一种用于检测牛病毒性腹泻病毒抗体的表达蛋白、ELISA试剂盒及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物制品领域，具体讲，涉及一种用于检测牛病毒性腹泻病毒抗体的表达蛋白、elisa试剂盒及其制备方法和应用。
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：牛病毒性腹泻病毒(bovineviraldiarrheavirus，bvdv)是导致牛病毒性腹泻病(bovineviraldiarrheadisease，bvd)的主要病原，主要感染牛，也感染猪、羊、骆驼等其他生物，宿主范围较广。临床上主要以腹泻、生长繁殖障碍、免疫抑制、急性或慢性黏膜病和持续性感染等症状为主。bvdv属于黄病毒科(flaviviridae)瘟病毒属(pestivirus)，与瘟病毒属的另外两种猪瘟病毒及边界病病毒的同源性较高，具有结构相关性与抗原相关性，且存在血清学交叉反应。根据不同的分型标准，bvdv可分为一种血清型、两种生物型(致细胞病变型(cytopathicbiotype，cp)和非致细胞病变型(non-cytopathicbiotype，ncp)和三种基因型(bvdv-1型、bvdv-2型和bvdv-3型)。由于rna病毒的高突变性及国内外、地区间的交流日益频繁，近年来部分地区分离出了新的亚型，基因型不断出现。bvdv在世界范围内广泛流行。bvdv主要宿主为牛，牛感染bvdv后会出现一系列临床症状，直接影响牛的生长发育与繁殖，而牛感染bvdv后，部分牛群会出现免疫力下降等情况，这就给其他病原感染牛群造成了便利条件。随着养牛业规模化的发展，该病造成巨大损失，逐渐被人们熟知。因此，监测和防控该病显得尤为重要。实行严格的检疫、建立bvdv感染阴性种群作为防制bvd发生的有效措施，同时加强对健康牛群和可疑牛群的血清学监测，有针对性采取不同措施，减少bvd发生，为牛群养殖创造良好的条件。因此，对养殖群体定期进行抗体阳性动物筛选，不断淘汰清群或者制定合适的综合防御措施，避免动物群的感染发病，广泛而深入地开展bvd感染的流行病学调查，进行bvd检测技术的研究，研制和开发bvd抗体和抗原监测试剂盒，为bvd的防治提供技术支撑。目前，国内外报到的bvdv检测方法分为抗体和抗原检测。抗体检测如酶联免疫吸附试验、中和试验、琼脂扩散试验等。抗原检测方法有病毒分离、rt-pcr技术、免疫荧光技术和核酸杂交技术等。病毒分离、血清中和实验、等方法耗时时费力，rt-pcr、电镜观察等需要专业人员，不适宜在牧区使用。鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：鉴于
背景技术：
中存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于检测牛病毒性腹泻病毒抗体的表达蛋白、elisa试剂盒及其制备方法和应用。本发明第一方面提出一种用于检测牛病毒性腹泻病毒抗体的表达蛋白，编码所述表达蛋白的核苷酸序列如seqidno：1所示。可选的，所述表达蛋白为上清蛋白。可选的，所述表达蛋白的制备方法至少包括以下步骤：(1)查询牛病毒性腹泻病毒e2基因序列，根据大肠杆菌偏爱密码子表，对e2基因序列进行优化、增加信号肽序列并合成，得到优化后的sp-e2基因序列，所述sp-e2基因序列的核苷酸序列如seqidno：1所示；(2)构建e2基因表达菌株：优化后的sp-e2基因的核苷酸序列连接到原核表达载体pet-32a(+)，得到重组质粒pet-32a-sp-e2，将构建好的重组质粒pet-32a-sp-e2转化至大肠杆菌bl21菌体中，构建得到sp-e2基因重组表达菌株；(3)表达蛋白的诱导表达和纯化：用iptg诱导目的蛋白表达，纯化上清中的目的蛋白，获得用于检测牛病毒性腹泻病毒的表达蛋白，并进行鉴定。可选的，在步骤(3)中，iptg诱导目的蛋白表达的条件为：iptg的浓度为0.1mmol/l～0.9mmol/l，优选为0.3mmol/l；温度为16℃～37℃，优选为37℃；诱导时间为3～12小时，优选为9小时。本发明第二方面提出一种用于检测牛病毒性腹泻病毒抗体的elisa试剂盒，所述elisa试剂盒包括包被有第一方面所述的表达蛋白的elisa板。可选的，所述elisa试剂盒还包括酶标抗体、样品稀释液、洗涤液、底物显色液、终止液、阳性对照液和阴性对照液中的至少一种。可选的，所述酶标抗体选自hrp标记的兔抗牛igg，所述样品稀释液选自0.5wt％peg6000，所述底物显色液选自tmb，所述阳性对照液选自标准阳性血清，所述阴性对照液选自标准阴性血清。本发明第三方面提出该试剂盒的制备方法，所述elisa试剂盒包括采用如下步骤制备的包被有用于检测牛病毒性腹泻病毒的表达蛋白的elisa板：(1)用碳酸盐缓冲液作包被液，将用于检测牛病毒性腹泻病毒的表达蛋白稀释为0.125～8μg/ml，优选0.5～2μg/ml，更优选1μg/ml；按100μl/孔加入elisa反应板中，在37℃条件下封闭1～3小时或4℃过夜，优选37℃封闭2小时；拍干，洗涤；优选的，所述碳酸盐缓冲液的ph为9.6；(2)用10wt％peg6000在37℃条件下封闭1～3小时或4℃过夜，优选37℃封闭2小时；洗涤，拍干，包装。本发明第四方面提出该elisa检测试剂盒在检测牛病毒性腹泻病毒抗体上的应用。可选的，所述应用至少包括以下步骤：(1)加样：向酶标板微孔中加入用样品稀释液3倍稀释后的待检测血清样品100μl，37℃作用0.5～2小时，优选1小时；同时做阴性对照和阳性对照，阴性对照每孔加100μl阴性对照血清，阳性对照每孔加100μl阳性对照血清，在37℃条件下作用0.5～2小时，优选1小时；(2)洗涤：倒出孔中的液体，每孔中加入洗涤液250μl，洗涤并拍干；(3)加酶标抗体：每孔中加入酶标抗体工作液100μl，在37℃条件下作用0.5～2小时，优选1小时；(4)洗涤：倒出孔中的液体，每孔中加入洗涤液250μl，洗涤并拍干；(5)显色：每孔中先加入底物显色液100μl，37℃条件下避光显色10分钟～25分钟，优选15分钟；(6)加终止液：每孔中加入终止液50μl；(7)测定：用酶标仪在450nm处测定每孔的吸光光度值。本发明至少具有以下的有益效果：1、本发明的生物安全性高。本发明所涉及到的原核表达载体pet-32a(+)是分子生物学中常用表达载体，没有生物危险性，在此基础上构建的原核表达载体pet-32a-sp-e2也没有任何生物危险性。重组大肠杆菌escherichiacolibl21/pet-32a-sp-e2是将原核表达载体pet-32a-sp-e2转化至大肠杆菌bl21感受态细胞后经氨苄青霉素抗性筛选获得，不具生物危险性。本发明所用的抗原酶标板是用牛病毒性腹泻病毒e2蛋白包被的，制备过程中不涉及牛病毒性腹泻病毒，因此没有牛病毒性腹泻病毒扩散的潜在危险。2、本发明试剂盒的成本低。首先，本发明所提供的牛病毒性腹泻病毒elisa抗体检测试剂盒所需抗原是牛病毒性腹泻病毒e2基因表达蛋白e2蛋白。该蛋白可以通过重组大肠杆菌escherichiacolibl21/pet-32a-sp-e2在体外大量表达，适合大规模的生产，具有广泛的应用前景。其次，本发明在牛病毒性腹泻病病毒e2基因上加了一段信号肽序列，增加了目的蛋白的细胞外分泌表达量，这种分泌蛋白能以活性结果生成而不发生聚集，避免了复性困难，易于纯化，省力省时间。3、本发明的试剂盒的符合率高、重复性好。临床上检测牛病毒性腹泻病毒可采用常规的病毒分离鉴定和中和试验，不但步骤较为繁琐费时，且试验结果可重复性不高。也可以用idexx-bvdv-elisa试剂盒，idexx-bvdv-elisa试剂盒是从血清学方面检测bvdv抗体，利用“抗原-抗体-抗抗体”结合原理，能快速、准确，临床上能大规模检测的安全性很高的诊断牛病毒性腹泻病毒感染的试剂盒，但是进口试剂盒成本特别高而且包被抗原背景不太清楚。本发明同样是bvdv-elisa试剂盒，但是背景取材于国内流行株，而且成本低。4、本发明试剂盒的特异性和敏感性更高。因包被的蛋白是天然活性结构蛋白，所以特异性和敏感性更高。附图说明图1为本发明实施例用于检测牛病毒性腹泻病毒的elisa试剂盒的制备流程图；图2为实施例2中bvdv-e2蛋白的二级结构预测图；图3为实施例2中bvdv-e2蛋白的亲水性、抗原性和表面可及性的预测图；图4为实施例2中重组表达质粒的双酶切鉴定，其中，m泳道表示proteinmarker，1表示pet-32a-sp-e2双酶切产物；图5为实施例2中牛病毒性腹泻病毒e2蛋白诱导表达的sds-page图，其中，m泳道表示proteinmarker，1表示pet-32a-sp-e2未诱导的上清，2表示pet-32a-sp-e2诱导的上清；图6为实施例2中westernblot鉴定实验结果，其中，m泳道表示proteinmarker，1表示pet-32a-sp-e2；图7为实施例4中纯化后的牛病毒性腹泻病毒e2蛋白的sds-page分析试验结果，其中，m泳道表示proteinmarker，1表示纯化后的pet-32a-sp-e2；图8为实施例6中抗原包被浓度及标准血清稀释度筛选实验结果曲线；图9为实施例6中佳抗原包被液筛选实验结果曲线；图10为实施例6中包被条件筛选实验结果曲线；图11为实施例6中封闭液筛选实验结果曲线；图12为实施例6中封闭条件筛选实验结果曲线；图13为实施例6中被检血清稀释液筛选实验结果曲线；图14为实施例6中被检血清孵育时间筛选实验结果曲线；图15为实施例6中二抗稀释浓度筛选实验结果曲线；图16为实施例6中二抗稀释液筛选实验结果曲线；图17为实施例6中二抗孵育时间筛选实验结果曲线；图18为实施例6中底物作用时间筛选实验结果曲线。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本发明实施例第一方面提出一种用于检测牛病毒性腹泻病毒抗体的表达蛋白，编码表达蛋白的核苷酸序列如seqidno：1所示。本发明实施例为充分发挥e2蛋白生物学功能的优势区段，根据生物信息学综合分析，截取抗原性、亲水性等较高的序列，即154-342aa，由189个氨基酸组成，分子量约22kda。对应e2编码区位点为460-1026，共567bp。运用稀有密码子分析工具进行基因序列优化，优化前的cai值为0.67，密码子优化后值为0.97，理论上可有效的提高该基因在宿主菌中的表达量。并且，为了提高蛋白细胞外分泌表达量优化好的密码子加了一段信号肽序列，增加了目的蛋白的细胞外分泌表达量，这种分泌蛋白能以活性结果生成而不发生聚集，避免了复性困难，易于纯化。其中，seqidno：1的核苷酸序列为：其中，起始66个加粗字体的核苷酸代表信号肽序列，带有下划线的核苷酸代表优化后的核苷酸。并且，本发明实施例的表达蛋白为上清蛋白。本发明实施例制备得到表达蛋白的形式为上清蛋白，从而可进一步提高采用该上清蛋白所制备的试剂盒的特异性和敏感性。可选的，表达蛋白的制备方法至少包括以下步骤：(1)查询牛病毒性腹泻病毒e2基因序列，根据大肠杆菌偏爱密码子表，对e2基因序列进行优化、增加信号肽序列并合成，得到优化后的sp-e2基因序列，sp-e2基因序列的核苷酸序列如seqidno：1所示；(2)构建e2基因表达菌株：优化后的sp-e2基因的核苷酸序列连接到原核表达载体pet-32a(+)，得到重组质粒pet-32a-sp-e2，将构建好的重组质粒pet-32a-sp-e2转化至大肠杆菌bl21菌体中，构建得到sp-e2基因重组表达菌株；(3)表达蛋白的诱导表达和纯化：用iptg诱导目的蛋白表达，纯化上清中的目的蛋白，获得用于检测牛病毒性腹泻病毒的表达蛋白，并进行鉴定。可选的，在步骤(3)中，iptg诱导目的蛋白表达的条件为：iptg诱导目的蛋白表达的条件为：iptg的浓度为0.1mmol/l～0.9mmol/l，优选为0.3mmol/l；温度为16℃～37℃，优选为37℃；诱导时间为3～12小时，优选为9小时。经筛选实验发现，在该条件下诱导目的蛋白表达，所获得的目的蛋白表达量最高。本发明实施例第二方面提出一种用于检测牛病毒性腹泻病毒的elisa试剂盒，elisa试剂盒包括包被有第一方面所述的表达蛋白的elisa板。本发明实施例采用表达蛋白的上清蛋白包被elisa板，从而可提高试剂盒的特异性和敏感性。可选的，elisa试剂盒还包括酶标抗体、样品稀释液、洗涤液、底物显色液、终止液、阳性对照液和阴性对照液中的至少一种。具体的，所述酶标抗体选自hrp标记的兔抗牛igg，样品稀释液可选自0.5wt％peg6000，底物显色液可选自tmb，洗涤液可选用含有0.5％(v/v)吐温20的pbst(使用时稀释10倍使用)，阳性对照液可选自标准阳性血清，阴性对照液可选自标准阴性血清。本发明实施例第三方面提出该试剂盒的制备方法，具体的，elisa试剂盒包括采用如下步骤制备的包被有用于检测牛病毒性腹泻病毒的表达蛋白的elisa板：(1)用碳酸盐缓冲液作包被液，将用于检测牛病毒性腹泻病毒的表达蛋白稀释为0.125～8μg/ml，优选0.5～2μg/ml，更优选1μg/ml；按100μl/孔加入elisa反应板中，在37℃条件下封闭1～3小时或4℃过夜，优选37℃封闭2小时；拍干，洗涤；优选的，所述碳酸盐缓冲液的ph为9.6；(2)用10wt％peg6000在37℃条件下封闭1～3小时或4℃过夜，优选37℃封闭2小时；洗涤，拍干，包装。具体的，该试剂盒的制备的整体制备流程图如图1所示。其中，阳性对照血清采用样品稀释液稀释标准阳性血清制备得到(标准阳性血清采用idexx-bvdv-elisa试剂盒检测od450＞1.5)，阴性对照血清采用样品稀释液稀释标准阴性血清(标准阴性血清采用idexx-bvdv-elisa试剂盒检测od450＜0.2)后分装得到。阳性血清和阴性血清的制备方法如实施例5所示。可选的，稀释倍数为1：100～1:800，优选为1：400浓度稀释。酶标抗体(即图1所示的酶标二抗，稀释前浓度为od280条件下4～11mg/ml)优选采用1wt％peg6000以1：2500～1：6000浓度稀释后分装得到，优选为1：4000浓度稀释。其余组分：样品稀释液、洗涤液、底物显色液、终止液均采用常规方法配置、分装后得到。本发明实施例第四方面提出该elisa检测试剂盒在检测牛病毒性腹泻病毒抗体上的应用。可选的，应用至少包括以下步骤：(1)加样：向酶标板微孔中加入用样品稀释液3倍稀释后的待检测血清样品100μl，37℃作用0.5～2小时，优选1小时；同时做阴性对照和阳性对照，阴性对照每孔加100μl阴性对照血清，阳性对照每孔加100μl阳性对照血清，在37℃条件下作用0.5～2小时，优选1小时；(2)洗涤：倒出孔中的液体，每孔中加入洗涤液250μl，洗涤并拍干；(3)加酶标抗体：每孔中加入酶标抗体工作液100μl，在37℃条件下作用0.5～2小时，优选1小时；(4)洗涤：倒出孔中的液体，每孔中加入洗涤液250μl，洗涤并拍干；(5)显色：每孔中先加入底物显色液100μl，37℃条件下避光显色10分钟～25分钟，优选15分钟；(6)加终止液：每孔中加入终止液50μl；(7)测定：用酶标仪在450nm处测定每孔的吸光光度值。下面通过具体实施例对本发明实施例的内容做进一步的说明。如无特殊说明，本申请所用到的原料均为市售原料。实施例1一种用于检测牛病毒性腹泻病毒的elisa试剂盒，其组成如表1所示：表1名称组成数量(标示量)样品稀释液0.5wt％peg60001瓶(250ml)10×浓缩洗涤液含有0.5％(v/v)吐温20的pbst1瓶(250ml)酶标抗体hrp标记的兔抗牛igg1瓶(30ml)底物显色液tmb1瓶(30ml)终止液2mol/l稀硫酸1瓶(30ml)包被bvdv抗原的96孔板—5块阳性对照标准阳性血清1瓶(2ml)阴性对照标准阴性血清1瓶(2ml)封板膜—10张说明书—1份实施例2：bvdv-e2基因生物信息学分析及表达1材料和方法1.1试验材料大肠杆菌bl21为全式金公司产品，dna限制性内切酶购自neb公司，dna凝胶回收纯化试剂盒为axygeng公司产品，质粒小提试剂盒购自qiagen公司；酵母粉、胰蛋白胨、琼脂粉为oxoid公司产品，由辣根过氧化物酶标记的兔抗牛igg购自sigma有限公司，bca蛋白定量检测试剂盒购自takara公司。1.2试验方法1.2.1e2基因生物信息学分析利用dnastar、swiss等软件及在线服务器对bvdv(dq088995.2)e2基因进行分析，预测该基因编码蛋白的大小、信号肽、二级结构、三级结构、抗原性、疏水性等。1.2.2密码子优化合成及重组载体的构建根据生物信息学分析，截取抗原性、亲水性等较好的e2基因片段。为了提高e2蛋白在大肠杆菌中的表达水平，运用稀有密码子分析工具optimumgenetm等软件进行基因序列优化，优化好的密码子加一段信号肽序列，改造好的e2基因命名为sp-e2，其核苷酸序列如seqidno：1所示。将该序列进行生物合成并连接到原核表达载体pet-32a(+)，酶切位点分别为bamhi和xhoⅰ，转化至宿主菌e.colibl21(de3)中，于氨苄青霉素抗性的平板上选择单个疑似阳性菌落接种lb液体培养基，提取质粒经双酶切鉴定并测序保菌。1.2.3重组菌诱导表达及纯化将1.2.2中保的菌接种于含有氨苄青霉素的lb平板中在平板上37℃培养12～18小时后挑选阳性的单克隆菌落，接种于5ml含有氨苄青霉素抗性的lb培养基中，过夜摇菌。按体积比1:100取过夜培养的菌液接种于新鲜的含有50μg/ml氨苄青霉素的液体lb培养基中扩大培养，分装至12支试管中(5ml/试管)，37℃以200r/min摇菌至菌液od600nm值为0.4-0.6，加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)终浓度分别为0.1mmol/l、0.3mmol/l、0.6mmol/l、0.9mmol/l，分别于不同温度16℃、25℃、37℃，继续诱导3h、6h、9h、12h，等量取样进行sds-page分析，确定诱导剂最佳诱浓度、最佳诱导温度、最佳诱导时间。离心收集菌体，破碎处理离心收集上清(e2基因加信号肽后分泌的蛋白溶在上清液体里)，通过sds-page分析评估蛋白在不同条件下的表达水平，为选择最佳诱导条件提供参考。按genisepharose6fastflow说明书纯化上清蛋白，然后进行蛋白透析。1.2.4westernblot鉴定pet-32a-sp-e2蛋白纯化后用bca蛋白定量检测试剂盒测定蛋白含量。将蛋白进行sds-page后，将蛋白转印到硝酸纤维素膜上，用10wt％peg6000常温封闭2h，以牛bvdv阳性血清为一抗，辣根过氧化物酶标记的兔抗牛igg为二抗，进行westernblot分析。2结果2.1e2基因生物信息学分析2.1.1e2蛋白基本理化性质分析参考株bvdve2蛋白全长为1122bp，编码374个氨基酸。应用在线软件protparam预测bvdve2蛋白的基本理化性质，结果显示，e2蛋白分子式为c1889h2951n499o551s29，分子质量为42.397ku,带负电的氨基酸残基(asp+glu)有45个，带正电的氨基酸残基(arg+lys)有44个。蛋白等电点为6.66，表明该蛋白为酸性蛋白质。体外半衰期为1.1h(哺乳动物网状细胞，体外)，3min(酵母菌内)，大于10h(大肠杆菌内)。蛋白消光系数为1.308，不稳定指数预测为34.71，该蛋白属于稳定蛋白。脂肪指数是79.47，总体亲水性平均值为-0.220。2.1.2e2蛋白二级、三级结构分析将e2蛋白氨基酸序列导入到nps@sopma进行蛋白二级结构预测，结果表明，e2蛋白的二级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主，β-折叠和伸展链为辅共同构成。其中无规卷曲(cc)比例为34.22％，α-螺旋(hh)比例为29.68％，β-折叠(tt)占12.83％伸展链(ee)占4.20％，具体二级结构预测的示意图如图2所示。2.1.3protean分析运用dnastar中protean分析软件，对e2蛋白的亲水疏水区、抗原指数、表面可及性等进行预测。综合分析，b细胞抗原表位的优势区段分别为43-116aa、154-249aa、271-342aa，具体预测图如图3所示。2.1.4信号肽分析通过signalp4.0server在线分析，e2蛋白没有信号肽。2.1.5跨膜区预测使用tmhmmserverv.2.0在线预测跨膜结构域，结果显示，345-367aa为跨膜区，1-344aa位于膜外，368-374aa位于膜内。2.2密码子优化合成及重组载体的构建2.2.1密码子优化本实验为充分发挥e2蛋白生物学功能的优势区段，根据生物信息学综合分析，截取抗原性、亲水性等较高的序列，即154-342aa，由189个氨基酸组成，分子量约22kda。对应e2编码区位点为460-1026，共567bp。运用稀有密码子分析工具进行基因序列优化，优化前的cai值为0.67，密码子优化后值为0.97，理论上可有效的提高该基因在宿主菌中的表达量。为了提高蛋白细胞外分泌表达量优化好的密码子加了一段信号肽序列，改造好的e2基因命名为sp-e2，其核苷酸序列如seqidno：1所示。合成该sp-e2基因序列并连接到原核表达载体pet-32a(+)。2.2.2重组质粒pet-32a-sp-e2酶切鉴定将重组质粒用bamhi和xhoⅰ进行双酶切鉴定，进行1wt％琼脂糖凝胶电泳，如图4所示。结果显示，重组质粒pet-32a-sp-e2，双酶切后得到2条大小分别为和636bp左右的片段，目的片段均符合预期大小。2.2.3重组菌诱导表达及纯化将重组质粒pet-32a-sp-e2转化到宿主菌e.colibl21(de3)菌株中，确定诱导剂iptg的最佳浓度为0.3mmol/l，最佳诱导时间为9h，最佳诱导温度为37℃。诱导表达进行sds-page电泳验证。实验结果如图5所示，在蛋白分子量为43kda处，有大量表达的蛋白条带，表达产物的蛋白大小与截短基因sp-e2编码的蛋白大小一致，表明原核表达成功。2.2.4westernblot鉴定sds-page后，将蛋白转印到硝酸纤维素膜上，封闭2h，以牛bvdv阳性血清(1:200)为一抗，二抗均为辣根过氧化物酶标记的兔抗牛igg(1:4000)，进行westernblot分析。结果显示，在43kda处，均有目的条带，表明pet-32a-sp-e2表达的重组蛋白具有良好的抗原性，实验结果如图6所示。实施例3：e2蛋白(优化后的)大量诱导及纯化具体实验步骤为：1、将重组质粒pet-32a-sp-e2的bl21菌种接种于含氨苄青霉素的5mllb液体培养基中，至终浓度为50μg/ml，37℃摇床培养约12h，取该活化的菌液2ml加入200ml氨苄青霉素lb培养基中，置于37℃摇床培养至od550为0.4～0.6时，加入诱导剂iptg至终浓度0.3mmol/l，再置于37℃摇床振摇培养9h，收获细菌。2、将诱导的菌体在4℃、8000rpm离心收集后，以pbs(ph7.2)洗涤菌体一次，加溶菌酶，破碎处理，离心，收集上清。然后按genisepharose6fastflow说明书纯化蛋白，纯化好的蛋白需转至处理好的透析袋中，于te溶液(ph8.0)透析12h，提纯的蛋白立即使用或分装至1.5ml管，-80℃保存备用。实施例4：纯化的表达蛋白e2的sds-page检测和western-blot分析sds-page检测：取实施例3所纯化并重折叠的蛋白e220μl，加入5μl的5×sds上样缓冲液(100mmol/ltris.hcl，ph6.8)，充分重悬，水浴煮沸10min，然后室温离心8000rpm/min，离心2min，取上清上样电泳，上层90v，大约20～30min，下层胶120v，大约1.5h。取下凝胶，考马斯亮蓝r250染色液染色2h，sds-page脱色液脱色1h，得到实验结果如图7所示，在纯化上清可见43kda大小的纯化蛋白。按照实施例2进行western-blot分析纯化的蛋白e2具有良好的反应原性。实施例5：标准阳、阴性血清的制备1标准阳性血清的制备及检验1.1制造用动物应用来自无病毒性腹泻病毒感染的地区，用美国idexx公司的bvdv-elisa抗体检测试剂盒检测，bvdv抗体为阴性的28～35日龄健康易感犊牛。使用前隔离观察7日。1.2免疫经颈部肌肉注射，分3次接种天康生物有限公司生产的牛病毒性腹泻/粘膜病灭活疫苗，2ml/次，每次间隔14日。末次接种后7日，用常规方法采血，待血液凝固后置于37℃温箱放置2h，再置于2～8℃放置1h，然后将析出的血清置于离心瓶中，8000r/min离心15～20min，无菌分离血清，定量分装。1.3检验用美国idexx公司的bvdv-elisa抗体检测试剂盒检测阳性血清，od450＞1.5，若测得的效价不足，可适当增加接种剂量和次数。1.4分装将检验合格的阳性血清加入0.01wt％叠氨铀防腐，并充分摇匀，定量分装，2ml/瓶，置于-80℃保存备用。2标准阴性血清的制备及检验2.1制造用动物应选用来自无病毒性腹泻病毒感染的地区，用美国idexx公司的bvdv-elisa抗体检测试剂盒检测，bvdv抗体为阴性的健康牛。2.2血清制造用常规方法采血，待血液凝固后置于37℃温箱放置2h，再置于2～8℃放置1h，然后将析出的血清置于离心瓶中，8000r/min离心15～20min，无菌分离血清，加入0.01wt％叠氨铀防腐，定量分装，将上清置于-80℃保存备用。2.3分装将检验合格的阴性血清定量分装，2ml/瓶，置于-70℃保存。2.4特异性检验对牛病毒性腹泻病病毒e2蛋白抗原呈阴性反应。实施例6：牛病毒性腹泻病病毒抗体检测elisa方法的优化1方法1.1最佳抗原包被浓度与标准阳性血清最佳稀释度的确定利用方阵法确定最佳抗原包被浓度及血清稀释。将bvdv-e2蛋白以8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml和0.125μg/ml，分别包被96孔酶标板，选择ph9.6的碳酸盐缓冲液以100μl/孔依次稀释抗原，4℃过夜包被。以含0.05％(v/v)吐温20的pbst作为洗涤液，洗板机洗涤3次，用滤纸拍干。用pbst配制含1wt％的猪源明胶作为封闭液，每孔200μl，37℃于湿盒中孵育2小时，洗涤3次，同上。用0.2wt％的猪源明胶血清稀释液分别稀释标准阴阳性血清，血清稀释倍数为1:100，1:200，1:400，1:800，每孔100μl，37℃作用1h，洗涤5次。以1:3000的比例用0.2wt％的猪源明胶稀释hrp标记的兔抗牛二抗，每孔100μl，37℃于湿盒中孵育1h，洗涤5次。室温避光加入tmb底物显色液100μl/孔，作用20min后以50μl/孔加入2mol/lh2so4终止显色，用多功能酶标仪测定od450nm值。p/n值较大者确定为最佳优化条件(p/n＝标准阳性od450nm值/标准阴性od450nm值，取阳性值在1.0～2.0之间，阴性值小于0.2)。标准阳性血清和标准阴性血清样本做2个重复、取平均值。1.2抗原最佳包被液与包被条件的确定按照elisa常规步骤，分别选择水、tris-hcl及碳酸盐缓冲液作为抗原包被液，以1.1中优化好的最佳抗原包被浓度及最佳血清稀释度加入96孔酶标板，1wt％的猪源明胶作为封闭液，以1:3000的比例用0.2wt％的猪源明胶稀释二抗，其余条件不变，显色终止后，用酶标仪测定od450nm值。确定最佳抗原包被液后，用最佳包被液稀释e2蛋白，包被条件分别为4℃过夜、37℃保温1h和37℃保温2h三种不同的包被条件，其余条件不变，显色终止后，用酶标仪测定od450nm值。p/n值较大者确定为最佳优化条件。标准阳性血清和标准阴性血清样本做2个重复、取平均值。1.3最佳封闭液与封闭条件的确定以最适多肽包被量包被酶标板，分别选取1wt％bsa(kpl公司)，5wt％脱脂乳粉(bd公司)，1wt％的海藻糖(sigma公司)，10wt％的peg6000，1％马血清(hyclone)，1wt％猪源明胶(sigma公司)，1wt％猪源明胶+1wt％的海藻糖，200μl/孔，分别37℃封闭1h、2h、3h、4℃过夜，其余步骤按常规elisa操作方法进行，根据od值确定最佳封闭液和最佳封闭时间。标准阳性血清和标准阴性血清样本做2个重复、取平均值。1.4最佳血清稀释液和作用时间的优化以优化好的最佳抗原包被浓度、最佳抗原包被液和包被条件将bvdv-e2蛋白包被于酶标板，以最佳封闭液和封闭条件封闭，血清稀释液分别选择0.5wt％海藻糖、0.5wt％peg6000、0.2wt％的猪源明胶和pbst，将标准阴阳性血清按照最佳血清稀释度稀释，以1:3000的比例稀释兔抗牛二抗，其余条件不变，显色终止后，用酶标仪测定od450nm值。标准阳性血清和标准阴性血清样本做2个重复、取平均值。确定最佳血清稀释液后，37℃于湿盒中孵育，一抗作用时间分别为0.5h、1h、1.5h和2h四种不同的一抗作用条件，其余条件不变，显色终止后，用酶标仪测定od450nm值，确定被检血清最佳作用时间。标准阳性血清和标准阴性血清样本做2个重复、取平均值。1.5酶标抗体(hrp标记的兔抗牛igg)工作浓度、稀释液和作用时间的确定以优化好的最佳抗原包被浓度、最佳抗原包被液和包被条件将bvdv-e2蛋白包被于酶标板，以优化好的的最佳封闭液和封闭条件封闭，以优化好的最佳血清稀释液和作用时间，将标准阴阳性血清按照最佳血清稀释度稀释，酶标二抗的工作浓度分别为1:2500、1:3000、1:3500、1:4000、1:4500、1:5000、1:5500、1:6000，其余条件不变，显色终止后，用酶标仪测定od450nm值，确定最佳酶标工作浓度。标准阳性血清和标准阴性血清样本做2个重复、取平均值。确定最佳酶标工作浓度后，二抗分别用0.5wt％海藻糖、1wt％peg6000、0.2wt％的猪源明胶、0.5wt％海藻糖+1wt％peg6000+0.2wt％的猪源明胶混合稀释液和pbst稀释到优化好的最佳浓度，其余条件相同，按照elisa常规步骤，用酶标仪测定od450nm值，确定最佳二抗稀释液。标准阳性血清和标准阴性血清样本做2个重复、取平均值。二抗用优化好的最佳稀释液稀释至优化好的最佳浓度，每孔加入100μl后37℃于湿盒中孵育，二抗作用时间分别为0.5h、1h、1.5h和2h四种不同的作用条件，其余条件不变，按elisa常规方法操作，用酶标仪测定od450nm值，确定最佳二抗作用时间。标准阳性血清和标准阴性血清样本做2个重复、取平均值。1.6底物作用时间的确定取bvdv-e2蛋白按照优化的抗原浓度和条件包被酶标板，甩净板中的液体，用含0.05％(v/v)吐温-20的pbs(ph值7.4)洗板4次，200μl/孔，每次2min，用力甩净酶标板中的液体，然后，用优化好的封闭液条件进行封闭。甩净板中的液体，用含0.05％(v/v)吐温-20的pbs(ph值7.4)洗板5次，200μl/孔，每次2min，用力甩净酶标板中的液体，按优化的条件进行稀释血清，加入到酶标板上，按优化的条件孵育，用含0.05％(v/v)吐温-20的pbs(ph值7.4)洗板5次，200μl/孔，每次2min，用力甩净酶标板中的液体，加入酶标抗体，按优化的条件加入酶标抗体。用含0.05％(v/v)吐温-20的pbs(ph值7.4)洗板5次，200μl/孔，每次2min，甩净酶标板中的液体，加入底物tmb，置于37℃作用10min、15min、20min、25min。p/n值较大为最佳条件，即标准阳性血清od值/标准阴性血清的od值较大为底物显色时间。标准阳性血清和标准阴性血清样本做2个重复、取平均值。1.7优化条件的判定p/n＝(标准阳性od450值)/(标准阴性od450值)1.8临界值判定将40份已知阴性血清(idexx-bvdv-elisa抗体试剂盒检测)3倍稀释后检测其od值，临界值＝x+2sd，其中x为阴性血清数据平均值，sd为标准方差。2结果2.1最佳抗原包被浓度与被检血清最佳稀释度的确定将bvdv-e2蛋白包被酶联板，利用方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度及血清稀释度，分别做2次重复，取2次血清od450nm的平均值。蛋白浓度由8μg/ml降至0.125μg/ml时，标准阴阳性血清的od450nm呈下降趋势；随着血清稀释倍数为1:100稀释至1:800，标准阴阳性血清的od450nm降低明显。当蛋白浓度为1.0μg/ml，每孔100μl，即抗原包被浓度在1.0～0.5μg/ml区间时，od450nm变化比较明显，抗原包被浓度高于1μg/ml时，标准阳性血清的od450nm变化较小，即抗原包被浓度为1μg/ml时已趋近饱和。血清稀释倍数为1:1000时，标准阳性血清的od450nm值在1.0～2.0之间，标准阴性血清od450nm较小，故通过方阵法确定抗原包被浓度为1μg/ml，每孔100μl，最佳阳性血清稀释倍数为1:400。实验结果如图8所示。2.2抗原最佳包被液与包被条件的确定p/n值较大者为本实验最佳优化条件。从实验结果确定最佳包被液为碳酸盐，最佳包被条件37℃、2h。实验结果如图9、图10所示。2.3最佳封闭液与封闭条件的确定p/n值较大者为本实验最佳优化条件。实验结果表明，最佳封闭液10wt％peg6000，最佳封闭条件为37℃、2h。实验结果如图11、图12所示。2.4最佳血清稀释液和作用时间确定p/n值较大者为本实验最佳优化条件。实验结果表明，最佳血清稀释液为0.5wt％peg6000，最佳作用时间为37℃1h。实验结果如图13、图14所示。2.5酶标抗体(hrp标记的兔抗牛igg)工作浓度、稀释液和作用时间的确定p/n值较大者为本实验最佳优化条件。实验结果表明，二抗最佳浓度为1:4000，二抗最佳稀释液为1wt％peg6000，二抗最佳作用时间为37℃孵育1h。实验结果如图15、图16、图17所示。2.6底物作用时间的确定p/n值较大者为本实验最佳优化条件。实验结果表明，最佳显色时间为15min。实验结果如图18所示。2.7优化条件的判定取阳性值在1.0～2.0之间，阴性值尽量小于0.2，且p/n值越高说明条件越好2.8临界值的判定2.8.1应用本elisa抗体检测试剂盒检测3倍稀释后的已知40份阴性血清(idexx-bvdv-elisa抗体试剂盒检测)的od值，实验结果见表2。表240份阴性样品od450值2.8.2数据分析结果经商品化的牛病毒性腹泻病elisa抗体检测试剂盒(idexx牛病毒性腹泻病elisa抗体检测试剂盒)检测的牛40份阴性血清，用表达蛋白包被后检测，均值为0.25595，sd值为0.018761596，所以临界值为x+2sd＝0.293。实施例7：牛病毒性腹泻病病毒抗体检测elisa试剂盒特异性试验运用建立的e2-elisa检测试剂盒检测12份临床上常见的牛传染病阳性参考血清，检测结果od450均小于临界值，全部为阴性。说明该试剂盒具有较好的特异性，与常见的其他牛传染病无交叉反应，可以用于病毒性腹泻病毒抗体的临床检测。实验结果见表3。表3特异性实验结果实施例8：牛病毒性腹泻病病毒抗体检测elisa试剂盒敏感性试验将5份bvdv阳性血清进行倍比稀释后，用该elisa试剂盒和idexx-bvdv-elisa抗体检测试剂盒进行检测，检测结果表明本试剂盒具有较高的敏感性，试验结果见表4、表5。表4idexx-bvdv-elisa抗体检测试剂盒检测结果注：“+”表示阳性，od450＞0.3。“－”表示阴性，od450＜0.3。“+/－”表示可疑，0.2＜od450＜0.3。表5牛病毒性腹泻病病毒抗体检测elisa试剂盒检测结果注：“+”表示阳性，od450＞0.293。“－”表示阴性，od450＜0.293。实施例9：牛病毒性腹泻病病毒elisa抗体检测试剂盒的符合率实验应用该elisa试剂盒对临床采集的80份阳性血清和80份阴性血清样品进行检测，同时利用idexx-bvdv-elisa抗体检测试剂盒进行同步检测，牛病毒性腹泻病病毒elisa抗体检测试剂盒和idexx-bvdv-elisa抗体检测试剂盒试验符合率。可见两种方法检测样品的阳性符合率为98.75％，阴性符合率为97.50％。总符合率为98.13％。结果表明，该检测方法可准确评价血清中牛病毒性腹泻病病毒抗体的水平。实验结果见表6、表7。表6阳性血清符合率结果血清idexx抗体检测试剂盒e2elisa试剂盒符合率临床阳性血清807998.75％表7阳性血清符合率结果血清idexx抗体检测试剂盒e2elisa试剂盒符合率临床阴性血清807897.50％实施例10：本牛病毒性腹泻病病毒elisa抗体检测试剂盒的重复性试验选择8份血清，4份阳性血清，4份阴性血清，每份设3个重复来检测板内重复性，选择3个包被的酶标板对8份血清进行检测来确定板间重复性。批内重复性试验变异系数cv值在2.27％～5.05％，详见表4。批间重复性试验变异系数cv值在3.68％～6.96％，详见表5。批内和批间检测结果重复性良好，说明该试剂盒制造工艺和检验方法可靠，具有良好的可重复性，适合产业化和临床检测要求。(变异系数＝标准差/平均数×100％)详见表8、表9。表8检测批内变异系数结果表9检测批间变异系数结果实施例11：本试剂盒的临床应用应用本发明牛病毒性腹泻/粘膜病elisa抗体检测试剂盒，检测从全国10个省份采集的300份血清样品，结果阳性血清有70份，阳性率23.33％。表明本发明的试剂盒适合于对临床采集的大量样品进行快速检测，能准确评估牛群中牛病毒性腹泻/粘膜病的感染情况，具有广阔的应用前景。本发明虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本发明构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本发明的保护范围应当以本发明权利要求所界定的范围为准。序列表<110>内蒙古元山生物科技有限公司<120>一种用于检测牛病毒性腹泻病毒抗体的表达蛋白、elisa试剂盒及其制备方法和应用<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>636<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcg60atggccatgcgcacctatcgtcgtagcaaaccgtttccgcatcgccagggttgcattacc120cagaaaaccctgggcgaagatctgcataattgtattctgggtggtaattggacctgtgtg180ccgggtgacatgctgctgtataaaggcggcagtattgaaagctgcaaatggtgtggttat240cagtttaaagaaagcgaaggtctgccgcattatccgattggcaaatgtcgcctggaaaat300gaaaccggttatcgtctggtggatgataccagttgtaatcgtgaaggtgttgcaattgtg360ccgcagggcattctgcgttgcaaaattggcaaaaccaccattcaggttattgcaatggat420accaaactgggtccgatgccgtgccgcccgtatgaaattattagtagcgaaggcccggtt480gaacgtaccgcatgcacctttaattataccaaaaccctgaaaaacaagtactttgaaccg540cgcgatagctattttcagcagtatatgctgaaaggcgaatatcagtattggtttgatctg600gaagttaccgatcatcatcgcgattattttgcagaa636当前第1页12