一种茶油氧化稳定性的预测方法与流程

本发明属于化学分析领域，具体涉及一种油脂氧化稳定性的预测方法。

背景技术

茶油营养丰富，脂肪酸组成合理，其中不饱和脂肪酸高达90％，油酸75％-83％。但由于不饱和脂肪酸中的双键在有氧、光照、高温下极易被氧化而变质酸败，导致茶油丧失其原有的风味、口感及生理功能，甚至产生一些对人体健康有害的物质，因此,茶油的贮藏稳定性研究非常重要。

氧化稳定性(oilstabilityindex，osi)是评价油脂质量的重要指标，它表征油脂自动氧化变质的灵敏度，即油脂抵御自动氧化的能力，反映了油脂的耐贮性。通过测定诱导时间(inductiontime)的长短便可以了解油脂氧化稳定性的大小，诱导期越长表明油脂的氧化稳定性越大，反之，油脂氧化稳定性越小。研究表明影响油脂氧化稳定性因素有内部因素和外部条件。外部条件主要指油脂的贮藏温度，主要包括温度、光照、气体成分、包装材料等。内部条件主要指脂肪酸组成和内源性抗氧化剂。一般饱和的脂肪酸是最稳定的，油脂的氧化变质是从不饱和脂肪酸开始的，脂肪酸的双键数目越多，越易于氧化的发生。油脂中本身含有一定量的抗氧化剂，成为内源性抗氧化剂，大多数植物油脂中含有不同程度的生育酚，可对油脂起到不同程度的抗氧化作用。

评价油脂氧化稳定性的方法包括烘箱法(schaaloventest)、活性氧法(activeoxygenmethod)、氧化酸败仪法(rancimat)等。这些方法均是在固定人工加速氧化的条件下，测定油脂的诱导时间来表示其氧化稳定性。rancimat仪在测量油脂诱导期时，省时省力，在许多研究中得到应用。其测定原理如下：将一定温度的热空气通入油样中，加速油脂的氧化，产生挥发性有机酸，被空气带入电导室，并溶解在室内的水中，电离出离子，从而改变水的导电性，计算机连续测量导电室的电导率，当电导率急剧上升时，表明诱导期终点的到来，在此之前的这段时间称为诱导时间。

本发明通过rancimat法测定不同植物油的氧化稳定性，利用¹hnmr指纹图谱分析手段结合偏最小二乘法(pls)来鉴定对茶油氧化稳定性起主要贡献的所有特征峰：如脂肪酸、甘油三酯组成、生育酚等化合物等，并获得它们与油脂氧化稳定性之间的数学关系，从而可以根据贡献峰峰度值大小直接对茶油氧化稳定性进行预测。

技术实现要素：

本发明旨在针对现有技术的不足，提供一种茶油氧化稳定性的预测方法，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种茶油氧化稳定性的预测方法，包括以下步骤：

a：α-生育酚含量的测定:

(1)样品处理，精确称取100mg样品，溶于1ml正己烷，涡旋30s，用注射器吸取1ml，经0.45μm微孔有机滤膜过滤，转移至进样瓶中，在设定分析条件下进行hplc测定，目标物质保留时间与各标准品对照，根据出峰面积定量计算；

(2)α-生育酚标准曲线测定：精确称取10mg的α-生育酚标准品置于10ml容量瓶中，正己烷溶解后定容至刻度，作为贮备液于-20℃保存，将标准溶液的贮备液分别稀释5倍、8倍、10倍、20倍、40倍、80倍、100倍、160倍，用注射器吸取1ml，经0.45μm微孔有机滤膜过滤至进样瓶中，hplc测定；

(3)步骤(1)中设定分析条件为：柱温为35℃，流动相为甲醇/水98:2，v/v，流速为1ml/min，进样量为1μl，分析时长8min，荧光检测波长：λex＝295nm，λem＝325nm；

b:1hnmr测定:

(1)取200μl混合油样与800μlcdcl3混合，涡旋30s，25℃下静置5min,取600μl转移至5mm核磁管中进行核磁实验；

(2)核磁实验中控制质子共振频率为600.38mhz，时域为32k，脉冲为90，时间为11μs，谱宽为13ppm，恢复时间为2s，信号检测时间为2.73s，每次自由感应衰减扫描次数为32，虚拟扫描次数为4；

(3)将测得的自由感应衰减信号导入mestrenova软件进行傅里叶变换，对得到的一维1hnmr谱图进行基线自动校准和相位自动校准，将四甲基硅烷定位为δ＝0.00ppm，将δ＝2.20-2.40ppm标准化到1000，将得到的积分数据输出转为excel文件保存,并对数据进行处理。

所述数据处理方法为：

(1)将获得的数据矩阵导入simca-p+12.0软件,对检测所得的1hnmr数据和α-生育酚及诱导时间进行偏最小二乘法分析以建立预测模型；

(2)步骤(1)预测模型的具体建立方法为：按照建模要求，在所采集的样本中，随机取2/3的样品划分为训练集，用于建立模型；剩余1/3的样品作为预测集，用于检验模型，采用不同的方法对原始数据进行前处理，包括：未经预处理、自标度化、pareto标度化、以及中值标度化，建立pls定量模型，基于留一法交叉验证，通过最小交叉验证均方根误差选取模型的主因子数，pls模型的评价指标主要包括训练集相关系数、训练集均方根误差、以及预测集均方根误差，rmsee和rmsep值越小，r²值越大，说明模型准确性和精确度越高，模型越理想。

本发明的有益效果

(1)不同植物油之间的脂肪酸组成以及微量物质可通过¹hnmr图谱快速反映出来；

(2)¹hnmr以及α-生育酚含量结合pls可用来准确预测茶油氧化稳定性。

附图说明

图一茶油和调和茶油¹hnmr谱；

图二不同预处理方法下主因子数对氧化稳定性pls模型的影响；

图三氧化稳定性pls模型vip值；

图四16个变量(a)和3个变量(b)得到的pls模型诱导时间预测值与真实值的比较散点图。

具体实施方式

实施例1

原料与试剂

茶油(44种)和调和茶油(22种)由江西省南昌市质检局提供；所有油样的生产日期均在2016年1月-2016年5月，储存于4℃冰箱；α-生育酚(纯度为98％)：百灵威科技有限公司；氘代氯仿(cdcl3,99.8％+0.03％tms)：上海阿拉丁公司；正己烷(色谱级)：美国honeywell公司；甲醇(色谱级)：德国merk公司。

仪器与设备：

brukerav600mhz核磁共振波谱仪：瑞士布鲁克公司；5mm核磁共振样品管：美国wilmad公司；892专业型氧化稳定仪：瑞士万通有限公司；agilent1290高效液相色谱仪：美国安捷伦公司；色谱柱：zorbaxeclipseplusc18：美国安捷伦公司；6890n气相色谱仪(配有fid检测器和rev.a.10.02色谱工作站)：美国agilent公司；tu-1900双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；al-104型电子天平：梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；ql-861型涡旋仪：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；anketgl-16g-a型离心机：上海安亭科学仪器厂；milli-qacademic超纯水系统：美国millipore公司；dragonlab移液器：北京大龙实验室仪器有限公司。

实验步骤与过程：

a：α-生育酚含量的测定:

(1)样品处理，精确称取100mg样品，溶于1ml正己烷，涡旋30s，用注射器吸取1ml，经0.45μm微孔有机滤膜过滤，转移至进样瓶中，在设定分析条件下进行hplc测定，目标物质保留时间与各标准品对照，根据出峰面积定量计算；

(2)α-生育酚标准曲线测定：精确称取10mg的α-生育酚标准品置于10ml容量瓶中，正己烷溶解后定容至刻度，作为贮备液于-20℃保存，将标准溶液的贮备液分别稀释5倍、8倍、10倍、20倍、40倍、80倍、100倍、160倍，用注射器吸取1ml，经0.45μm微孔有机滤膜过滤至进样瓶中，hplc测定；

(3)步骤(1)中设定分析条件为：柱温为35℃，流动相为甲醇/水98:2，v/v，流速为1ml/min，进样量为1μl，分析时长8min，荧光检测波长：λex＝295nm，λem＝325nm；

b:¹hnmr测定:

(1)取200μl混合油样与800μlcdcl3混合，涡旋30s，25℃下静置5min,取600μl转移至5mm核磁管中进行核磁实验；

(2)核磁实验中控制质子共振频率为600.38mhz，时域为32k，脉冲为90，时间为11μs，谱宽为13ppm，恢复时间为2s，信号检测时间为2.73s，每次自由感应衰减扫描次数为32，虚拟扫描次数为4；

(3)将测得的自由感应衰减信号导入mestrenova软件进行傅里叶变换，对得到的一维¹hnmr谱图进行基线自动校准和相位自动校准，将四甲基硅烷定位为δ＝0.00ppm，将δ＝2.20-2.40ppm标准化到1000，将得到的积分数据输出转为excel文件保存,并对数据进行处理，共得到16段积分数据具体见表一，茶油与调和茶油¹hnmr指纹图谱见说明书附图一。

表一茶油中主要化合物的¹hnmr信号归属

s:single；d:doublet；t:triplet；m:multiplet；dt:doubleoftriplet；dd:doubletofdoblet.

采用留一法对训练集进行交叉验证，当rmsecv值最小时，说明模型达到精度要求，可以停止因子提取，选取1-10个主因子数，依次计算其rmsecv值，结果如说明书附图二所示四种不同预处理方法下对应的最佳主因子数分别为6、3、4、5，此时相应的rmsecv值最小。

在不同的预处理方法no、uv、par和ctr下，节选取的最佳主因子数，建立pls定量模型，对诱导时间进行预测，结果如表二。

表二不同预处理方法对pls模型的影响

与未经预处理的pls模型相比，原始数据经uv、par和ctr处理之后，最佳主因子数均有所下降，且rmsee和rmsep值均有所减小。其中采用uv和par作为前处理方法得到的pls模型均优于原始模型，但par和ctr预处理方法中的r²均低于原始模型，而采用uv作为前处理方法方法时，r²最高，且rmsee和rmsep值最小，模型最好，

图三为pls模型的vip(variableimportanceintheprojection)值得分图。从中可以筛选出6个vip≥1的变量，包括α-生育酚、亚麻酸(信号13和7)、不饱和脂肪酸(信号1)、信号14以及信号12，其中α-生育酚vip值最大，表明α-生育酚在建模当中起的贡献率较其他脂肪酸要大，大部分变量vip≥0.5，对所建模型起着一定的贡献作用，表明所选的16个变量比较有代表性。基于uv预处理方法，将从vip值得分图中筛选出的6个变量重新作为输入变量，并依次减少变量个数，建立pls模型，结果见表三。

表三不同变量个数对pls模型的影响

随着模型输入变量个数的减少，r²与rmsee值相差不大，但rmsep值先增加后减少，当采用4个输入变量，即α-生育酚、亚麻酸(信号13和7)以及信号14时，rmsep值最小，为0.251831。与原始输入变量相比，当模型输入变量个数为4时，二者的r²、rmsee与rmsep值分别为0.9007、0.319461、0.324358和0.8629、0.361438、0.251831，其中r²与rmsee值相差不大，但后者的rmsep值低于前者且模型变量个数明显少于前者，既达到了简化模型、减少工作量的目的，同时也保证了模型的预测能力，如图4(b)。