫层析iga抗体检测试纸条(pedv-qd-iga-fla)检测，反应10min后用荧光检测仪检测。pedv荧光量子点免疫层析iga抗体检测试纸条(pedv-qd-iga-fla)均能检测出20份免疫pedv后的怀孕母猪初乳脱脂奶样本为阳性，如图7所示；检测20份pedv阴性猪场猪初乳脱脂奶均为阴性，如图8所示；检测结果与预期结果一致。
(4)pedv荧光量子点免疫层析iga抗体检测试纸条的重复性测试结果
将“(4)pedv荧光量子点免疫层析iga抗体检测试纸条最佳检测时间的确定”制备的混合脱脂奶进行10-5、10-6和10-7稀释，每个稀释度分别用pedv荧光量子点免疫层析iga抗体检测试纸条进行检测，每个样品平行测试20次，计算均值以及相对标准偏差rsd。10-5、10-6和10-7三个稀释度的相对标准偏差rsd分别为3.82％、7.61％和5.95％，均小于10％，说明pedv荧光量子点免疫层析iga抗体检测试纸条具有良好的重复性。
(5)pedv荧光量子点免疫层析iga抗体检测试纸条老化试验结果
将制备的pedv荧光量子点免疫层析iga抗体检测试纸条，放置于37℃恒温干燥箱中，分别于0、7、14、21、28天取出，用荧光检测仪检测“(4)pedv荧光量子点免疫层析iga抗体检测试纸条最佳检测时间的确定”制备的混合脱脂奶样本。pedv荧光量子点免疫层析iga抗体检测试纸条在37℃放置到28天时，检测值变化不大。因而pedv量子点荧光免疫层析试纸在常温保质期可达到一年以上。
(6)pedv荧光量子点免疫层析iga抗体检测试纸条样品检测
采用所建立的pedv荧光量子点免疫层析iga抗体检测试纸条，对3个大型猪场采集怀孕母猪初乳样本共120份临床样品进行检测，检测有pedv保护性母源抗体iga的样品63份，占52.5％。说明怀孕母免疫或者感染pedv后，真正向仔猪提供母源抗体iga保护的大约占50％。
上述试验结果显示，本实施例试纸条的最佳反应时间为10min；检测限为10-9；特异性、重复性好；保质期可达到一年。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。
sequencelisting
<110>深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心
华南农业大学
清华大学深圳研究生院
<120>乳汁中pedv免疫检测层析试纸条及其制备方法和应用
<130>18i26094
<160>4
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>31
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<213>人工序列
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<213>人工序列
<400>2
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<212>dna
<213>人工合成s1基因
<400>3
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