一种细菌荚膜多糖末端唾液酸含量的测定试剂及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种细菌荚膜多糖末端唾液酸含量的测定试剂及其制备方法和应用。
背景技术：
大部分细菌入侵机体可引发宿主广泛的免疫反应，免疫细胞通过抗体或补体调理作用对其进行吞噬与清除。但在长期对宿主的适应、互作与进化过程中，细菌获得多个可对抗宿主调理吞噬杀灭作用的毒力决定因子，唾液酸化荚膜多糖(capsularpolysaccharides,cps)就是其中之一，如ii型猪链球菌(streptococcussuisserotype2)、大肠杆菌k1(escherichiacolik1)、脑膜炎奈瑟氏菌(neisseriameningitidis)和人源iii型无乳链球菌(streptococcusagalactiae)等细菌都有这种毒力因子。细菌荚膜多糖一般都由葡萄糖、半乳糖、n-乙酰葡糖胺和唾液酸(sialicacid,sia)4种单糖以不同排列方式构成不同重复单元。它们都有一个共同点-聚糖末端都带有一个以α2-3、α2-6或α2-8等连接方式结合在半乳糖上的唾液酸，荚膜多糖末端所带的唾液酸化聚糖(如neu5acα2-3galβ1-4glcnac)，与哺乳类免疫细胞表面糖蛋白末端的唾液酸多糖相似。动物体内与免疫应答相关的几乎所有关键分子(如抗体)及一些重要激素都是糖蛋白。这些糖蛋白在体内唾液酸转移酶修饰作用下具有不同的唾液酸化聚糖末端，用于与特定受体结合调节免疫反应。细菌利用其唾液酸化荚膜多糖模仿动物体内糖蛋白唾液酸化聚糖末端，与宿主细胞受体唾液酸结合型免疫球蛋白凝集素(sialicacid-bindingig-likelectins)结合，通过凝集素胞内区的抑制性信号结构域，启动宿主免疫负调控信号，从而逃脱宿主的免疫防御，引发全身性感染。对gbs、肺炎链球菌与2型猪链球菌等细菌的研究均发现，通过基因敲除的方法使细菌的荚膜多糖唾液酸含量降低，通过感染宿主实验均发现会导致菌株的毒力显著降低。通过回复突变或转入突变基因，使荚膜唾液酸的含量恢复到野生株的水平，菌株毒力也恢复至野生株水平。因此，通过检测测定同种细菌荚膜多糖末端唾液酸含量，可以间接比较不同菌株之间侵染宿主的毒力水平。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题，就是提出一种细菌荚膜多糖末端唾液酸含量的测定试剂及方法。为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现：一种细菌荚膜多糖末端唾液酸含量的测定试剂，包括反应试剂a和反应试剂b，其中，反应试剂a为质量分数2％间苯二酚溶液2.5ml、0.1mol/l硫酸铜溶液62.5μl、25％盐酸溶液20ml，加水稀释至100ml而成；反应试剂b为16ml乙酸丁酯与4ml丁醇混匀配制成的乙酸丁酯-丁醇液。一种细菌荚膜多糖末端唾液酸含量的测定试剂的制备方法，包括如下步骤：s1、配制反应试剂a(显色剂)：称取间苯二酚粉末加双蒸水配制成质量分数为2％间苯二酚溶液；称取五水硫酸铜晶体加双蒸水配制成0.1mol/l硫酸铜溶液；称取质量分数为36％浓盐酸加双蒸水配制成20％盐酸溶液；分别量取质量分数2％间苯二酚溶液2.5ml、0.1mol/l硫酸铜溶液62.5μl、25％盐酸溶液20ml，加水稀释至100ml，混匀，4℃避光保存备用；s2、配制反应试剂b：分别量取16ml乙酸丁酯与4ml丁醇混匀配制成乙酸丁酯-丁醇液，室温下保存备用。上述细菌荚膜多糖末端唾液酸含量的测定试剂在细菌荚膜多糖末端唾液酸含量测定，包括如下步骤：a、配制1mmol/l的唾液酸标准品溶液；b、细菌提取物样品的制备：菌种固体培养基上划线培养，长出菌落后挑取单菌落置于液体培养基培养至稳定期；培养的菌液分别置于冷冻离心机在≥8500r/min、4℃条件离心30分钟，去除上清，收集菌体，用80-100ml预冷的0.033mol/l的pbs缓冲液洗涤菌体；重悬菌液再次于冷冻离心机在8500r/min、4℃离心30分钟，去除上清，收集菌体并称取菌体的重量，加入浓度为0.05mol/l，ph6.0的pipes缓冲液20-50ml，重悬菌体；用高压灭菌锅对菌液120℃高压灭菌75分钟，冷却至室温后用1.5ml无菌离心管分装；每管每10ml加入20μl浓度为0.25u/μl的唾液酸苷酶，置于控温摇床中40℃、50r/min孵育3小时，酶解后的反应液置于冷冻离心机在≥8500r/min4℃条件下离心50分钟，吸取上清4℃得细菌提取物样保存品备用；c、样品中sa的测定及计算：分别向空白管、标准管和测定管中加入等体积的双蒸水、唾液酸标准品和细菌提取物样品，然后向三个试管中各加入等体积的反应试剂a和反应试剂b，具体如下表所示：空白管(对照)标准管(标准品)测定管(样品)双蒸水/ml0.2//唾液酸标准品/ml/0.2/细菌提取物样品/ml//0.2反应试剂a/ml4.04.04.0反应试剂b/ml0.20.20.2d、将管中液体混匀，置于水浴锅中100℃水浴15分钟，流水冷却后，置于离心机中3000～3500r/min离心10分钟，取上清，置于分光光度计中，设置560nm波长，1cm光径，双蒸水调零后测定各管的吸光值；细菌荚膜唾液酸含量的计算根据以下公式计算：本发明的技术原理：唾液酸苷酶作用于细菌荚膜末端唾液酸残基，使荚膜末端唾液酸解离成单糖，唾液酸在氧化剂存在的情况下与5-甲基苯二酚形成紫红色络合物，吸光度符合比色定律，通过测定细菌提取物酶解样品反应络合物吸光度与标准品反应络合物吸光度即可换算出细菌唾液酸的含量。与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：本发明通过检测测定同种细菌荚膜多糖末端唾液酸含量，可以间接比较不同菌株之间侵染宿主的毒力水平，克服了现有通过宿主攻毒实验方法检测菌株毒力水平工作量大、需要多次重复、周期长的缺点。本发明检测快速、特异性强，适用于对菌株流行病学检测强弱毒株的初步筛选工作。附图说明图1为菌株菌液培养至稳定期的od吸光值变化示意图，虚线标注的od吸光值为稳定期菌液的吸光值，该时期可以进行菌液取样检测；图2为本发明对于细菌进行检测的样品的特异性检测示意图；其中，1，2，3分别代表不同毒力的菌株，说明这种荚膜唾液酸含量检测方法可以检测出不同菌株的唾液酸含量差异。具体实施方式为让本领域的技术人员更加清晰直观的了解本发明，下面将结合附图，对本发明作进一步的说明。实施例1一种细菌荚膜多糖末端唾液酸含量的测定试剂，包括反应试剂a和反应试剂b，其中，反应试剂a为质量分数2％间苯二酚溶液2.5ml、0.1mol/l硫酸铜溶液62.5μl、25％盐酸溶液20ml，加水稀释至100ml而成；反应试剂b为16ml乙酸丁酯与4ml丁醇混匀配制成的乙酸丁酯-丁醇液。实施例2实施例1中测定试剂的制备方法，包括如下步骤：s1、反应试剂a(显色剂)：精密称取间苯二酚粉末2g，置于容量瓶中加双蒸水定容至100ml，配制成2％间苯二酚溶液；精密称取五水硫酸铜晶体0.25g，置于容量瓶中加双蒸水定容至10ml，配制成0.1mol/l硫酸铜溶液；称取36％浓盐酸67.5ml，缓慢加入双蒸水容至100ml，配制成20％盐酸溶液；分别量取2％间苯二酚溶液2.5ml、0.1mol/l硫酸铜溶液62.5μl、25％盐酸溶液20ml，加水稀释至100ml，混匀，4℃避光保存备用。s2、反应试剂b：分别量取16ml乙酸丁酯与4ml丁醇混匀配制成乙酸丁酯-丁醇液，室温下保存。实施例3a、配制唾液酸对照品溶液(1mmol/l)：精密称取唾液酸309.27mg，置于容量瓶中加双蒸水定容至100ml，作为唾液酸贮备液(10mmol/l)，按一次使用量分装，-70℃贮存，有效期1年，每管仅可冻融1次。移液器精密吸取唾液酸贮备液1ml，置于容量瓶中加双蒸水定容至10ml，即为唾液酸标准品溶液(1mmol/l)，用前配制。b、冻存保存的菌种常温解冻并在固体培养基上划线培养，长出菌落后挑取单菌落置于液体培养基培养至稳定期，菌株菌液培养至稳定期的od吸光值变化如图1所示；培养的菌液分别置于冷冻离心机在≥8500r/min4℃条件下离心30分钟，去除上清，收集菌体，用80-100ml预冷的pbs缓冲液(0.033mol/l)洗涤菌体；重悬菌液再次于冷冻离心机在8500r/min4℃离心30分钟，去除上清，收集菌体并称取菌体的重量，加入20-50mlpipes缓冲液(0.05mol/l，ph6.0)重悬菌体。用高压灭菌锅对菌液120℃高压灭菌75分钟，冷却至室温后用1.5ml无菌离心管分装。每管加入20μl唾液酸苷酶(神经氨酸酶)(0.25u/μl，casno.9001-67-6)，置于控温摇床中40℃50r/min孵育3小时，酶解后的反应液置于冷冻离心机在≥8500r/min4℃条件下离心50分钟，吸取上清4℃保存备用(细菌提取物样品)。c、样品中sa的测定及计算：分别向空白管、标准管和测定管中加入等体积的双蒸水、唾液酸标准品和细菌提取物样品，然后向三个试管中各加入等体积的反应试剂a和反应试剂b，具体如下表所示：空白管(对照)标准管(标准品)测定管(样品)双蒸水/ml0.2//唾液酸标准品/ml/0.2/细菌提取物样品/ml//0.2反应试剂a/ml4.04.04.0反应试剂b/ml0.20.20.2d、将管中液体混匀，置于水浴锅中100℃水浴15分钟，流水冷却后，置于离心机中3000～3500r/min离心10分钟，取上清，置于分光光度计中，设置560nm波长，1cm光径，双蒸水调零后测定各管的吸光值；细菌荚膜唾液酸含量的计算根据以下公式计算：图2为罗非鱼源分离的3种不同毒力的无乳链球菌(gbs)菌株，其毒力的确定方法是通过攻毒实验的死亡率来确定其毒力大小，具体步骤为：挑取bhia平板上的不同gbs菌株分别接种至1.0mlbhi液体培养基中过夜培养，以1:50(v/v)的比例分别转接于100ml新鲜bhi培养基的锥瓶中，28℃200r/min振荡培养至稳定期。4000r/min离心，去上清后用灭菌的0.01mol/lpbs缓冲液洗涤菌体。再次4000r/min离心，用pbs缓冲液配置梯度浓度的菌液，对尼罗罗非鱼进行腹腔注射感染,每尾100μl/50g，对照组注射等量无菌pbs缓冲液。观察并记录15天内尼罗罗非鱼的累积死亡率。确定毒力的菌株在进行荚膜多糖唾液酸含量的比较，具体步骤为：将3种gbs菌株28℃培养至稳定期，分别8500r/min4℃离心30min,收集菌体，80ml预冷的pbs(0.033mol/l)洗涤菌体，重复上述步骤，离心并称取净重，加入30ml0.05mol/lpipes缓冲液(ph6.0)重悬菌体。120℃75min高压灭菌。冷却至室温后用1.5ml无菌离心管分装。每管加入20μl唾液酸苷酶(0.25u/μl),40℃50r/min孵育3h；酶解后的反应液8500r/min4℃离心50min,取上清。置于分光光度计中，设置560nm波长，1cm光径，双蒸水调零后测定各管的吸光值；根据公式计算菌株的唾液酸含量。结论：实验结果发现，gbs细菌的毒力与gbs的荚膜唾液酸含量成正相关性，1号菌株的毒力最高，其荚膜唾液酸含量也最高。3号菌株的毒力和荚膜唾液酸含量次之，2号菌株的毒力和荚膜唾液酸含量最低。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12